Name: maintaining human glioblastoma cellular diversity ex vivo using three-dimensional organoid culture
Uploaded: 2022-08-25T13:10:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture at JoVE.com

نود أن نشكر الدكتور جاستن لاثيا على نصائحه القيمة ودعمه المستمر. كما نشكر كاترينا فايف وليزا والاس ومايا كامهي على دعمهم الفني الممتاز.

<ol>
	<li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma.">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.</a> New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).</li><li>Heffernan, J. M., Sirianni, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+microenvironmental+regulation+of+glioblastoma+stem+cells:+a+biomaterials+perspective.">Modeling microenvironmental regulation of glioblastoma stem cells: a biomaterials perspective.</a> Frontiers in Materials. 5, 7 (2018).</li><li>Zanders, E. D., Svensson, F., Bailey, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapy+for+glioblastoma:+is+it+working.">Therapy for glioblastoma: is it working.</a> Drug Discovery Today. 24 (5), 1193-1201 (2019).</li><li>Hubert, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Three-dimensional+organoid+culture+system+derived+from+human+glioblastomas+recapitulates+the+hypoxic+gradients+and+cancer+stem+cell+heterogeneity+of+tumors+found+in+vivo.">A Three-dimensional organoid culture system derived from human glioblastomas recapitulates the hypoxic gradients and cancer stem cell heterogeneity of tumors found in vivo.</a> Cancer Research. 76 (8), 2465-2477 (2016).</li><li>Lathia, J. D., Heddleston, J. M., Venere, M., Rich, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deadly+teamwork:+neural+cancer+stem+cells+and+the+tumor+microenvironment.">Deadly teamwork: neural cancer stem cells and the tumor microenvironment.</a> Cell Stem Cell. 8 (5), 482-485 (2011).</li><li>Meyer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell-derived+clonal+analysis+of+human+glioblastoma+links+functional+and+genomic+heterogeneity.">Single cell-derived clonal analysis of human glioblastoma links functional and genomic heterogeneity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 851-856 (2015).</li><li>Bao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-like+glioma+cells+promote+tumor+angiogenesis+through+vascular+endothelial+growth+factor.">Stem cell-like glioma cells promote tumor angiogenesis through vascular endothelial growth factor.</a> Cancer Research. 66 (16), 7843-7848 (2006).</li><li>Yu, S. C., Bian, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+cancer+stem+cells+based+on+heterogeneity+of+invasiveness.">Enrichment of cancer stem cells based on heterogeneity of invasiveness.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 5 (1), 66-71 (2009).</li><li>Bao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+stem+cells+promote+radioresistance+by+preferential+activation+of+the+DNA+damage+response.">Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response.</a> Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).</li><li>Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+tumour+stem+cells.">Brain tumour stem cells.</a> Nature Reviews. Cancer. 6 (6), 425-436 (2006).</li><li>Zhu, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+create+a+stem+cell+niche+in+glioblastoma+by+providing+NOTCH+ligands+that+nurture+self-renewal+of+cancer+stem-like+cells.">Endothelial cells create a stem cell niche in glioblastoma by providing NOTCH ligands that nurture self-renewal of cancer stem-like cells.</a> Cancer Research. 71 (18), 6061-6072 (2011).</li><li>Calabrese, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perivascular+niche+for+brain+tumor+stem+cells.">A perivascular niche for brain tumor stem cells.</a> Cancer Cell. 11 (1), 69-82 (2007).</li><li>Charles, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+nitric+oxide+activates+notch+signaling+and+promotes+stem-like+character+in+PDGF-induced+glioma+cells.">Perivascular nitric oxide activates notch signaling and promotes stem-like character in PDGF-induced glioma cells.</a> Cell Stem Cell. 6 (2), 141-152 (2010).</li><li>Seidel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hypoxic+niche+regulates+glioblastoma+stem+cells+through+hypoxia+inducible+factor+2+alpha.">A hypoxic niche regulates glioblastoma stem cells through hypoxia inducible factor 2 alpha.</a> Brain. 133, 983-995 (2010).</li><li>Yan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+cancer+stem+cells+secrete+Gremlin1+to+promote+their+maintenance+within+the+tumor+hierarchy.">Glioma cancer stem cells secrete Gremlin1 to promote their maintenance within the tumor hierarchy.</a> Genes &amp; Development. 28 (10), 1085-1100 (2014).</li><li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+stem+cells+generate+vascular+pericytes+to+support+vessel+function+and+tumor+growth.">Glioblastoma stem cells generate vascular pericytes to support vessel function and tumor growth.</a> Cell. 153 (1), 139-152 (2013).</li><li>Flavahan, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+tumor+initiating+cells+adapt+to+restricted+nutrition+through+preferential+glucose+uptake.">Brain tumor initiating cells adapt to restricted nutrition through preferential glucose uptake.</a> Nature Neuroscience. 16 (10), 1373-1382 (2013).</li><li>Hjelmeland, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidic+stress+promotes+a+glioma+stem+cell+phenotype.">Acidic stress promotes a glioma stem cell phenotype.</a> Cell Death and Differentiation. 18 (5), 829-840 (2011).</li><li>Bar, E. E., Lin, A., Mahairaki, V., Matsui, W., Eberhart, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+increases+the+expression+of+stem-cell+markers+and+promotes+clonogenicity+in+glioblastoma+neurospheres.">Hypoxia increases the expression of stem-cell markers and promotes clonogenicity in glioblastoma neurospheres.</a> The American Journal of Pathology. 177 (3), 1491-1502 (2010).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-inducible+factors+regulate+tumorigenic+capacity+of+glioma+stem+cells.">Hypoxia-inducible factors regulate tumorigenic capacity of glioma stem cells.</a> Cancer Cell. 15 (6), 501-513 (2009).</li><li>Azzarelli, R., Ori, M., Philpott, A., Simons, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+model+of+glioblastoma+by+co-culturing+tumor+stem+cells+with+human+brain+organoids.">Three-dimensional model of glioblastoma by co-culturing tumor stem cells with human brain organoids.</a> Biology Open. 10 (2), 056416 (2021).</li><li>Linkous, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+patient-derived+glioblastoma+with+cerebral+organoids.">Modeling patient-derived glioblastoma with cerebral organoids.</a> Cell Reports. 26 (12), 3203-3211 (2019).</li><li>da Silva, B., Mathew, R. K., Polson, E. S., Williams, J., Wurdak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+glioblastoma+spheroid+infiltration+of+early-stage+cerebral+organoids+models+brain+tumor+invasion.">Spontaneous glioblastoma spheroid infiltration of early-stage cerebral organoids models brain tumor invasion.</a> SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R &amp; D. 23 (8), 862-868 (2018).</li><li>Jacob, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Patient-derived+glioblastoma+organoid+model+and+biobank+recapitulates+inter-+and+intra-tumoral+heterogeneity.">A Patient-derived glioblastoma organoid model and biobank recapitulates inter- and intra-tumoral heterogeneity.</a> Cell. 180 (1), 188-204 (2020).</li><li>Boretto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+from+endometrial+disease+capture+clinical+heterogeneity+and+are+amenable+to+drug+screening.">Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening.</a> Nature Cell Biology. 21 (8), 1041-1051 (2019).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ductal+pancreatic+cancer+modeling+and+drug+screening+using+human+pluripotent+stem+cell-and+patient-derived+tumor+organoids.">Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell-and patient-derived tumor organoids.</a> Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).</li><li>Ledur, P. F., Onzi, G. R., Zong, H., Lenz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+conditions+defining+glioblastoma+cells+behavior:+what+is+the+impact+for+novel+discoveries.">Culture conditions defining glioblastoma cells behavior: what is the impact for novel discoveries.</a> Oncotarget. 8 (40), 69185-69197 (2017).</li><li>Lenin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+drug+screening+pipeline+using+2D+and+3D+patient-derived+in+vitro+models+for+preclinical+analysis+of+therapy+response+in+glioblastoma.">A drug screening pipeline using 2D and 3D patient-derived in vitro models for preclinical analysis of therapy response in glioblastoma.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (9), 4322 (2021).</li><li>Rybin, M. J., Ivan, M. E., Ayad, N. G., Zeier, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+glioblastoma+and+their+role+in+drug+discovery.">Organoid models of glioblastoma and their role in drug discovery.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 15 (4), 605255 (2021).</li><li>Shakya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+lipid+metabolism+marks+glioblastoma+stem+and+non-stem+cells+in+separate+tumor+niches.">Altered lipid metabolism marks glioblastoma stem and non-stem cells in separate tumor niches.</a> Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 101 (2021).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+stem+cells+derived+from+glioblastomas+cultured+in+bFGF+and+EGF+more+closely+mirror+the+phenotype+and+genotype+of+primary+tumors+than+do+serum-cultured+cell+lines.">Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines.</a> Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).</li><li>Bian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+engineered+cerebral+organoids+model+brain+tumor+formation.">Genetically engineered cerebral organoids model brain tumor formation.</a> Nature Methods. 15 (8), 631-639 (2018).</li><li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+cerebral+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).</li><li>Sundar, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+organoid+culture+unveils+resistance+to+clinical+therapies+in+adult+and+pediatric+glioblastoma.">Three-dimensional organoid culture unveils resistance to clinical therapies in adult and pediatric glioblastoma.</a> Translational Oncology. 15 (1), 101251 (2021).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين أي تضارب للكشف عنه.

GBM organoids هي طريقة استزراع مكملة للمجالات التقليدية التي تتضمن عدم تجانس خلوي وبيئي دقيقأكبر 4,22,30. على الرغم من أن الثقافة العضوية تتطلب المزيد من الوقت والموارد الكثيفة الاستخدام ، إلا أنها يمكن أن توفر نظرة ثاقبة قيمة على السلوك داخل الأخلاق وآليات مقاومة الأدوية.
يتم دفع GBM من قبل عدد سكان CSCs 5,31 ، وقد تم تطوير هذه الأساليب للسماح بالنمو المستمر والتجديد الذاتي لسكان CSC هؤلاء. من المعروف أن عامل نمو البشرة (EGF) وعامل نمو الخلايا الليفية (FGF) يعززان صيانة الخلايا الجذعية ونموها ويوفران إشارات مستقبلات التيروزين كيناز النشطة (RTK). يعتمد تكوين مجموعات خلوية غير متجانسة وبيئات دقيقة متميزة للورم داخل أورام GBM على دعم سلوكيات CSC. اختيار lrECM يحاكي بيئة الدماغ الغنية باللامينين ويدعم الخلايا في الثقافة العضوية للتنظيم الذاتي والهجرة عن طريق الغزو. على الرغم من أن بعض المجموعات قد أنشأت ثقافة عضوية دون استخدام وسائط lrECM أو EGF / FGF المخصبة24,28 ، والتي قد توفر طريقة أكثر كفاءة من حيث الوقت لطريقة الاستزراع هذه واختيار أقوى للإشارات السرطانية المنشأ لدفع النمو ، فقد تم اختيار هذه الطرق لتحسين بيئة الخلايا الجذعية المؤيدة لتحديد أفضل عدم التجانس الخلوي للعضويات. تم تصنيع كل من المواد العضوية الدماغية و GBM العضوية باستخدام lrECM في الأدبيات السابقة21،32،33. على الرغم من أننا أنشأنا بيانات تتعلق بمجموعات الأورام الموجودة داخل المواد العضوية والتباين المكاني ، إلا أنه لا يعرف سوى القليل عن المجموعات السكانية غير السرطانية داخل المواد العضوية ومدة بقائها على قيد الحياة من عينات المرضى الأصلية. قد توفر بعض بقع المدينة العالمية للخدمات الإنسانية (مثل CD45) هذه البيانات ، ويمكن أن تكون نقطة بحث مثيرة للاهتمام في المستقبل مع المواد العضوية.
معرفة الاستخدام المقصود للثقافة العضوية مهم لاختيار الطرق المناسبة. إن إنشاء عضويات من العينات الأولية مقابل زراعة عضويات موحدة لتجارب محددة لها إجراءات مختلفة قليلا. إن تقدير كيفية نضج المواد العضوية وملئها بصريا في سقالة lrECM أمر مهم للتمكن من تخصيص الوقت والموارد المناسبة للثقافة العضوية. سوف تتوسع المناطق المتناثرة من الخلايا في المواد العضوية ببطء وتنمو لملء lrECM ، والتي يمكن أن تستغرق في أي مكان من 2-8 أسابيع ، اعتمادا على سلوك العينة. معدل النمو هذا جوهري إلى حد ما لكل عينة. يتم الحفاظ عليها عبر دفعات مختلفة من المواد العضوية وتتفق إلى حد ما مع المعدل النسبي لنمو الكرة. يمكن الحفاظ على المواد العضوية لأكثر من 1 سنة والاحتفاظ بقدرات تكوين الورم على xenograft في الفئران. ومع ذلك ، يوصى بزراعتها لغرض متميز يتمثل في عدم إهدار موارد المختبر (المواد والوقت على حد سواء)4. تم اختبار النمو العضوي في أحجام وتنسيقات آبار متعددة ، ويظهر أن لوحة 10 سم هي الإعداد المثالي للحفاظ على الجدوى المثلى للخلية ، تليها لوحة من 6 آبار مع ثلاثة عضويات لكل بئر34. تستهلك المواد العضوية المزيد من الوسائط مقارنة بنظيراتها من الثقافة ثنائية الأبعاد ، ولا يؤدي استخدام تنسيق بئر أصغر إلى الصيانة المناسبة. على سبيل المثال ، لا يحتوي بئر واحد من لوحة تنسيق 96 بئرا على مساحة كافية أو حجم وسائط بالنسبة لحجم العضو العضوي للحفاظ على نمو العضوي.
كما تنشأ المواد العضوية ، فإن الملاحظة أمر مهم لزيادة النجاح. في البداية ، سوف تستهلك المواد العضوية الوسائط ببطء ، ولكن عندما تصبح أكثر كثافة وأكثر نضجا ، فإنها ستستهلك الوسائط بسرعة أكبر. يمكن أن تساعد إضافة الفينول الأحمر إلى الوسائط في العمل كمؤشر على استهلاك الوسائط. عندما تكون الوسائط صفراء أكثر، قد يدفعنا ذلك إلى تعديل نمط التغذية، سواء كان ذلك لتبادل حجم أكبر من الوسائط، أو زيادة إجمالي كمية الوسائط في اللوحة، أو تقسيم المواد العضوية بين لوحات زراعة الخلايا المتعددة لمواكبة نموها، أو حتى ضبط الجدول الزمني للتجارب. 
من نواح كثيرة ، تعد المواد العضوية طريقة غير فعالة لإجراء أبحاث السرطان. فهي تنطوي على نطاقات زمنية طويلة ، وهي مكلفة وكثيفة الموارد مقارنة بثقافة المجال GBM. ومع ذلك ، بالمقارنة مع xenografts المشتقة من المريض ، وهي طريقة بديلة لإعادة خلق التنوع الخلوي والبيئي الجزئي ، فهي أكثر وضوحا وأقل تكلفة ويمكن التحكم فيها. اختيار أفضل وقت لاستخدام المواد العضوية مهم للباحثين في مجال السرطان. وليس المقصود منها أن تحل محل المجال التقليدي أو الثقافة الملتزمة بها وليس أن تحل محل نماذج xenograft. يمكن للعضويات ، عند تطبيقها على السؤال العلمي الصحيح ، الجمع بين فوائد هذين النظامين وقد تسمح لنا بمراقبة بيولوجيا الخلايا السرطانية التي كانت ستبقى مخفية لولا ذلك. بدأ المجتمع العلمي للتو في فهم فرص التعلم التي توفرها المواد العضوية ، ولكن من الواضح أنها ستكون أداة لا تقدر بثمن في المستقبل لفهم البيولوجيا المعقدة ل GBM.

الورم الأرومي الدبقي (GBM) هو ورم الدماغ الأولي الأكثر شيوعا مع تشخيص قاتم لمدة 15 شهرا تقريبا من التشخيص1. العلاجات التي تكون فعالة في الدراسات قبل السريرية يمكن أن تكون في كثير من الأحيان ضعيفة الفعالية في المرضى 2,3. تعزى الاستجابة السريرية الضعيفة إلى العديد من العوامل ، بما في ذلك عدم تجانس البيئة الدقيقة ل GBM والتفاعلات المعقدة داخل الرحم. قد يكون من الصعب إعادة إنشائها في بيئة المختبر باستخدام طرق الالتصاق التقليدية أو زراعة المجال4. وجود مجموعة فرعية من الخلايا الجذعية السرطانية ذاتية التجديد (CSCs) داخل GBM قد يساهم أيضا في هذا التعقيد 5,6. تعتبر CSCs حاسمة لانتشار الورم والحفاظ على نمو الورم من خلال تعزيز تولد الأوعية الدموية النشط ، وغزو السرطان ، ومقاومة العلاجات بما في ذلك الإشعاع7،8،9. لا يتم توزيع CSCs بشكل موحد في جميع أنحاء الأورام ولكن يتم إثراؤها داخل بيئات دقيقة محددة ، بما في ذلك المناطق المحيطة بالأوعية الدموية والمناطق المعجانة ، والتي توفر كل منها تنظيما جزيئيا متميزا لحالاتها الخلوية10،11،12،13،14. CSCs ليست متلقين سلبيين لإشارات البيئة الدقيقة ولكن بدلا من ذلك تمتلك القدرة على إعادة تشكيل بيئاتها الدقيقةالخاصة بها 7،15،16. يمكن للبيئة الدقيقة ل CSC تعزيز الحفاظ على حالة الخلايا الجذعية استجابة لضغوط مثل ندرة المغذيات ودرجة الحموضة ونقص الأكسجة17،18،19،20 ، مما يشير إلى أهمية هذه الظروف في نظام نموذجي. لذلك فإن تلخيص البيئة الدقيقة الخلوية المتنوعة داخل الأورام أمر بالغ الأهمية لفهم المقاومة العلاجية وتحديد العلاجات الجديدة.
زادت شعبية الثقافة ثلاثية الأبعاد في السنوات الأخيرة21,22. تم استخدام المواد العضوية في أنواع أخرى من السرطان ، والهدف الأساسي من الحفاظ على الخلايا كعضويات هو السماح بنمو مجموعات الخلايا غير المتجانسة (التي قد يكون الكثير منها عادة متفوقا في ثقافة المجال الأكثر تجانسا) والتنوع المكاني ، الذي ينظر إليه على أنه بيئات دقيقة إقليمية للورم ذات خصوصية وراثية4،23،24،25،26 . هناك العديد من الطرق للزراعة ثلاثية الأبعاد للخلايا السرطانية ، والتي لكل منها مزايا وعيوب27،28،29. لا يقصد من الثقافة العضوية أن تكون بديلا عن الثقافة التقليدية الملتزمة أو الكروية. من الأفضل استخدامه كتقنية مكملة للطرق ثنائية الأبعاد عندما تكون هناك أسئلة محددة يكون فيها التفاعل بين البيئة الدقيقة للخلية واستجابات الخلايا السرطانية أمرا بالغ الأهمية.
توضح هذه المقالة طرقا موثوقة وقابلة للتكرار لإنشاء عضويات GBM من عينات المرضى الأولية أو الثقافات المشتقة من المريض. نحن نعالج هدفين مختلفين للثقافة العضوية ثلاثية الأبعاد: (1) إنشاء عضويات من أنسجة المريض الأولية ، مع أقصى قدر من إمكانات التطعيم بغض النظر عن التوحيد ، أو (2) زراعة عضويات موحدة للاستخدام التجريبي الكمي. عند إنشاء عينة أولية كمواد عضوية ، ليس من الضروري تصفية الخلايا المفردة أو عد الخلايا ، لأن الحفاظ على الحد الأقصى لأعداد الخلايا وأنواعها لإنشاء الثقافة الأولية هو أولوية. ومع ذلك ، عند زراعة المواد العضوية للتجارب المقارنة ، هناك حاجة إلى الترشيح أحادي الخلية وعد الخلايا لضمان أن تكون المواد العضوية المكررة قابلة للمقارنة من أجل الاتساق التجريبي. يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل كيفية إنشاء مزارع عضوية وإنشاء عضويات موحدة ، بالإضافة إلى طرق محسنة لتضمين المواد العضوية والحفاظ عليها وتجارب زراعة الخلايا القياسية ، بما في ذلك الكيمياء النسيجية المناعية ، والتألق المناعي ، وتقييم الجدوى الكلية للخلية في المواد العضوية GBM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3,3-Diaminobenzidine (DAB) tablets</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>08980681</td>
			<td>3,3-Diaminobenzidine (DAB) tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR plates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>96-well PCR plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>SCR005</td>
			<td>Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td>Antibiotic-antimycotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement minus vitamin A</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12587001</td>
			<td>B-27 supplement minus vitamin A (50x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelCode Blue Stain Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>24590</td>
			<td>Bluing reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer (70 &#181;m)</td>
			<td>CellTreat Scientific</td>
			<td>229483</td>
			<td>Cell strainer (70 &#181;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo 3D</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9681</td>
			<td>Luminescent cell viability assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clarifier 2</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>7301</td>
			<td>Nuclear hematoxylin clarifying reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear-Rite 3</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>6901</td>
			<td>xylene substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia Gill 2 Hematoxylin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>72504</td>
			<td>Hematoxylin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine in 0.85% NaCl</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Glutamine in 0.85% NaCl (200 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>354234</td>
			<td>Laminin-enriched extracellular matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini PAP pen</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>008877</td>
			<td>Hydrophobic barrier pen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>22-050-102</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal media minus phenol red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12349015</td>
			<td>Neurobasal media minus phenol red (500 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum (NDS)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td>Normal donkey serum (NDS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 4% in PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td>Paraformaldehyde 4% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0290</td>
			<td>Phenol red (0.5%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P10144</td>
			<td>Liquid curing mountant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human EGF protein</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>236-EG-01M</td>
			<td>Recombinant human EGF protein (250 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human FGF basic</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>4144-TC-01</td>
			<td>Recombinant human FGF basic (250 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SignalStain Antibody Diluent</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>8112</td>
			<td>Antibody diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SignalStain Boost IHC Detection Reagent</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>8114</td>
			<td>Immunohistochemistry detection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SignalStain Citrate Unmasking Solution</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>14746</td>
			<td>Citrate unmasking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge razor blade</td>
			<td>Uline</td>
			<td>H-595B</td>
			<td>Single edge razor blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td>Sodium pyruvate (100 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Cryomolds</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-916</td>
			<td>Disposable cryomolds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-930</td>
			<td>Optimal cutting temperature compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td>Cell impermeant stain (0.4%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>X3P-1GAL</td>
			<td>Xylene</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

maintaining human glioblastoma cellular diversity ex vivo using three-dimensional organoid culture

الورم الأرومي الدبقي (GBM) هو سرطان الدماغ الخبيث الأولي الأكثر شيوعا مع تشخيص ضعيف للغاية. يمكن للتنوع الخلوي والجزيئي داخل الرحم ، بالإضافة إلى التفاعلات المعقدة بين البيئات الدقيقة للورم ، أن يجعل العثور على علاجات فعالة تحديا. ويمكن للطرق التقليدية للاستزراع الالتصاق أو المجال أن تخفي مثل هذه التعقيدات، في حين أن الاستزراع العضوي ثلاثي الأبعاد يمكن أن يلخص التدرجات البيئية الدقيقة الإقليمية. المواد العضوية هي طريقة لثقافة GBM ثلاثية الأبعاد تحاكي بشكل أفضل بنية ورم المريض ، وتحتوي على مجموعات خلايا متنوعة ظاهريا ، ويمكن استخدامها في التجارب متوسطة الإنتاجية. على الرغم من أن الثقافة العضوية ثلاثية الأبعاد أكثر شاقة واستهلاكا للوقت مقارنة بالثقافة التقليدية ، إلا أنها توفر فوائد فريدة ويمكن أن تعمل على سد الفجوة بين الأنظمة الحالية في المختبر وفي الجسم الحي . أثبتت المواد العضوية نفسها كأدوات لا تقدر بثمن في ترسانة علماء الأحياء السرطانية لفهم سلوك الورم وآليات المقاومة بشكل أفضل ، وتستمر تطبيقاتها في النمو. هنا ، يتم توفير تفاصيل حول طرق توليد وصيانة المواد العضوية GBM. كما يتم وصف تعليمات حول كيفية إجراء تضمين وتقسيم العينات العضوية باستخدام كل من تقنيات تضمين المجمدة والبارافين ، بالإضافة إلى توصيات للكيمياء النسيجية المناعية وبروتوكولات التألق المناعي على الأقسام العضوية ، وقياس الجدوى الكلية للخلايا العضوية.

يوضح الشكل 1 النمو العضوي المبكر الذي شوهد عبر المجهر الضوئي عند تكبير 10x. يوضح الشكل 1A هجرة وغزو الخلايا المفردة من خلال lrECM في العرض الأوسط. ستستمر الخلايا في التوسع و "استعمار" lrECM ، وستظهر أكثر كثافة وغير شفافة في النهاية عن طريق الفحص البصري. يوضح الشكل 1B العديد من المواد العضوية الناضجة (في 7 أسابيع) دون تكبير ، بالنسبة لحجم عشرة سنتات.
يوضح الشكل 2 تلطيخ المناعة النسيجية الكيميائية للعضويات GBM للفوسفو هيستون H3 ، وهو علامة على الانتشار النشط. وينظر إلى معظم الخلايا التكاثرية للغاية في محيط العضوية مقارنة مع النواة العضوية. سيكون للتلطيخ الإيجابي مظهر بني / نحاسي.
يصف الشكل 3 عملية تجانس وقياس إجمالي عدد الخلايا في عضويات GBM باستخدام فحص جدوى الخلايا المضيئة الخاصة ب 3D. نظرا للعدد الكبير من الخلايا الموجودة في المواد العضوية GBM ، يتم تجانس البنية العضوية الأكبر في البداية عن طريق التثليث في كاشف المقايسة المضيئة. ثم يتم تحميل أجزاء من إجمالي التحلل العضوي في آبار فردية وتخفيفها بكاشف فحص مضيء إضافي قبل الحضانة والقراءة على قارئ ألواح مناسب متعدد الآبار.
يمثل الشكل 4 بيانات التحكم في DMSO (المركبات الشائعة) للعضويات. تظهر البيانات المرسومة الاتساق داخل العضوية وبين العضويات. عادة ما يتم تطبيع بيانات الجدوى المضيئة إلى عناصر تحكم لكل عينة عند إنشاء بيانات تجريبية.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63745/63745fig01.jpg"> الشكل 1: عرض من خلال المجهر الضوئي (10x). (أ) النمو العضوي المبكر الذي يوضح هجرة / غزو خلايا GBM في جميع أنحاء المصفوفة خارج الخلية الغنية باللامينين. (ب) المواد العضوية الناضجة بالنسبة لحجم السنت الواحد. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63745/63745fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63745/63745fig02.jpg"> الشكل 2: الكيمياء النسيجية المناعية للعضويات GBM. (A ، B) تظهر الكائنات العضوية GBM الخلايا الملطخة بالفوسفو هيستون H3 للانتشار النشط. قضبان المقياس هي 600 ميكرومتر و 300 ميكرومتر ل A و B ، على التوالي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63745/63745fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63745/63745fig03.jpg"> الشكل 3: بروتوكول صلاحية الخلايا المضيئة للعضويات . (أ) نقل المواد العضوية الفردية إلى أنابيب الطرد المركزي الصغيرة وإزالة الوسائط الزائدة. (ب) إضافة 500 ميكرولتر من 1: 1 PBS وخليط فحص صلاحية الخلايا المضيئة إلى كل أنبوب وماصة بقوة لتحطيم العضوي. (ج) إضافة 25 ميكرولتر من هذا الخليط العضوي و 75 ميكرولتر من نفس 1: 1 PBS وخليط فحص صلاحية الخلايا المضيئة إلى كل بئر من صفيحة 96 بئرا. (د) ضعه على شاكر لمدة 2 دقيقة ، يليه حضانة لمدة 20 دقيقة في RT ، ثم اقرأ التلألؤ على قارئ اللوحات. الرقم المصنوع باستخدام BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63745/63745fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63745/63745fig04.jpg"> الشكل 4: صلاحية الخلية. بيانات جدوى الخلية للعضويات في 0.1٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) لستة نسخ طبق الأصل تقني من أربعة عضويات لأربع عينات من المرضى. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63745/63745fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>مكون</td>
			<td>كم</td>
		</tr><tr><td>الوسط العصبي القاعدي ناقص الفينول الأحمر</td>
			<td>500 مل</td>
		</tr><tr><td>B-27 الملحق ناقص فيتامين (أ) (50x)</td>
			<td>10 مل</td>
		</tr><tr><td>مضاد حيوي مضاد للفطريات (100x)</td>
			<td>5 مل</td>
		</tr><tr><td>بيروفات الصوديوم (100 ملليمتر)</td>
			<td>5 مل</td>
		</tr><tr><td>الجلوتامين في 0.85٪ كلوريد الصوديوم (200 ملليمتر)</td>
			<td>5 مل</td>
		</tr><tr><td>FGF البشري المؤتلف الأساسي (250 ميكروغرام / مل)</td>
			<td>20 ميكرولتر</td>
		</tr><tr><td>بروتين EFG البشري المؤتلف (250 ميكروغرام / مل)</td>
			<td>20 ميكرولتر</td>
		</tr><tr><td>أحمر الفينول</td>
			<td>500 ميكرولتر</td>
		</tr></tbody></table>الجدول 1: صياغة الوسط العصبي القاعدي الكامل (NBMc)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>الكاشف</td>
			<td>الوقت</td>
		</tr><tr><td>50٪ إيثانول</td>
			<td>3 دقائق</td>
		</tr><tr><td>75٪ إيثانول</td>
			<td>3 دقائق</td>
		</tr><tr><td>95٪ إيثانول</td>
			<td>3 دقائق</td>
		</tr><tr><td>95٪ إيثانول</td>
			<td>4 دقائق</td>
		</tr><tr><td>100٪ إيثانول</td>
			<td>2 دقيقة</td>
		</tr><tr><td>100٪ إيثانول</td>
			<td>3 دقائق</td>
		</tr><tr><td>100٪ إيثانول</td>
			<td>4 دقائق</td>
		</tr><tr><td>بديل الزيلين</td>
			<td>2 دقيقة</td>
		</tr><tr><td>بديل الزيلين</td>
			<td>3 دقائق</td>
		</tr><tr><td>بديل الزيلين</td>
			<td>4 دقائق</td>
		</tr><tr><td>شمع البارافين</td>
			<td>15 دقيقة</td>
		</tr><tr><td>شمع البارافين</td>
			<td>15 دقيقة</td>
		</tr></tbody></table>الجدول 2: جدول تجهيز المواد العضوية الصغيرة (قطرها أقل من 3 مم)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>الكاشف</td>
			<td>الوقت</td>
		</tr><tr><td>50٪ إيثانول</td>
			<td>6 دقائق</td>
		</tr><tr><td>75٪ إيثانول</td>
			<td>6 دقائق</td>
		</tr><tr><td>95٪ إيثانول</td>
			<td>5 دقائق</td>
		</tr><tr><td>95٪ إيثانول</td>
			<td>8 دقائق</td>
		</tr><tr><td>100٪ إيثانول</td>
			<td>5 دقائق</td>
		</tr><tr><td>100٪ إيثانول</td>
			<td>5 دقائق</td>
		</tr><tr><td>100٪ إيثانول</td>
			<td>8 دقائق</td>
		</tr><tr><td>بديل الزيلين</td>
			<td>5 دقائق</td>
		</tr><tr><td>بديل الزيلين</td>
			<td>5 دقائق</td>
		</tr><tr><td>بديل الزيلين</td>
			<td>8 دقائق</td>
		</tr><tr><td>شمع البارافين</td>
			<td>30 دقيقة</td>
		</tr><tr><td>شمع البارافين</td>
			<td>30 دقيقة</td>
		</tr></tbody></table>الجدول 3: جدول معالجة المواد العضوية الكبيرة (التي يزيد قطرها عن 3 مم)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>الكاشف</td>
			<td>الوقت</td>
		</tr><tr><td>هيماتوكسيلين</td>
			<td>2 دقيقة</td>
		</tr><tr><td>تشغيل diH2O</td>
			<td>2 دقيقة</td>
		</tr><tr><td>كاشف توضيح الهيماتوكسيلين النووي</td>
			<td>1 دقيقة</td>
		</tr><tr><td>تشغيل diH2O</td>
			<td>1 دقيقة</td>
		</tr><tr><td>كاشف بلوينغ</td>
			<td>1 دقيقة</td>
		</tr><tr><td>تشغيل diH2O</td>
			<td>2 دقيقة</td>
		</tr><tr><td>70٪ إيثانول</td>
			<td>1 دقيقة</td>
		</tr><tr><td>100٪ إيثانول</td>
			<td>1 دقيقة</td>
		</tr><tr><td>100٪ إيثانول</td>
			<td>1 دقيقة</td>
		</tr><tr><td>بديل الزيلين</td>
			<td>2 دقيقة</td>
		</tr><tr><td>بديل الزيلين</td>
			<td>2 دقيقة</td>
		</tr></tbody></table>الجدول 4: الهيماتوكسيلين المضاد للوصمة

Watch this Scientific Journal Video about Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture at JoVE.com

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

هنا ، نصف طريقة لتوليد الورم الأرومي الدبقي (GBM) العضوي من عينات المرضى الأولية أو مزارع الخلايا المشتقة من المريض والحفاظ عليها حتى النضج. تحتوي هذه المواد العضوية GBM على مجموعات خلايا متنوعة ظاهريا وتعيد إنشاء بيئات دقيقة للورم خارج الجسم الحي.

الحفاظ على التنوع الخلوي للورم الأرومي الدبقي البشري خارج الجسم الحي باستخدام ثقافة العضوية ثلاثية الأبعاد

Glioblastoma (GBM) is the most commonly occurring primary malignant brain cancer with an extremely poor prognosis. Intra-tumoral cellular and molecular ...

يعد العثور على علاجات للورم الأرومي الدبقي أمرا صعبا بسبب التنوع الخلوي الموجود في الأورام والتفاعلات بين البيئات الدقيقة المتنوعة. يمكن أن تساعد المواد العضوية في إعادة إنشاء بعض هذا التنوع المكاني ، ويمكننا استخدام هذا لفهم بيولوجيا الأورام بشكل أفضل. في حين أن طرق زراعة الخلايا التقليدية تميل إلى إنتاج مجموعات متجانسة من الخلايا السرطانية ، يمكن للعضويات أن تحاكي بشكل أفضل التنوع الجزيئي والخلوي للورم الأرومي الدبقي ونموذج أفضل للتفاعلات داخل الفخذ.يمكن استخدام المواد العضوية للتحقيق في فعالية الدواء وآليات المقاومة. قد تظهر مقاومة العلاجات السريرية فقط في المواد العضوية وليس في ثقافة المجال التقليدية ، مما يعكس الواقع السريري لهذا المرض. يمكن أن تساعد المواد العضوية في إظهار الآثار الإقليمية للعلاجات الكيميائية.يمكن استخدامها لاكتشاف علاجات جديدة متخصصة ، ويمكن أن تعمل أيضا كأداة تنبؤية للطب الشخصي في المستقبل. بعض المواد المستخدمة لإنشاء المواد العضوية حساسة لدرجة الحرارة ، وإهمال الحفاظ على هذه المواد في درجة حرارتها المناسبة يمكن أن يؤدي إلى صعوبات في إنشاء أو الحفاظ على المواد العضوية. ابدأ في تحضير القوالب العضوية تحت غطاء محرك السيارة عن طريق إزالة ورقة الشمع من ورقة البارافيلم ووضعها بين اثنين من تفاعل البوليميراز المتسلسل المعقم 96 بئرا أو ألواح PCR.تأكد من أن الجزء الداخلي من البارافيلم نظيف. ضع ضغطا متساويا على اللوحة العلوية لتشكيل دمامل صغيرة بعمق مليمترين في البارافيلم دون إنشاء ثقوب. افصل اللوحات.سوف يلتصق البارافيلم المدمل باللوحة العلوية. ثم ضع الطبق العلوي على الثلج الجاف لمدة 30 ثانية. استخدم ملقط معقم لسحب البارافيلم من اللوحة العلوية بحركة سريعة.البارافيلم المجمد أسهل في الإزالة. ضع قالب البارافيلم المكتمل في طبق زراعة خلايا مغطى ومعقم بطول 10 سم. لإعداد تعليق أحادي الخلية من الورم الأرومي الدبقي أو ثقافة الالتصاق GBM ، قم بإزالة الوسائط المستخدمة من اللوحة.ثم أضف ملليلترين من محلول انفصال الخلايا في درجة حرارة الغرفة إلى اللوحة ، واحتضن اللوحة عند 37 درجة لمدة ثلاث دقائق. بعد التأكد من انفصال الخلية عن الصفيحة تحت المجهر ، أضف ثمانية ملليلترات من Neurobasal Medium complete ، أو NBMc medium ، لتحييد محلول انفصال الخلية. قم بتصفية التعليق من خلال مصفاة خلية واحدة سعة 70 ميكرون.قم بتدوير الخلايا بسرعة 120 مرة G لمدة خمس دقائق. ثم قم بإزالة supernatant وإعادة تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من NBMc. عد الخلايا من تعليق خلية واحدة باستخدام بقعة خلية غير مقصودة.لصنع المواد العضوية من نظام تعليق أحادي الخلية، أضف كمية مناسبة من المصفوفة خارج الخلية الغنية باللامينين، أو lrECM، إلى أنبوب طرد مركزي صغير في دلو ثلج أو كتلة باردة. تحضير خليط الخلايا التي تحتوي على 20،000 خلية لكل عضوي. امزج خليط تعليق الخلايا lrECM جيدا لتجنب ترسب الخلايا ، مما يؤدي إلى تكوين عضوي غير منتظم.بعد ذلك ، قم بماصة 20 ميكرولتر من الخليط بعناية على قالب بارافيلم لتشكيل قطرة تشبه اللؤلؤ. تأكد من تبريد طرف الماصة كل اثنين إلى ثلاثة عضويات لمنع بلمرة lrECM. بمجرد أن يتم ماصة العدد المطلوب من المواد العضوية على قالب البارافيلم في صفيحة استزراع طولها 10 سنتيمترات ، احتضن المواد العضوية عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة إلى ساعتين في حاضنة زراعة الخلايا.بعد تصلب المواد العضوية ، اطرد المواد العضوية بلطف من قالب البارافيلم باستخدام وسيط NBMc باستخدام طرف P1000 وجمعها في صفيحة استزراع جديدة بطول 10 سنتيمترات تحتوي على 20 ملليلتر من NBMc. ضع لوحة الثقافة في حاضنة دون أن تهتز لمدة أربعة أيام. بعد أربعة أيام ، استبدل الوسائط الموجودة في اللوحة.للقيام بذلك ، ضع قطعة من الورق الداكن أسفل لوحة زراعة الخلايا. قم بإمالة اللوحة وانتظر لمدة 20 ثانية. عندما تستقر المواد العضوية تماما في الجزء السفلي من الطبق ، قم بإزالة الوسائط ببطء باستخدام ماصة زجاجية كبيرة الفتح.بعد إضافة وسائط جديدة ، ضع اللوحة في الحاضنة على شاكر مداري عند 80 دورة في الدقيقة ، وتبادل الوسائط كل يومين إلى ثلاثة أيام بعد ذلك. لوحظ نمو العضوية باستخدام المجهر الضوئي. في وجهة نظر المركز ، أظهر النمو العضوي المبكر الهجرة وغزو الخلية الواحدة من خلال lrECM.كانت المواد العضوية الناضجة في سبعة أسابيع بالنسبة لحجم عشرة سنتات. كشف التلطيخ الكيميائي المناعي للعضويات GBM مع فوسفو هيستون H3 عن خلايا تكاثرية عالية مع مظهر بني أو أرجواني في محيط العضوية مقارنة بالنواة. أظهرت بيانات صلاحية الخلية للعضويات في 0.1٪ DMSO الاتساق داخل العضوية وبين العضويات.انتبه إلى الكتلة الحيوية العضوية وتحمض الوسائط. إذا كانت المواد العضوية تمر عبر الوسائط بسرعة كبيرة ، فتأكد من تبادل الوسائط بشكل متكرر أو تقسيم المواد العضوية بين لوحات إضافية. يمكن استخدام المواد العضوية الناضجة للتجارب مع العلاجات أو تضمينها وتقسيمها للاستخدام مع الكيمياء النسيجية المناعية أو التألق المناعي.يمكن استخدام المواد العضوية المنفصلة لتحليل FACS. تم استخدام هذه المواد العضوية مؤخرا في الفحص الوظيفي ثلاثي الأبعاد لاكتشاف الأهداف الأساسية في منافذ الخلايا الجذعية السرطانية المتميزة مكانيا. نحن نستخدم أيضا هذه النماذج لتحديد أولويات الأدوية والعلاجات المختلفة قبل الاختبار في الجسم الحي.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

السابقين فيفو تصوير لمفاوية T CD8 المقيم في ورم الرئة البشرية شرائح باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل]

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

الأسفار التصوير المقطعي الجزيئية للتصوير في فيفو لتكثيفها جليوبلاستوما

Tumorigenicity is the capability of cancer cells to form a tumor mass. A widely used approach to determine if the cells are tumorigenic is by injecting ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

رصد المورفولوجية والفسيولوجية طولية من الماغنيسيوم الورم ثلاثي الأبعاد باستخدام التصوير المقطعي التماسك البصري

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

بالبالكامل الإنسان القائم علي الورم مصفوفة في ثلاثه الابعاد كروي الغزو الفحص

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

تقييم قدره التمايز من الخلايا الظهاريه البروستاتا الماوس باستخدام الثقافة Organoid

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

الثقافة المشتركة للخلايا الشبيهة بالورم الأرومي الدبقي على الخلايا العصبية المنقوشة لدراسة الهجرة والتفاعلات الخلوية

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

نموذج محاكاة حيوية ثلاثي الأبعاد في المختبر للورم الأرومي العصبي باستخدام السقالات القائمة على الكولاجين

Neuroblastoma is the most common extracranial solid tumor in children, accounting for 15% of overall pediatric cancer deaths. The native tumor tissue is a ...

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

السابقين فيفو النموذج العضوي لحذف الجينات بوساطة الفيروس الغدي-Cre في خلايا الفأر البولية

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites ...

Phospholipid Mediator Induced Transformation in Three-Dimensional Cultures

وسيط الفوسفوليبيد الناجم عن التحول في الثقافات ثلاثية الأبعاد

Several models have been developed to study cancer, such as rodent models and established cell lines. Valuable insights into carcinogenesis have been ...

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

ثقافة ثلاثية الأبعاد لخبايا القولون الفئران لدراسة وظيفة الخلايا الجذعية المعوية خارج الجسم الحي

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of ...