Name: maintaining human glioblastoma cellular diversity ex vivo using three-dimensional organoid culture
Uploaded: 2022-08-25T13:10:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture at JoVE.com

We willen Dr. Justin Lathia bedanken voor zijn onschatbare advies en voortdurende steun. We bedanken ook Katrina Fife, Lisa Wallace en Maya Camhi voor hun uitstekende technische ondersteuning.

<ol>
	<li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma.">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.</a> New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).</li><li>Heffernan, J. M., Sirianni, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+microenvironmental+regulation+of+glioblastoma+stem+cells:+a+biomaterials+perspective.">Modeling microenvironmental regulation of glioblastoma stem cells: a biomaterials perspective.</a> Frontiers in Materials. 5, 7 (2018).</li><li>Zanders, E. D., Svensson, F., Bailey, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapy+for+glioblastoma:+is+it+working.">Therapy for glioblastoma: is it working.</a> Drug Discovery Today. 24 (5), 1193-1201 (2019).</li><li>Hubert, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Three-dimensional+organoid+culture+system+derived+from+human+glioblastomas+recapitulates+the+hypoxic+gradients+and+cancer+stem+cell+heterogeneity+of+tumors+found+in+vivo.">A Three-dimensional organoid culture system derived from human glioblastomas recapitulates the hypoxic gradients and cancer stem cell heterogeneity of tumors found in vivo.</a> Cancer Research. 76 (8), 2465-2477 (2016).</li><li>Lathia, J. D., Heddleston, J. M., Venere, M., Rich, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deadly+teamwork:+neural+cancer+stem+cells+and+the+tumor+microenvironment.">Deadly teamwork: neural cancer stem cells and the tumor microenvironment.</a> Cell Stem Cell. 8 (5), 482-485 (2011).</li><li>Meyer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell-derived+clonal+analysis+of+human+glioblastoma+links+functional+and+genomic+heterogeneity.">Single cell-derived clonal analysis of human glioblastoma links functional and genomic heterogeneity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 851-856 (2015).</li><li>Bao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-like+glioma+cells+promote+tumor+angiogenesis+through+vascular+endothelial+growth+factor.">Stem cell-like glioma cells promote tumor angiogenesis through vascular endothelial growth factor.</a> Cancer Research. 66 (16), 7843-7848 (2006).</li><li>Yu, S. C., Bian, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+cancer+stem+cells+based+on+heterogeneity+of+invasiveness.">Enrichment of cancer stem cells based on heterogeneity of invasiveness.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 5 (1), 66-71 (2009).</li><li>Bao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+stem+cells+promote+radioresistance+by+preferential+activation+of+the+DNA+damage+response.">Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response.</a> Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).</li><li>Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+tumour+stem+cells.">Brain tumour stem cells.</a> Nature Reviews. Cancer. 6 (6), 425-436 (2006).</li><li>Zhu, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+create+a+stem+cell+niche+in+glioblastoma+by+providing+NOTCH+ligands+that+nurture+self-renewal+of+cancer+stem-like+cells.">Endothelial cells create a stem cell niche in glioblastoma by providing NOTCH ligands that nurture self-renewal of cancer stem-like cells.</a> Cancer Research. 71 (18), 6061-6072 (2011).</li><li>Calabrese, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perivascular+niche+for+brain+tumor+stem+cells.">A perivascular niche for brain tumor stem cells.</a> Cancer Cell. 11 (1), 69-82 (2007).</li><li>Charles, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+nitric+oxide+activates+notch+signaling+and+promotes+stem-like+character+in+PDGF-induced+glioma+cells.">Perivascular nitric oxide activates notch signaling and promotes stem-like character in PDGF-induced glioma cells.</a> Cell Stem Cell. 6 (2), 141-152 (2010).</li><li>Seidel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hypoxic+niche+regulates+glioblastoma+stem+cells+through+hypoxia+inducible+factor+2+alpha.">A hypoxic niche regulates glioblastoma stem cells through hypoxia inducible factor 2 alpha.</a> Brain. 133, 983-995 (2010).</li><li>Yan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+cancer+stem+cells+secrete+Gremlin1+to+promote+their+maintenance+within+the+tumor+hierarchy.">Glioma cancer stem cells secrete Gremlin1 to promote their maintenance within the tumor hierarchy.</a> Genes &amp; Development. 28 (10), 1085-1100 (2014).</li><li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+stem+cells+generate+vascular+pericytes+to+support+vessel+function+and+tumor+growth.">Glioblastoma stem cells generate vascular pericytes to support vessel function and tumor growth.</a> Cell. 153 (1), 139-152 (2013).</li><li>Flavahan, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+tumor+initiating+cells+adapt+to+restricted+nutrition+through+preferential+glucose+uptake.">Brain tumor initiating cells adapt to restricted nutrition through preferential glucose uptake.</a> Nature Neuroscience. 16 (10), 1373-1382 (2013).</li><li>Hjelmeland, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidic+stress+promotes+a+glioma+stem+cell+phenotype.">Acidic stress promotes a glioma stem cell phenotype.</a> Cell Death and Differentiation. 18 (5), 829-840 (2011).</li><li>Bar, E. E., Lin, A., Mahairaki, V., Matsui, W., Eberhart, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+increases+the+expression+of+stem-cell+markers+and+promotes+clonogenicity+in+glioblastoma+neurospheres.">Hypoxia increases the expression of stem-cell markers and promotes clonogenicity in glioblastoma neurospheres.</a> The American Journal of Pathology. 177 (3), 1491-1502 (2010).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-inducible+factors+regulate+tumorigenic+capacity+of+glioma+stem+cells.">Hypoxia-inducible factors regulate tumorigenic capacity of glioma stem cells.</a> Cancer Cell. 15 (6), 501-513 (2009).</li><li>Azzarelli, R., Ori, M., Philpott, A., Simons, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+model+of+glioblastoma+by+co-culturing+tumor+stem+cells+with+human+brain+organoids.">Three-dimensional model of glioblastoma by co-culturing tumor stem cells with human brain organoids.</a> Biology Open. 10 (2), 056416 (2021).</li><li>Linkous, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+patient-derived+glioblastoma+with+cerebral+organoids.">Modeling patient-derived glioblastoma with cerebral organoids.</a> Cell Reports. 26 (12), 3203-3211 (2019).</li><li>da Silva, B., Mathew, R. K., Polson, E. S., Williams, J., Wurdak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+glioblastoma+spheroid+infiltration+of+early-stage+cerebral+organoids+models+brain+tumor+invasion.">Spontaneous glioblastoma spheroid infiltration of early-stage cerebral organoids models brain tumor invasion.</a> SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R &amp; D. 23 (8), 862-868 (2018).</li><li>Jacob, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Patient-derived+glioblastoma+organoid+model+and+biobank+recapitulates+inter-+and+intra-tumoral+heterogeneity.">A Patient-derived glioblastoma organoid model and biobank recapitulates inter- and intra-tumoral heterogeneity.</a> Cell. 180 (1), 188-204 (2020).</li><li>Boretto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+from+endometrial+disease+capture+clinical+heterogeneity+and+are+amenable+to+drug+screening.">Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening.</a> Nature Cell Biology. 21 (8), 1041-1051 (2019).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ductal+pancreatic+cancer+modeling+and+drug+screening+using+human+pluripotent+stem+cell-and+patient-derived+tumor+organoids.">Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell-and patient-derived tumor organoids.</a> Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).</li><li>Ledur, P. F., Onzi, G. R., Zong, H., Lenz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+conditions+defining+glioblastoma+cells+behavior:+what+is+the+impact+for+novel+discoveries.">Culture conditions defining glioblastoma cells behavior: what is the impact for novel discoveries.</a> Oncotarget. 8 (40), 69185-69197 (2017).</li><li>Lenin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+drug+screening+pipeline+using+2D+and+3D+patient-derived+in+vitro+models+for+preclinical+analysis+of+therapy+response+in+glioblastoma.">A drug screening pipeline using 2D and 3D patient-derived in vitro models for preclinical analysis of therapy response in glioblastoma.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (9), 4322 (2021).</li><li>Rybin, M. J., Ivan, M. E., Ayad, N. G., Zeier, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+glioblastoma+and+their+role+in+drug+discovery.">Organoid models of glioblastoma and their role in drug discovery.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 15 (4), 605255 (2021).</li><li>Shakya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+lipid+metabolism+marks+glioblastoma+stem+and+non-stem+cells+in+separate+tumor+niches.">Altered lipid metabolism marks glioblastoma stem and non-stem cells in separate tumor niches.</a> Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 101 (2021).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+stem+cells+derived+from+glioblastomas+cultured+in+bFGF+and+EGF+more+closely+mirror+the+phenotype+and+genotype+of+primary+tumors+than+do+serum-cultured+cell+lines.">Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines.</a> Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).</li><li>Bian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+engineered+cerebral+organoids+model+brain+tumor+formation.">Genetically engineered cerebral organoids model brain tumor formation.</a> Nature Methods. 15 (8), 631-639 (2018).</li><li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+cerebral+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).</li><li>Sundar, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+organoid+culture+unveils+resistance+to+clinical+therapies+in+adult+and+pediatric+glioblastoma.">Three-dimensional organoid culture unveils resistance to clinical therapies in adult and pediatric glioblastoma.</a> Translational Oncology. 15 (1), 101251 (2021).</li></ol>

De auteurs hebben geen conflicten te onthullen.

GBM-organoïden zijn een complementaire kweekmethode met traditionele sferen die een grotere cellulaire en micro-omgeving heterogeniteit omvatten 4,22,30. Hoewel meer tijd- en middelenintensief, kan organoïde cultuur waardevol inzicht bieden in intratumoraal gedrag en mechanismen van medicijnresistentie.
GBM wordt aangedreven door een populatie van CSC's 5,31, en deze methoden zijn ontwikkeld om verdere groei en zelfvernieuwing van deze CSC-populatie mogelijk te maken. Van epidermale groeifactor (EGF) en fibroblastgroeifactor (FGF) is bekend dat ze het onderhoud en de groei van stamcellen verbeteren en actieve receptor tyrosinekinase (RTK) signalering bieden. De vorming van heterogene cellulaire populaties en verschillende tumormicro-omgevingen binnen GBM-tumoren is afhankelijk van het ondersteunen van CSC-gedrag. De selectie van een lrECM bootst de lamininerijke hersenomgeving na en ondersteunt de cellen in organoïde cultuur om zichzelf te organiseren en te migreren door invasie. Hoewel sommige groepen organoïde cultuur hebben gevestigd zonder het gebruik van een lrECM of EGF / FGF verrijkte media 24,28, die een meer tijdsefficiënte manier van deze kweekmethode en een sterkere selectie van oncogene signalering kunnen bieden om de groei te stimuleren, werden deze methoden gekozen om de pro-stamcelomgeving te optimaliseren om de cellulaire heterogeniteit van organoïden het best vast te stellen. Zowel cerebrale organoïden als GBM-organoïden zijn in de literatuur eerder met lrECM gemaakt 21,32,33. Hoewel we gegevens hebben vastgesteld over de tumorpopulaties die worden aangetroffen in organoïden en de ruimtelijke variatie, is er minder bekend over niet-tumorpopulaties binnen de organoïden en hoe lang ze overleven van de oorspronkelijke patiëntmonsters. Bepaalde IHC-vlekken (zoals CD45) kunnen deze gegevens leveren en kunnen in de toekomst een interessant onderzoekspunt zijn met organoïden.
Het kennen van het beoogde gebruik voor organoïde cultuur is belangrijk voor het selecteren van geschikte methoden. Het vaststellen van organoïden uit primaire specimens versus het kweken van uniforme organoïden voor specifieke experimenten hebben enigszins verschillende procedures. Waardering hebben voor hoe organoïden rijpen en visueel de lrECM-steiger invullen, is belangrijk om de juiste tijd en middelen te kunnen toewijzen aan organoïdecultuur. Schaarse gebieden van cellen in organoïden zullen langzaam uitzetten en groeien om de lrECM te vullen, wat 2-8 weken kan duren, afhankelijk van het gedrag van het monster. Deze groeisnelheid is enigszins intrinsiek aan elk exemplaar; het wordt bewaard over verschillende partijen organoïden en redelijk consistent met de relatieve snelheid van bolgroei. Organoïden kunnen langer dan 1 jaar worden gehandhaafd en behouden tumorvormingsmogelijkheden op xenograft in muizen; het wordt echter aanbevolen om ze te laten groeien met een duidelijk doel om geen laboratoriumbronnen (zowel materialen als tijd) te verspillen4. Organoïde groei is getest in meerdere putgroottes en -formaten en toont aan dat een plaat van 10 cm de ideale instelling is voor het handhaven van optimale cel levensvatbaarheid, gevolgd door een 6-well plaat met drie organoïden per put34. Organoïden verbruiken meer media in vergelijking met hun tweedimensionale kweek tegenhangers, en het gebruik van een kleiner putformaat leidt niet tot goed onderhoud. Een put van een 96-well formaat plaat heeft bijvoorbeeld niet genoeg ruimte of mediavolume ten opzichte van de grootte van een organoïde om organoïde groei te ondersteunen.
Zoals organoïden vaststellen, is oplettend zijn belangrijk voor het vergroten van succes. Aanvankelijk zullen organoïden media langzaam consumeren, maar naarmate ze dichter en volwassener worden, zullen ze media sneller consumeren. Het toevoegen van fenolrood aan de media kan helpen als indicator van mediaconsumptie. Wanneer de media meer geel zijn, kan dit ons ertoe aanzetten het voedingspatroon aan te passen, of het nu gaat om het uitwisselen van een groter volume media, het verhogen van de totale mediahoeveelheid in de plaat, het verdelen van organoïden over meerdere celkweekplaten om hun groei bij te houden, of zelfs het aanpassen van de tijdlijn voor experimenten. 
In veel opzichten zijn organoïden een inefficiënte manier om kankeronderzoek uit te voeren. Ze omvatten lange tijdschalen en zijn duur en zwaar in vergelijking met de GBM-sfeercultuur. In vergelijking met patiënt-afgeleide xenografts, een alternatieve methode voor het recreëren van cellulaire en micro-omgevingsdiversiteit, zijn ze echter eenvoudiger, goedkoper en controleerbaar. Selectie van wanneer organoïden het beste kunnen worden gebruikt, is belangrijk voor kankeronderzoekers. Ze zijn niet bedoeld om de traditionele bol of aanhangcultuur te vervangen en niet om xenograftmodellen te vervangen. Organoïden kunnen, wanneer ze worden toegepast op de juiste wetenschappelijke vraag, de voordelen van beide systemen combineren en kunnen ons in staat stellen tumorcelbiologie te observeren die anders verborgen zou blijven. De wetenschappelijke gemeenschap begint pas te begrijpen welke leermogelijkheden organoïden bieden, maar het is duidelijk dat ze in de toekomst een waardevol hulpmiddel zullen zijn om de complexe biologie van GBM te begrijpen.

Glioblastoom (GBM) is de meest voorkomende primaire hersentumor met een grimmige prognose van ongeveer 15 maanden vanaf diagnose1. Behandelingen die effectief zijn in preklinische studies kunnen vaak slecht effectief zijn bij patiënten 2,3. Slechte klinische respons wordt toegeschreven aan vele factoren, waaronder de micro-omgeving heterogeniteit van GBM en complexe intra-tumorale interacties. Deze kunnen moeilijk te recreëren zijn in de laboratoriumomgeving met traditionele adherenten- of bolkweekmethoden4. De aanwezigheid van een subset van zelfvernieuwende kankerstamcellen (CSC's) binnen GBM kan ook bijdragen aan deze complexiteit 5,6. CSC's zijn cruciaal voor tumorvoortplanting en houden tumorgroei in stand door actieve angiogenese, kankerinvasie en resistentie tegen therapieën, waaronder straling, te bevorderen 7,8,9. CSC's zijn niet gelijkmatig verdeeld over tumoren, maar zijn eerder verrijkt binnen specifieke micro-omgevingen, waaronder de perivasculaire niche en perinecrotische regio's, die elk een verschillende moleculaire regulatie van hun cellulaire toestanden bieden 10,11,12,13,14. CSC's zijn geen passieve ontvangers van micro-omgevingssignalen, maar bezitten in plaats daarvan de mogelijkheid om hun eigen micro-omgeving te hermodelleren 7,15,16. De micro-omgeving van een CSC kan het behoud van stamceltoestand bevorderen als reactie op drukken zoals nutriëntenschaarste, pH en hypoxie 17,18,19,20, wat het belang van deze aandoeningen in een modelsysteem suggereert. Recapitulatie van de diverse cellulaire micro-omgeving in tumoren is daarom van cruciaal belang voor het begrijpen van therapeutische resistentie en het identificeren van nieuwe therapieën.
Driedimensionale cultuur is de afgelopen jaren in populariteit toegenomen21,22. Organoïden zijn gebruikt bij andere soorten kanker, en het primaire doel van het handhaven van cellen als organoïden is om groei van heterogene celpopulaties mogelijk te maken (waarvan er vele normaal gesproken kunnen worden weggeconcurreerd in meer homogene bolcultuur) en ruimtelijke diversiteit, gezien als regionale tumormicro-omgevingen met genetische specificiteit 4,23,24,25,26 . Er zijn veel methoden voor driedimensionale kweek van kankercellen, die elk voor- en nadelen hebben 27,28,29. Organoïde cultuur is niet bedoeld als vervanging voor traditionele aanhangers of bolcultuur. Het kan het beste worden gebruikt als een aanvullende techniek voor tweedimensionale methoden wanneer er specifieke vragen zijn waarbij de interactie tussen celmicro-omgeving en tumorcelresponsen van cruciaal belang is.
Dit artikel beschrijft betrouwbare en herhaalbare methoden om GBM-organoïden te genereren uit primaire patiëntmonsters of van patiënten afgeleide culturen. We richten ons op twee verschillende doelstellingen voor driedimensionale organoïde cultuur: (1) het vaststellen van organoïden uit primair patiëntenweefsel, met maximaal engraftmentpotentieel ongeacht de uniformiteit, of (2) het kweken van uniforme organoïden voor meer kwantitatief experimenteel gebruik. Bij het vaststellen van een primair monster als organoïden is het niet nodig om te filteren op afzonderlijke cellen of cellen te tellen, omdat het bijhouden van maximale celaantallen en typen om de initiële cultuur vast te stellen een prioriteit is. Bij het kweken van organoïden voor vergelijkende experimenten zijn echter eencellige filtratie en celtelling nodig om ervoor te zorgen dat replicerende organoïden vergelijkbaar zijn voor experimentele consistentie. Dit protocol beschrijft hoe organoïde culturen kunnen worden vastgesteld en uniforme organoïden kunnen worden gemaakt, evenals verfijnde methoden voor het inbedden en behouden van organoïden en standaard celkweekexperimenten, waaronder immunohistochemie, immunofluorescentie en beoordeling van de totale levensvatbaarheid van cellen in GBM-organoïden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3,3-Diaminobenzidine (DAB) tablets</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>08980681</td>
			<td>3,3-Diaminobenzidine (DAB) tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR plates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>96-well PCR plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>SCR005</td>
			<td>Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td>Antibiotic-antimycotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement minus vitamin A</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12587001</td>
			<td>B-27 supplement minus vitamin A (50x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelCode Blue Stain Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>24590</td>
			<td>Bluing reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer (70 &#181;m)</td>
			<td>CellTreat Scientific</td>
			<td>229483</td>
			<td>Cell strainer (70 &#181;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo 3D</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9681</td>
			<td>Luminescent cell viability assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clarifier 2</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>7301</td>
			<td>Nuclear hematoxylin clarifying reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear-Rite 3</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>6901</td>
			<td>xylene substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia Gill 2 Hematoxylin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>72504</td>
			<td>Hematoxylin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine in 0.85% NaCl</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Glutamine in 0.85% NaCl (200 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>354234</td>
			<td>Laminin-enriched extracellular matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini PAP pen</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>008877</td>
			<td>Hydrophobic barrier pen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>22-050-102</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal media minus phenol red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12349015</td>
			<td>Neurobasal media minus phenol red (500 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum (NDS)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td>Normal donkey serum (NDS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 4% in PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td>Paraformaldehyde 4% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0290</td>
			<td>Phenol red (0.5%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P10144</td>
			<td>Liquid curing mountant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human EGF protein</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>236-EG-01M</td>
			<td>Recombinant human EGF protein (250 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human FGF basic</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>4144-TC-01</td>
			<td>Recombinant human FGF basic (250 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SignalStain Antibody Diluent</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>8112</td>
			<td>Antibody diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SignalStain Boost IHC Detection Reagent</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>8114</td>
			<td>Immunohistochemistry detection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SignalStain Citrate Unmasking Solution</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>14746</td>
			<td>Citrate unmasking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge razor blade</td>
			<td>Uline</td>
			<td>H-595B</td>
			<td>Single edge razor blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td>Sodium pyruvate (100 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Cryomolds</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-916</td>
			<td>Disposable cryomolds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-930</td>
			<td>Optimal cutting temperature compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td>Cell impermeant stain (0.4%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>X3P-1GAL</td>
			<td>Xylene</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

maintaining human glioblastoma cellular diversity ex vivo using three-dimensional organoid culture

Glioblastoom (GBM) is de meest voorkomende primaire kwaadaardige hersenkanker met een extreem slechte prognose. Intra-tumorale cellulaire en moleculaire diversiteit, evenals complexe interacties tussen tumormicro-omgevingen, kunnen het vinden van effectieve behandelingen een uitdaging maken. Traditionele aanhankelijke of bolcultuurmethoden kunnen dergelijke complexiteiten maskeren, terwijl driedimensionale organoïde cultuur regionale micro-omgevingsgradiënten kan samenvatten. Organoïden zijn een methode van driedimensionale GBM-cultuur die de tumorarchitectuur van patiënten beter nabootst, fenotypisch diverse celpopulaties bevat en kan worden gebruikt voor experimenten met gemiddelde doorvoer. Hoewel driedimensionale organoïde cultuur bewerkelijker en tijdrovender is in vergelijking met traditionele cultuur, biedt het unieke voordelen en kan het dienen om de kloof tussen huidige in vitro en in vivo systemen te overbruggen. Organoïden hebben zichzelf gevestigd als onschatbare hulpmiddelen in het arsenaal van kankerbiologen om tumorgedrag en resistentiemechanismen beter te begrijpen, en hun toepassingen blijven alleen maar groeien. Hier worden details gegeven over methoden voor het genereren en onderhouden van GBM-organoïden. Instructies voor het inbedden en doorsnijden van organoïdenmonsters met behulp van zowel bevroren als paraffine-inbeddingstechnieken, evenals aanbevelingen voor immunohistochemie en immunofluorescentieprotocollen op organoïde secties en meting van de totale levensvatbaarheid van organoïde cellen, worden ook allemaal beschreven.

Figuur 1 toont vroege organoïde groei gezien via lichtmicroscopie bij 10x vergroting. Figuur 1A toont migratie en invasie van afzonderlijke cellen via lrECM in de middelste weergave. De cellen zullen de lrECM blijven uitbreiden en 'koloniseren', en ze zullen dichter en uiteindelijk ondoorzichtiger lijken door visuele inspectie. Figuur 1B toont verschillende volwassen organoïden (na 7 weken) zonder vergroting, ten opzichte van de grootte van een dubbeltje.
Figuur 2 toont immunohistochemische kleuring van GBM-organoïden voor fosfo-histon H3, een marker van actieve proliferatie. De meeste zeer proliferatieve cellen worden gezien in de organoïde omtrek in vergelijking met de organoïde kern. Positieve kleuring zal een bruin / koper uiterlijk hebben.
Figuur 3 beschrijft het proces om het totale celaantal in GBM-organoïden te homogeniseren en te meten met behulp van een 3D-specifieke luminescerende cel levensvatbaarheidstest. Vanwege het grote aantal cellen dat aanwezig is in GBM-organoïden, wordt de grotere organoïde structuur aanvankelijk gehomogeniseerd door tritureren in luminescerend testreagens. Vervolgens worden fracties van het totale organoïde lysaat in afzonderlijke putten geladen en verdund met extra luminescerend assayreagens voorafgaand aan incubatie en aflezing op een geschikte multi-well plaatlezer.
Figuur 4 geeft dmso-controlegegevens (common vehicle) weer voor organoïden. Uitgezette gegevens tonen intra-organoïde en inter-organoïde consistentie aan. Luminescerende levensvatbaarheidsgegevens worden doorgaans genormaliseerd naar controles voor elk monster bij het genereren van experimentele gegevens.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63745/63745fig01.jpg"> Figuur 1: Bekijk door een lichtmicroscoop (10x). (A) Vroege organoïde groei die migratie / invasie van GBM-cellen in de lamininerijke extracellulaire matrix aantoont. (B) Rijpe organoïden ten opzichte van de grootte van een dubbeltje. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63745/63745fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63745/63745fig02.jpg"> Figuur 2: Immunohistochemie van GBM-organoïden. (A, B) GBM-organoïden met fosfo-histon H3-gekleurde cellen voor actieve proliferatie. Scalebars zijn respectievelijk 600 μm en 300 μm voor A en B. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63745/63745fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63745/63745fig03.jpg"> Figuur 3: Luminescent cell levensvatbaarheidsprotocol voor organoïden. (A) Verplaats individuele organoïden naar kleine centrifugebuizen en verwijder overtollige media. (B) Voeg 500 μL 1:1 PBS en luminescerend cel levensvatbaarheidstestmengsel toe aan elke buis en pipet agressief om de organoïde af te breken. (C) Voeg 25 μL van dit organoïde mengsel en 75 μL van hetzelfde 1:1 PBS en luminescerende cel levensvatbaarheidstestmengsel toe aan elk putje van een 96-wells plaat. (D) Plaats op een shaker gedurende 2 minuten, gevolgd door incubatie gedurende 20 minuten bij RT, en lees vervolgens luminescentie op een plaatlezer. Figuur gemaakt met behulp van BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63745/63745fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63745/63745fig04.jpg"> Figuur 4: Levensvatbaarheid van cellen. Cel levensvatbaarheidsgegevens voor organoïden in 0,1% dimethylsulfoxide (DMSO) voor zes technische replicaties van vier organoïden voor vier patiëntmonsters. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63745/63745fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Bestanddeel</td>
			<td>Hoeveelheid</td>
		</tr><tr><td>Neurobasaal medium minus fenol rood</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr><tr><td>B-27 supplement minus vitamine A (50x)</td>
			<td>10 ml</td>
		</tr><tr><td>Antibioticum-antimycotisch (100x)</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr><tr><td>Natriumpyruvaat (100 mM)</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr><tr><td>Glutamine in 0,85% NaCl (200 mM)</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr><tr><td>Recombinant humaan FGF basic (250 μg/ml)</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr><tr><td>Recombinant humaan EFG-eiwit (250 μg/ml)</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr><tr><td>Fenol rood</td>
			<td>500 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Neurobasal medium complete (NBMc) formulering
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reagens</td>
			<td>Tijd</td>
		</tr><tr><td>50% Ethanol</td>
			<td>3 min.</td>
		</tr><tr><td>75% Ethanol</td>
			<td>3 min.</td>
		</tr><tr><td>95% Ethanol</td>
			<td>3 min.</td>
		</tr><tr><td>95% Ethanol</td>
			<td>4 min.</td>
		</tr><tr><td>100% Ethanol</td>
			<td>2 min.</td>
		</tr><tr><td>100% Ethanol</td>
			<td>3 min.</td>
		</tr><tr><td>100% Ethanol</td>
			<td>4 min.</td>
		</tr><tr><td>Xyleenvervanger</td>
			<td>2 min.</td>
		</tr><tr><td>Xyleenvervanger</td>
			<td>3 min.</td>
		</tr><tr><td>Xyleenvervanger</td>
			<td>4 min.</td>
		</tr><tr><td>Paraffine</td>
			<td>15 min.</td>
		</tr><tr><td>Paraffine</td>
			<td>15 min.</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 2: Verwerkingsschema voor kleine organoïden (met een diameter van minder dan 3 mm)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reagens</td>
			<td>Tijd</td>
		</tr><tr><td>50% Ethanol</td>
			<td>6 min.</td>
		</tr><tr><td>75% Ethanol</td>
			<td>6 min.</td>
		</tr><tr><td>95% Ethanol</td>
			<td>5 min.</td>
		</tr><tr><td>95% Ethanol</td>
			<td>8 min.</td>
		</tr><tr><td>100% Ethanol</td>
			<td>5 min.</td>
		</tr><tr><td>100% Ethanol</td>
			<td>5 min.</td>
		</tr><tr><td>100% Ethanol</td>
			<td>8 min.</td>
		</tr><tr><td>Xyleenvervanger</td>
			<td>5 min.</td>
		</tr><tr><td>Xyleenvervanger</td>
			<td>5 min.</td>
		</tr><tr><td>Xyleenvervanger</td>
			<td>8 min.</td>
		</tr><tr><td>Paraffine</td>
			<td>30 min.</td>
		</tr><tr><td>Paraffine</td>
			<td>30 min.</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 3: Verwerkingsschema voor grote organoïden (met een diameter van meer dan 3 mm)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reagens</td>
			<td>Tijd</td>
		</tr><tr><td>Hematoxyline</td>
			<td>2 min.</td>
		</tr><tr><td>Lopen diH2O</td>
			<td>2 min.</td>
		</tr><tr><td>Nucleair hematoxyline-verhelderend reagens</td>
			<td>1 min</td>
		</tr><tr><td>Lopen diH2O</td>
			<td>1 min</td>
		</tr><tr><td>Bluing Reagens</td>
			<td>1 min</td>
		</tr><tr><td>Lopen diH2O</td>
			<td>2 min.</td>
		</tr><tr><td>70% ethanol</td>
			<td>1 min</td>
		</tr><tr><td>100% ethanol</td>
			<td>1 min</td>
		</tr><tr><td>100% ethanol</td>
			<td>1 min</td>
		</tr><tr><td>Xyleenvervanger</td>
			<td>2 min.</td>
		</tr><tr><td>Xyleenvervanger</td>
			<td>2 min.</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 4: Hematoxyline counterstain

Watch this Scientific Journal Video about Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture at JoVE.com

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

Hier beschrijven we een methode om glioblastoom (GBM) organoïden te genereren uit primaire patiëntspecimens of van patiënten afgeleide celculturen en deze tot volwassenheid te houden. Deze GBM-organoïden bevatten fenotypisch diverse celpopulaties en recreëren tumormicro-omgevingen ex vivo.

Behoud van humane glioblastoom cellulaire diversiteit ex vivo met behulp van driedimensionale organoïde cultuur

Glioblastoma (GBM) is the most commonly occurring primary malignant brain cancer with an extremely poor prognosis. Intra-tumoral cellular and molecular ...

Het vinden van behandelingen voor glioblastoom is een uitdaging vanwege de cellulaire diversiteit die bestaat in tumoren en de interacties tussen diverse micro-omgevingen. Organoïden kunnen helpen bij het recreëren van een deel van die ruimtelijke diversiteit, en we kunnen dit gebruiken om de biologie van de tumoren beter te begrijpen. Terwijl traditionele celkweekmethoden de neiging hebben om homogene tumorcelpopulaties te produceren, kunnen organoïden de moleculaire en cellulaire diversiteit van glioblastoom beter nabootsen en intratumorale interacties beter modelleren.Organoïden kunnen worden gebruikt om de werkzaamheid van geneesmiddelen en resistentiemechanismen te onderzoeken. Resistentie tegen klinische therapieën kan alleen voorkomen in organoïden en niet in de traditionele bolcultuur, wat de klinische realiteit van deze ziekte weerspiegelt. Organoïden kunnen helpen bij het aantonen van de regionale effecten van chemotherapieën.Ze kunnen worden gebruikt om nieuwe nichespecifieke therapieën te ontdekken en ze kunnen ook fungeren als een voorspellend hulpmiddel voor gepersonaliseerde geneeskunde in de toekomst. Sommige materialen die worden gebruikt om organoïden te maken, zijn temperatuurgevoelig en het nalaten om deze materialen op hun juiste temperatuur te houden, kan leiden tot problemen bij het maken of onderhouden van organoïden. Begin met het bereiden van de organoïde mallen onder een kweekkap door het waspapier van het parafilmvel te halen en het tussen twee steriele 96-well polymerasekettingreactie- of PCR-platen te plaatsen.Zorg ervoor dat de binnenkant van de parafilm schoon is. Oefen gelijkmatige druk uit op de bovenplaat om kleine kuiltjes van twee millimeter diep in de parafilm te vormen zonder gaten te creëren. Scheid de platen.De gerimpelde parafilm blijft aan de bovenplaat plakken. Plaats vervolgens de bovenplaat gedurende 30 seconden op droogijs. Gebruik een steriele tang om de parafilm in een snelle beweging van de bovenplaat te trekken.Bevroren parafilm is gemakkelijker te verwijderen. Plaats de voltooide parafilmvorm in een afgedekte, steriele celkweekschaal van 10 centimeter. Om de eencellige suspensie te bereiden op glioblastoom of GBM-hechtingscultuur, verwijdert u de gebruikte media van de plaat.Voeg vervolgens twee milliliter cellosmiddel bij kamertemperatuur toe aan de plaat en incubeer de plaat gedurende drie minuten op 37 graden. Nadat u het loslaten van de cel van de plaat onder de microscoop hebt bevestigd, voegt u acht milliliter Neurobasal Medium complete of NBMc-medium toe om de celloslatingsoplossing te neutraliseren. Zeef de suspensie door een enkele celzeef van 70 micron.Draai de cellen op 120 keer G gedurende vijf minuten. Verwijder vervolgens het supernatant en resuspenseer de cellen in één milliliter NBMc. Tel de cellen uit de eencellige suspensie met behulp van een cel ondoordringbare kleuring.Om organoïden te maken van een eencellige suspensie, voegt u een geschikte hoeveelheid lamininerijke extracellulaire matrix, of lrECM, toe aan een kleine centrifugebuis in een ijsemmer of koud blok. Bereid een celmengsel met 20.000 cellen per organoïde. Meng het lrECM-celsuspensiemengsel grondig om te voorkomen dat de cellen bezinken, wat zou resulteren in niet-uniforme organoïdevorming.Pipetteer vervolgens voorzichtig 20 microliter van het mengsel op een parafilmvorm om een parelachtige druppel te vormen. Zorg ervoor dat u de pipetpunt om de twee tot drie organoïden koelt om lrECM-polymerisatie te voorkomen. Zodra het gewenste aantal organoïden op de parafilmvorm is gepipetteerd in een kweekplaat van 10 centimeter, incubeer je de organoïden bij 37 graden Celsius gedurende één tot twee uur in een celkweekincubator.Nadat de organoïden zijn gestold, spoelt u de organoïden voorzichtig van de parafilmvorm met NBMc-medium met behulp van een P1000-punt en verzamelt u ze in een nieuwe kweekplaat van 10 centimeter met 20 milliliter NBMc. Plaats de kweekplaat in een incubator zonder vier dagen te schudden. Vervang na vier dagen de media in de plaat.Plaats hiervoor een stuk donker papier onder de celkweekplaat. Kantel de plaat en wacht 20 seconden. Terwijl de organoïden zich volledig op de bodem van de schaal nestelen, verwijdert u de media langzaam met een glazen pipet met grote opening.Na het toevoegen van nieuwe media, plaatst u de plaat in de incubator op een orbitale shaker met 80 RPM en wisselt u daarna om de twee tot drie dagen media uit. De groei van de organoïde werd waargenomen met behulp van lichtmicroscopie. In het middenbeeld toonde vroege organoïde groei migratie en eencellige invasie via lrECM.De volwassen organoïden na zeven weken waren relatief ten opzichte van de grootte van een dubbeltje. De immunohistochemische kleuring van de GBM-organoïden met fosfo-histon H3 onthulde zeer proliferatieve cellen met een bruin of paars uiterlijk in de organoïde omtrek in vergelijking met de kern. De cel levensvatbaarheidsgegevens voor organoïden in 0,1% DMSO toonden intraorganoïde en interorganoïde consistentie.Besteed aandacht aan organoïde biomassa en mediaverzuring. Als de organoïden te snel door de media gaan, zorg er dan voor dat u de media vaker verwisselt of de organoïden splitst tussen extra platen. Volwassen organoïden kunnen worden gebruikt voor experimenten met therapieën of ingebed en gesneden voor gebruik met immunohistochemie of immunofluorescentie.De gedissocieerde organoïden kunnen worden gebruikt voor FACS-analyse. Deze organoïden werden onlangs gebruikt in driedimensionale functionele screening om doelen te ontdekken die essentieel zijn in ruimtelijk verschillende kankerstamcelniches. We gebruiken deze modellen ook om prioriteit te geven aan verschillende geneesmiddelen en therapieën voorafgaand aan in vivo testen.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Beeldvorming van Resident CD8 T lymfocyten in menselijke longen Tumor plakjes met behulp van confocale microscopie

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Fluorescentie moleculaire tomografie voor In Vivo Imaging van Glioblastoma Xenografts

Tumorigenicity is the capability of cancer cells to form a tumor mass. A widely used approach to determine if the cells are tumorigenic is by injecting ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

Longitudinale morfologische en fysiologische Monitoring van driedimensionale Tumor spheroïden met behulp van optische coherentie tomografie

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Volledig menselijke tumor-gebaseerde matrijs in driedimensionele sferoïde invasie assay

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

Evaluatie van de differentiatie capaciteit van muizen prostaat epitheelcellen met behulp van Organoid cultuur

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

Co-cultuur van Glioblastoom Stam-achtige cellen op patroonneuronen om migratie en cellulaire interacties te bestuderen

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

Driedimensionaal in vitro biomimetisch model van neuroblastoom met behulp van op collageen gebaseerde steigers

Neuroblastoma is the most common extracranial solid tumor in children, accounting for 15% of overall pediatric cancer deaths. The native tumor tissue is a ...

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Ex Vivo Organoïde model van Adenovirus-Cre gemedieerde gendeleties in muizen urotheelcellen

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites ...

Phospholipid Mediator Induced Transformation in Three-Dimensional Cultures

Fosfolipide mediator geïnduceerde transformatie in driedimensionale culturen

Several models have been developed to study cancer, such as rodent models and established cell lines. Valuable insights into carcinogenesis have been ...

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

Driedimensionale cultuur van Murine Colonic Crypts om de intestinale stamcelfunctie ex vivo te bestuderen

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of ...