Name: maintaining human glioblastoma cellular diversity ex vivo using three-dimensional organoid culture
Uploaded: 2022-08-25T13:10:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture at JoVE.com

ברצוננו להודות לד"ר ג'סטין לת'יה על עצתו שלא תסולא בפז ותמיכתו המתמשכת. אנו מודים גם לקטרינה פייף, ליסה וואלאס ומאיה קמחי על התמיכה הטכנית המצוינת שלהן.

<ol>
	<li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma.">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.</a> New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).</li><li>Heffernan, J. M., Sirianni, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+microenvironmental+regulation+of+glioblastoma+stem+cells:+a+biomaterials+perspective.">Modeling microenvironmental regulation of glioblastoma stem cells: a biomaterials perspective.</a> Frontiers in Materials. 5, 7 (2018).</li><li>Zanders, E. D., Svensson, F., Bailey, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapy+for+glioblastoma:+is+it+working.">Therapy for glioblastoma: is it working.</a> Drug Discovery Today. 24 (5), 1193-1201 (2019).</li><li>Hubert, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Three-dimensional+organoid+culture+system+derived+from+human+glioblastomas+recapitulates+the+hypoxic+gradients+and+cancer+stem+cell+heterogeneity+of+tumors+found+in+vivo.">A Three-dimensional organoid culture system derived from human glioblastomas recapitulates the hypoxic gradients and cancer stem cell heterogeneity of tumors found in vivo.</a> Cancer Research. 76 (8), 2465-2477 (2016).</li><li>Lathia, J. D., Heddleston, J. M., Venere, M., Rich, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deadly+teamwork:+neural+cancer+stem+cells+and+the+tumor+microenvironment.">Deadly teamwork: neural cancer stem cells and the tumor microenvironment.</a> Cell Stem Cell. 8 (5), 482-485 (2011).</li><li>Meyer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell-derived+clonal+analysis+of+human+glioblastoma+links+functional+and+genomic+heterogeneity.">Single cell-derived clonal analysis of human glioblastoma links functional and genomic heterogeneity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 851-856 (2015).</li><li>Bao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-like+glioma+cells+promote+tumor+angiogenesis+through+vascular+endothelial+growth+factor.">Stem cell-like glioma cells promote tumor angiogenesis through vascular endothelial growth factor.</a> Cancer Research. 66 (16), 7843-7848 (2006).</li><li>Yu, S. C., Bian, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+cancer+stem+cells+based+on+heterogeneity+of+invasiveness.">Enrichment of cancer stem cells based on heterogeneity of invasiveness.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 5 (1), 66-71 (2009).</li><li>Bao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+stem+cells+promote+radioresistance+by+preferential+activation+of+the+DNA+damage+response.">Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response.</a> Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).</li><li>Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+tumour+stem+cells.">Brain tumour stem cells.</a> Nature Reviews. Cancer. 6 (6), 425-436 (2006).</li><li>Zhu, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+create+a+stem+cell+niche+in+glioblastoma+by+providing+NOTCH+ligands+that+nurture+self-renewal+of+cancer+stem-like+cells.">Endothelial cells create a stem cell niche in glioblastoma by providing NOTCH ligands that nurture self-renewal of cancer stem-like cells.</a> Cancer Research. 71 (18), 6061-6072 (2011).</li><li>Calabrese, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perivascular+niche+for+brain+tumor+stem+cells.">A perivascular niche for brain tumor stem cells.</a> Cancer Cell. 11 (1), 69-82 (2007).</li><li>Charles, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+nitric+oxide+activates+notch+signaling+and+promotes+stem-like+character+in+PDGF-induced+glioma+cells.">Perivascular nitric oxide activates notch signaling and promotes stem-like character in PDGF-induced glioma cells.</a> Cell Stem Cell. 6 (2), 141-152 (2010).</li><li>Seidel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hypoxic+niche+regulates+glioblastoma+stem+cells+through+hypoxia+inducible+factor+2+alpha.">A hypoxic niche regulates glioblastoma stem cells through hypoxia inducible factor 2 alpha.</a> Brain. 133, 983-995 (2010).</li><li>Yan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+cancer+stem+cells+secrete+Gremlin1+to+promote+their+maintenance+within+the+tumor+hierarchy.">Glioma cancer stem cells secrete Gremlin1 to promote their maintenance within the tumor hierarchy.</a> Genes &amp; Development. 28 (10), 1085-1100 (2014).</li><li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+stem+cells+generate+vascular+pericytes+to+support+vessel+function+and+tumor+growth.">Glioblastoma stem cells generate vascular pericytes to support vessel function and tumor growth.</a> Cell. 153 (1), 139-152 (2013).</li><li>Flavahan, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+tumor+initiating+cells+adapt+to+restricted+nutrition+through+preferential+glucose+uptake.">Brain tumor initiating cells adapt to restricted nutrition through preferential glucose uptake.</a> Nature Neuroscience. 16 (10), 1373-1382 (2013).</li><li>Hjelmeland, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidic+stress+promotes+a+glioma+stem+cell+phenotype.">Acidic stress promotes a glioma stem cell phenotype.</a> Cell Death and Differentiation. 18 (5), 829-840 (2011).</li><li>Bar, E. E., Lin, A., Mahairaki, V., Matsui, W., Eberhart, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+increases+the+expression+of+stem-cell+markers+and+promotes+clonogenicity+in+glioblastoma+neurospheres.">Hypoxia increases the expression of stem-cell markers and promotes clonogenicity in glioblastoma neurospheres.</a> The American Journal of Pathology. 177 (3), 1491-1502 (2010).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-inducible+factors+regulate+tumorigenic+capacity+of+glioma+stem+cells.">Hypoxia-inducible factors regulate tumorigenic capacity of glioma stem cells.</a> Cancer Cell. 15 (6), 501-513 (2009).</li><li>Azzarelli, R., Ori, M., Philpott, A., Simons, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+model+of+glioblastoma+by+co-culturing+tumor+stem+cells+with+human+brain+organoids.">Three-dimensional model of glioblastoma by co-culturing tumor stem cells with human brain organoids.</a> Biology Open. 10 (2), 056416 (2021).</li><li>Linkous, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+patient-derived+glioblastoma+with+cerebral+organoids.">Modeling patient-derived glioblastoma with cerebral organoids.</a> Cell Reports. 26 (12), 3203-3211 (2019).</li><li>da Silva, B., Mathew, R. K., Polson, E. S., Williams, J., Wurdak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+glioblastoma+spheroid+infiltration+of+early-stage+cerebral+organoids+models+brain+tumor+invasion.">Spontaneous glioblastoma spheroid infiltration of early-stage cerebral organoids models brain tumor invasion.</a> SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R &amp; D. 23 (8), 862-868 (2018).</li><li>Jacob, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Patient-derived+glioblastoma+organoid+model+and+biobank+recapitulates+inter-+and+intra-tumoral+heterogeneity.">A Patient-derived glioblastoma organoid model and biobank recapitulates inter- and intra-tumoral heterogeneity.</a> Cell. 180 (1), 188-204 (2020).</li><li>Boretto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+from+endometrial+disease+capture+clinical+heterogeneity+and+are+amenable+to+drug+screening.">Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening.</a> Nature Cell Biology. 21 (8), 1041-1051 (2019).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ductal+pancreatic+cancer+modeling+and+drug+screening+using+human+pluripotent+stem+cell-and+patient-derived+tumor+organoids.">Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell-and patient-derived tumor organoids.</a> Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).</li><li>Ledur, P. F., Onzi, G. R., Zong, H., Lenz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+conditions+defining+glioblastoma+cells+behavior:+what+is+the+impact+for+novel+discoveries.">Culture conditions defining glioblastoma cells behavior: what is the impact for novel discoveries.</a> Oncotarget. 8 (40), 69185-69197 (2017).</li><li>Lenin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+drug+screening+pipeline+using+2D+and+3D+patient-derived+in+vitro+models+for+preclinical+analysis+of+therapy+response+in+glioblastoma.">A drug screening pipeline using 2D and 3D patient-derived in vitro models for preclinical analysis of therapy response in glioblastoma.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (9), 4322 (2021).</li><li>Rybin, M. J., Ivan, M. E., Ayad, N. G., Zeier, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+glioblastoma+and+their+role+in+drug+discovery.">Organoid models of glioblastoma and their role in drug discovery.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 15 (4), 605255 (2021).</li><li>Shakya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+lipid+metabolism+marks+glioblastoma+stem+and+non-stem+cells+in+separate+tumor+niches.">Altered lipid metabolism marks glioblastoma stem and non-stem cells in separate tumor niches.</a> Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 101 (2021).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+stem+cells+derived+from+glioblastomas+cultured+in+bFGF+and+EGF+more+closely+mirror+the+phenotype+and+genotype+of+primary+tumors+than+do+serum-cultured+cell+lines.">Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines.</a> Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).</li><li>Bian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+engineered+cerebral+organoids+model+brain+tumor+formation.">Genetically engineered cerebral organoids model brain tumor formation.</a> Nature Methods. 15 (8), 631-639 (2018).</li><li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+cerebral+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).</li><li>Sundar, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+organoid+culture+unveils+resistance+to+clinical+therapies+in+adult+and+pediatric+glioblastoma.">Three-dimensional organoid culture unveils resistance to clinical therapies in adult and pediatric glioblastoma.</a> Translational Oncology. 15 (1), 101251 (2021).</li></ol>

למחברים אין קונפליקטים לחשוף.

אורגנואידים GBM הם שיטת תרבית משלימה לתחומים מסורתיים הכוללים הטרוגניות תאית ומיקרו-סביבתית גדולה יותר 4,22,30. למרות שהיא דורשת יותר זמן ומשאבים, התרבות האורגנואידית יכולה להציע תובנות חשובות לגבי התנהגות תוך-סרטנית ומנגנונים של עמידות לסמים.
GBM מונע על ידי אוכלוסייה של CSCs 5,31, ושיטות אלה פותחו כדי לאפשר המשך צמיחה והתחדשות עצמית של אוכלוסיית CSC זו. גורם גדילה אפידרמלי (EGF) וגורם גדילה פיברובלסט (FGF) ידועים כמשפרים את התחזוקה והצמיחה של תאי גזע ומספקים איתות קולטן פעיל טירוזין קינאז (RTK). היווצרותן של אוכלוסיות תאים הטרוגניות ומיקרו-סביבה של גידולים מובחנים בתוך גידולי GBM מסתמכת על תמיכה בהתנהגויות CSC. הבחירה של lrECM מחקה את סביבת המוח העשירה בלמינינים ותומכת בתאים בתרבית אורגנואידית להתארגן בעצמם ולהגר על ידי פלישה. למרות שקבוצות מסוימות ביססו תרבית אורגנואידית ללא שימוש במדיה מועשרת lrECM או EGF/FGF24,28, שעשויה להציע דרך יעילה יותר בזמן של שיטת תרבית זו ובחירה חזקה יותר של איתות אונקוגני כדי להניע צמיחה, שיטות אלה נבחרו כדי לייעל את הסביבה הפרו-תאי כדי לבסס בצורה הטובה ביותר את ההטרוגניות התאית של אורגנואידים. גם אורגנואידים מוחיים וגם אורגנואידים GBM נעשו עם lrECM בספרות בעבר 21,32,33. למרות שביססנו נתונים לגבי אוכלוסיות הגידולים שנמצאו בתוך האורגנואידים והשונות המרחבית, פחות ידוע על אוכלוסיות שאינן גידוליות בתוך האורגנואידים וכמה זמן הם שורדים מדגימות החולה המקוריות. כתמי IHC מסוימים (כגון CD45) עשויים לספק נתונים אלה, ועשויים להיות נקודת מחקר מעניינת בעתיד עם אורגנואידים.
ידיעת השימוש המיועד לתרבית אורגנואידית חשובה לבחירת שיטות מתאימות. לביסוס אורגנואידים מדגימות ראשוניות לעומת גידול אורגנואידים אחידים לניסויים ספציפיים יש הליכים מעט שונים. הערכה לאופן שבו אורגנואידים מתבגרים וממלאים חזותית את פיגום lrECM חשובה ליכולת להקצות זמן ומשאבים מתאימים לתרבות אורגנואידית. אזורים דלילים של תאים באורגנואידים יתרחבו באיטיות ויגדלו כדי למלא את ה-lrECM, מה שיכול להימשך בין 2-8 שבועות, תלוי בהתנהגות הדגימה. קצב גידול זה הוא מהותי במקצת לכל דגימה; הוא נשמר על פני קבוצות שונות של אורגנואידים ועקבי למדי עם הקצב היחסי של צמיחת הכדור. אורגנואידים יכולים להישמר במשך יותר משנה אחת ולשמור על יכולות היווצרות הגידול על xenograft לתוך עכברים; עם זאת, מומלץ לגדל אותם במטרה ברורה לא לבזבז משאבי מעבדה (הן חומרים והן זמן)4. גידול אורגנואידי נבדק במספר גדלים ופורמטים של בארות, ומראה כי צלחת בגודל 10 ס"מ היא ההגדרה האידיאלית לשמירה על כדאיות תאים אופטימלית, ואחריה צלחת של 6 בארות עם שלושה אורגנואידים לכלבאר 34. אורגנואידים צורכים יותר מדיה בהשוואה למקביליהם התרבית הדו-ממדית, ושימוש בפורמט באר קטן יותר אינו מוביל לתחזוקה נאותה. לדוגמה, לבאר אחת של לוח בפורמט 96 בארות אין מספיק שטח או נפח מדיה ביחס לגודל של אורגנואיד כדי לקיים צמיחה אורגנואידית.
כפי שהאורגנואידים קובעים, להיות שומר מצוות חשוב להגברת ההצלחה. בתחילה, אורגנואידים יצרכו מדיה לאט, אך ככל שהם נעשים צפופים ובוגרים יותר, הם יצרכו מדיה מהר יותר. הוספת פנול אדום למדיה יכולה לעזור לשמש אינדיקטור לצריכת מדיה. כאשר המדיה צהובה יותר, זה עשוי לגרום לנו להתאים את דפוס ההזנה, בין אם זה להחליף נפח גבוה יותר של מדיה, להגדיל את כמות המדיה הכוללת בצלחת, לחלק אורגנואידים בין מספר צלחות תרבית תאים כדי לעמוד בקצב הצמיחה שלהם, או אפילו להתאים את ציר הזמן לניסויים. 
במובנים רבים, אורגנואידים הם דרך לא יעילה לביצוע מחקר סרטן. הם כרוכים בסקאלות זמן ארוכות, והם יקרים ועתירי משאבים בהשוואה לתרבות הספירה של GBM. עם זאת, בהשוואה לקסנוגרפטים שמקורם בחולה, שיטה חלופית ליצירה מחדש של מגוון תאי ומיקרו-סביבתי, הם פשוטים יותר, זולים יותר וניתנים לשליטה. הבחירה מתי להשתמש בצורה הטובה ביותר באורגנואידים חשובה לחוקרי סרטן. הם לא נועדו להחליף את המרחב המסורתי או את התרבות החסידית ולא להחליף מודלים של קסנוגרפט. אורגנואידים יכולים, כאשר הם מיושמים בשאלה המדעית הנכונה, לשלב את היתרונות של שתי המערכות הללו ועשויים לאפשר לנו להתבונן בביולוגיה של תאי הגידול שאחרת היו נשארים מוסתרים. הקהילה המדעית רק מתחילה להבין אילו הזדמנויות למידה אורגנואידים מציעים, אך ברור שהם יהיו כלי רב ערך בעתיד להבנת הביולוגיה המורכבת של GBM.

גליובלסטומה (GBM) היא הגידול העיקרי השכיח ביותר במוח עם פרוגנוזה קודרת של כ -15 חודשים מאבחון1. טיפולים יעילים במחקרים פרה-קליניים יכולים לעתים קרובות להיות יעילים בצורה גרועה בחולים 2,3. תגובה קלינית ירודה מיוחסת לגורמים רבים, כולל ההטרוגניות המיקרו-סביבתית של GBM ואינטראקציות פנים-טיפוליות מורכבות. אלה יכולים להיות קשים לשחזור בסביבת המעבדה עם שיטות מסורתיות של תרבית דבק או כדור4. נוכחות של תת-קבוצה של תאי גזע סרטניים המתחדשים בעצמם (CSCs) בתוך GBM עשויה גם היא לתרום למורכבות זו 5,6. CSCs חיוניים להתפשטות הגידול ולשמירה על צמיחת הגידול על ידי קידום אנגיוגנזה פעילה, פלישת סרטן ועמידות לטיפולים כולל קרינה 7,8,9. תאי CSCs אינם מפוזרים באופן אחיד בין גידולים, אלא מועשרים בתוך מיקרו-סביבה ספציפית, כולל נישה פריווסקולרית ואזורים פרינקריטיים, שכל אחד מהם מספק ויסות מולקולרי מובהק של מצבי התאים שלהם 10,11,12,13,14. CSCs אינם נמענים פסיביים של רמזים מיקרו-סביבתיים, אלא בעלי יכולת לעצב מחדש את המיקרו-סביבה שלהם 7,15,16. המיקרו-סביבה של CSC יכולה לקדם תחזוקה של מצב תאי גזע בתגובה ללחצים כגון מחסור בחומרים מזינים, pH והיפוקסיה17,18,19,20, מה שמרמז על החשיבות של תנאים אלה במערכת מודל. לפיכך, שחזור של המיקרו-סביבה התאית המגוונת בתוך גידולים הוא קריטי להבנת העמידות הטיפולית ולזיהוי טיפולים חדשניים.
תרבות התלת מימד עלתה בפופולריות בשנים האחרונות21,22. אורגנואידים שימשו בסוגים אחרים של סרטן, והמטרה העיקרית של שמירה על תאים כאורגנואידים היא לאפשר צמיחה של אוכלוסיות תאים הטרוגניות (שרבות מהן עשויות בדרך כלל להיות מחוץ לתרבית כדור הומוגנית יותר) ומגוון מרחבי, הנתפס כמיקרו-סביבה אזורית של גידולים עם ספציפיות גנטית 4,23,24,25,26 . ישנן שיטות רבות לתרבית תלת מימדית של תאים סרטניים, שלכל אחת מהן יתרונות וחסרונות27,28,29. התרבות האורגנואידית לא נועדה להוות תחליף לתרבות החסידות או המרחב המסורתית. הוא משמש בצורה הטובה ביותר כטכניקה משלימה לשיטות דו-ממדיות כאשר יש שאלות ספציפיות שבהן האינטראקציה בין מיקרו-סביבה של תאים לתגובות תאי גידול היא קריטית.
מאמר זה מתאר שיטות אמינות וחוזרות על עצמן ליצירת אורגנואידים של GBM מדגימות מטופלים ראשוניות או מתרביות שמקורן בחולה. אנו מתייחסים לשתי מטרות שונות לתרבית אורגנואידית תלת-ממדית: (1) הקמת אורגנואידים מרקמת המטופל הראשונית, עם פוטנציאל השתלה מקסימלי ללא קשר לאחידות, או (2) גידול אורגנואידים אחידים לשימוש ניסיוני כמותי יותר. בעת הקמת דגימה ראשונית כאורגנואידים, אין צורך לסנן תאים בודדים או לספור תאים, מכיוון ששמירה על מספר וסוגי תאים מרביים כדי לקבוע את התרבית הראשונית היא בראש סדר העדיפויות. עם זאת, כאשר מגדלים אורגנואידים לניסויים השוואתיים, יש צורך בסינון חד-תאי ובספירת תאים כדי להבטיח שהאורגנואידים המשוכפלים יהיו ברי השוואה לצורך עקביות ניסויית. פרוטוקול זה מפרט כיצד להקים תרביות אורגנואידים וליצור אורגנואידים אחידים, כמו גם שיטות מעודנות להטמעה ושימור של אורגנואידים וניסויים סטנדרטיים בתרביות תאים, כולל אימונוהיסטוכימיה, אימונופלואורסצנציה והערכת הכדאיות הכוללת של התאים באורגנואידים GBM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3,3-Diaminobenzidine (DAB) tablets</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>08980681</td>
			<td>3,3-Diaminobenzidine (DAB) tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR plates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>96-well PCR plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>SCR005</td>
			<td>Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td>Antibiotic-antimycotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement minus vitamin A</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12587001</td>
			<td>B-27 supplement minus vitamin A (50x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelCode Blue Stain Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>24590</td>
			<td>Bluing reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer (70 &#181;m)</td>
			<td>CellTreat Scientific</td>
			<td>229483</td>
			<td>Cell strainer (70 &#181;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo 3D</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9681</td>
			<td>Luminescent cell viability assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clarifier 2</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>7301</td>
			<td>Nuclear hematoxylin clarifying reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear-Rite 3</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>6901</td>
			<td>xylene substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia Gill 2 Hematoxylin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>72504</td>
			<td>Hematoxylin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine in 0.85% NaCl</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Glutamine in 0.85% NaCl (200 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>354234</td>
			<td>Laminin-enriched extracellular matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini PAP pen</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>008877</td>
			<td>Hydrophobic barrier pen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>22-050-102</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal media minus phenol red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12349015</td>
			<td>Neurobasal media minus phenol red (500 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum (NDS)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td>Normal donkey serum (NDS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 4% in PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td>Paraformaldehyde 4% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0290</td>
			<td>Phenol red (0.5%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P10144</td>
			<td>Liquid curing mountant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human EGF protein</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>236-EG-01M</td>
			<td>Recombinant human EGF protein (250 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human FGF basic</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>4144-TC-01</td>
			<td>Recombinant human FGF basic (250 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SignalStain Antibody Diluent</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>8112</td>
			<td>Antibody diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SignalStain Boost IHC Detection Reagent</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>8114</td>
			<td>Immunohistochemistry detection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SignalStain Citrate Unmasking Solution</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>14746</td>
			<td>Citrate unmasking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge razor blade</td>
			<td>Uline</td>
			<td>H-595B</td>
			<td>Single edge razor blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td>Sodium pyruvate (100 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Cryomolds</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-916</td>
			<td>Disposable cryomolds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-930</td>
			<td>Optimal cutting temperature compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td>Cell impermeant stain (0.4%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>X3P-1GAL</td>
			<td>Xylene</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

maintaining human glioblastoma cellular diversity ex vivo using three-dimensional organoid culture

גליובלסטומה (GBM) היא סרטן המוח הממאיר הראשוני השכיח ביותר עם פרוגנוזה גרועה ביותר. מגוון תאי ומולקולרי תוך-גידולי, כמו גם אינטראקציות מורכבות בין מיקרו-סביבה של גידולים, יכולים להפוך את מציאת הטיפולים היעילים לאתגר. שיטות מסורתיות של תרבות דבק או כדור יכולות להסוות מורכבויות כאלה, בעוד שתרבות אורגנואידית תלת-ממדית יכולה לשחזר שיפועים מיקרו-סביבתיים אזוריים. אורגנואידים הם שיטה של תרבית GBM תלת-ממדית המחקה טוב יותר את ארכיטקטורת הגידול של המטופלים, מכילה אוכלוסיות תאים מגוונות מבחינה פנוטיפית, ויכולה לשמש לניסויים בתפוקה בינונית. למרות שתרבות אורגנואידית תלת-ממדית היא מייגעת וגוזלת זמן רב יותר בהשוואה לתרבות המסורתית, היא מציעה יתרונות ייחודיים ויכולה לשמש לגישור על הפער בין מערכות in vitro ו-in vivo הנוכחיות. אורגנואידים ביססו את עצמם ככלים יקרי ערך בארסנל של ביולוגים של סרטן כדי להבין טוב יותר את התנהגות הגידול ואת מנגנוני העמידות, והיישומים שלהם רק ממשיכים לגדול. כאן, פרטים מסופקים על שיטות ליצירה ושמירה על אורגנואידים GBM. מתוארות גם הוראות כיצד לבצע הטבעה וחיתוך של דגימות אורגנואידים תוך שימוש בטכניקות של הטבעה קפואה ושל פרפין, כמו גם המלצות לפרוטוקולים של אימונוהיסטוכימיה ואימונופלואורסצנציה על מקטעים אורגנואידיים, ומדידה של הכדאיות הכוללת של תאים אורגנואידיים.

איור 1 מראה צמיחה אורגנואידית מוקדמת הנראית באמצעות מיקרוסקופיית אור בהגדלה של פי 10. איור 1A מראה נדידה ופלישה של תאים בודדים דרך lrECM בתצוגה המרכזית. התאים ימשיכו להתרחב ו'ליישב' את ה-lrECM, והם ייראו צפופים יותר ובסופו של דבר אטומים יותר על ידי בדיקה חזותית. איור 1B מראה כמה אורגנואידים בוגרים (בגיל 7 שבועות) ללא הגדלה, יחסית לגודל של אגורה.
איור 2 מדגים צביעה אימונוהיסטוכימית של אורגנואידים מסוג GBM עבור פוספו-היסטון H3, סמן של התפשטות פעילה. רוב התאים המתרבים מאוד נראים בהיקף האורגנואידי בהשוואה לליבה האורגנואידית. מכתים חיוביים יהיו בעלי מראה חום/נחושת.
איור 3 מתאר את התהליך להומוגניזציה ולמדידה של מספר התא הכולל באורגנואידים של GBM באמצעות בדיקת כדאיות תא זוהר ספציפית לתלת-ממד. בשל המספר הגבוה של תאים הנמצאים באורגנואידים GBM, המבנה האורגנואידי הגדול יותר הומוגני בתחילה על ידי טריטורציה במגיב בדיקה זוהר. לאחר מכן שברים מכלל הליזאט האורגנואידי נטענים לתוך בארות בודדות ומדוללים בריאגנט נוסף של בדיקה זוהרת לפני הדגירה והקריאה על קורא צלחות מתאים מרובה בארות.
איור 4 מייצג נתוני בקרה של DMSO (רכב משותף) עבור אורגנואידים. נתונים מתווכים מדגימים עקביות תוך-אורגנואידית ובין-אורגנואידית. נתוני כדאיות זוהרים בדרך כלל מנורמלים לבקרות עבור כל דגימה בעת יצירת נתוני ניסוי.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63745/63745fig01.jpg"> איור 1: מבט דרך מיקרוסקופ אור (10x). (A) צמיחה אורגנואידית מוקדמת המדגימה נדידה/פלישה של תאי GBM לאורך המטריצה החוץ-תאית העשירה בלמינינים. (B) אורגנואידים בוגרים ביחס לגודל של אגורה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63745/63745fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63745/63745fig02.jpg"> איור 2: אימונוהיסטוכימיה של אורגנואידים GBM. (A, B) אורגנואידים GBM המציגים תאים מוכתמים בפוספו-היסטון H3 לשגשוג פעיל. סרגלי קנה מידה הם 600 מיקרומטר ו-300 מיקרומטר עבור A ו-B, בהתאמה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63745/63745fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63745/63745fig03.jpg"> איור 3: פרוטוקול הכדאיות של תאים זוהרים עבור אורגנואידים . (A) להעביר אורגנואידים בודדים לצינורות צנטריפוגות קטנים ולהסיר עודפי מדיה. (B) הוסף 500 μL של 1:1 PBS ותערובת בדיקת כדאיות תאים זוהרת לכל צינור ופיפטה באגרסיביות כדי לפרק את האורגנואיד. (C) הוסף 25 μL של תערובת אורגנואידית זו ו-75 μL של אותה תערובת של 1:1 PBS ובדיקת כדאיות תאים זוהרים לכל באר של צלחת 96 בארות. (D) מניחים על שייקר למשך 2 דקות, ולאחר מכן דגירה למשך 20 דקות ב-RT, ולאחר מכן קוראים לומינסנציה על קורא צלחת. איור שנעשה באמצעות BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63745/63745fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63745/63745fig04.jpg"> איור 4: כדאיות התא. נתוני כדאיות תאים עבור אורגנואידים ב-0.1% דימתיל סולפוקסיד (DMSO) עבור שישה שכפולים טכניים של ארבעה אורגנואידים עבור ארבע דגימות מטופלים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63745/63745fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>רכיב</td>
			<td>כמות</td>
		</tr><tr><td>בינוני נוירובסלי מינוס פנול אדום</td>
			<td>500 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>תוסף B-27 פחות ויטמין A (פי 50)</td>
			<td>10 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>אנטיביוטיקה-אנטי-מיקוטית (100x)</td>
			<td>5 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>נתרן פירובט (100 מ"מ)</td>
			<td>5 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>גלוטמין ב-0.85% NaCl (200 מ"מ)</td>
			<td>5 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>רקומביננטי אנושי FGF בסיסי (250 מיקרוגרם / מ"ל)</td>
			<td>20 מיקרוגרם</td>
		</tr><tr><td>חלבון EFG אנושי רקומביננטי (250 מיקרוגרם למ"ל)</td>
			<td>20 מיקרוגרם</td>
		</tr><tr><td>פנול אדום</td>
			<td>500 מיקרון</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: נוסחה שלמה של מדיום נוירובאזלי (NBMc)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>מגיב</td>
			<td>זמן</td>
		</tr><tr><td>50% אתנול</td>
			<td>3 דק'</td>
		</tr><tr><td>75% אתנול</td>
			<td>3 דק'</td>
		</tr><tr><td>95% אתנול</td>
			<td>3 דק'</td>
		</tr><tr><td>95% אתנול</td>
			<td>4 דק'</td>
		</tr><tr><td>100% אתנול</td>
			<td>2 דק'</td>
		</tr><tr><td>100% אתנול</td>
			<td>3 דק'</td>
		</tr><tr><td>100% אתנול</td>
			<td>4 דק'</td>
		</tr><tr><td>תחליף קסילן</td>
			<td>2 דק'</td>
		</tr><tr><td>תחליף קסילן</td>
			<td>3 דק'</td>
		</tr><tr><td>תחליף קסילן</td>
			<td>4 דק'</td>
		</tr><tr><td>שעוות פרפין</td>
			<td>15 דק'</td>
		</tr><tr><td>שעוות פרפין</td>
			<td>15 דק'</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 2: לוח זמנים לעיבוד אורגנואידים קטנים (בקוטר של פחות מ-3 מ"מ)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>מגיב</td>
			<td>זמן</td>
		</tr><tr><td>50% אתנול</td>
			<td>6 דק'</td>
		</tr><tr><td>75% אתנול</td>
			<td>6 דק'</td>
		</tr><tr><td>95% אתנול</td>
			<td>5 דק'</td>
		</tr><tr><td>95% אתנול</td>
			<td>8 דק'</td>
		</tr><tr><td>100% אתנול</td>
			<td>5 דק'</td>
		</tr><tr><td>100% אתנול</td>
			<td>5 דק'</td>
		</tr><tr><td>100% אתנול</td>
			<td>8 דק'</td>
		</tr><tr><td>תחליף קסילן</td>
			<td>5 דק'</td>
		</tr><tr><td>תחליף קסילן</td>
			<td>5 דק'</td>
		</tr><tr><td>תחליף קסילן</td>
			<td>8 דק'</td>
		</tr><tr><td>שעוות פרפין</td>
			<td>30 דק'</td>
		</tr><tr><td>שעוות פרפין</td>
			<td>30 דק'</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 3: לוח זמנים לעיבוד אורגנואידים גדולים (מעל 3 מ"מ קוטר)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>מגיב</td>
			<td>זמן</td>
		</tr><tr><td>המטוקסילין</td>
			<td>2 דק'</td>
		</tr><tr><td>ריצה diH2O</td>
			<td>2 דק'</td>
		</tr><tr><td>מגיב מבהיר המטוקסילין גרעיני</td>
			<td>1 דקות</td>
		</tr><tr><td>ריצה diH2O</td>
			<td>1 דקות</td>
		</tr><tr><td>ריאגנט בלוינג</td>
			<td>1 דקות</td>
		</tr><tr><td>ריצה diH2O</td>
			<td>2 דק'</td>
		</tr><tr><td>70% אתנול</td>
			<td>1 דקות</td>
		</tr><tr><td>100% אתנול</td>
			<td>1 דקות</td>
		</tr><tr><td>100% אתנול</td>
			<td>1 דקות</td>
		</tr><tr><td>תחליף קסילן</td>
			<td>2 דק'</td>
		</tr><tr><td>תחליף קסילן</td>
			<td>2 דק'</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 4: כתם נגדי של המטוקסילין

Watch this Scientific Journal Video about Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture at JoVE.com

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

במאמר זה אנו מתארים שיטה ליצירת אורגנואידים של גליובלסטומה (GBM) מדגימות של מטופלים ראשוניים או מתרביות תאים שמקורן בחולה, ושמירה עליהם עד לבגרות. אורגנואידים אלה של GBM מכילים אוכלוסיות תאים מגוונות מבחינה פנוטיפית ויוצרים מחדש מיקרו-סביבה של גידולים ex vivo.

שמירה על המגוון התאי של גליובלסטומה אנושית Ex vivo באמצעות תרבית אורגנואידית תלת-ממדית

Glioblastoma (GBM) is the most commonly occurring primary malignant brain cancer with an extremely poor prognosis. Intra-tumoral cellular and molecular ...

מציאת טיפולים לגליובלסטומה היא מאתגרת בגלל המגוון התאי שקיים בגידולים והאינטראקציות בין מיקרו-סביבה מגוונת. אורגנואידים יכולים לעזור לשחזר חלק מהמגוון המרחבי הזה, ואנו יכולים להשתמש בזה כדי להבין טוב יותר את הביולוגיה של הגידולים. בעוד ששיטות מסורתיות של תרביות תאים נוטות לייצר אוכלוסיות תאי גידול הומוגניות, אורגנואידים יכולים לחקות טוב יותר את המגוון המולקולרי והתאי של גליובלסטומה ולמדל טוב יותר אינטראקציות תוך-גופיות.ניתן להשתמש באורגנואידים כדי לחקור את יעילות התרופה ומנגנוני העמידות. התנגדות לטיפולים קליניים עשויה להופיע רק באורגנואידים ולא בתרבות התחום המסורתית, המשקפת את המציאות הקלינית של מחלה זו. אורגנואידים יכולים לעזור להדגים את ההשפעות האזוריות של כימותרפיה.ניתן להשתמש בהם כדי לגלות טיפולים ספציפיים חדשים בנישה, והם יכולים גם לשמש ככלי חיזוי לרפואה מותאמת אישית בעתיד. חלק מהחומרים המשמשים ליצירת אורגנואידים רגישים לטמפרטורה, והזנחת השמירה על חומרים אלה בטמפרטורה הנכונה שלהם עלולה להוביל לקשיים ביצירה או בשמירה על אורגנואידים. התחילו להכין את התבניות האורגנואידיות מתחת לקולט אדים על ידי הורדת נייר השעווה מגיליון הפרפילם והצבתו בין שתי תגובות שרשרת פולימראז סטריליות 96-well או לוחות PCR.ודא כי החלק הפנימי של parafilm נקי. הפעילו לחץ אחיד על הלוח העליון כדי ליצור גומות קטנות בעומק שני מילימטרים בפרפילם מבלי ליצור חורים. מפרידים את הצלחות.הפרפילם הגומה יידבק לצלחת העליונה. לאחר מכן הניחו את הצלחת העליונה על קרח יבש למשך 30 שניות. השתמש במלקחיים סטריליים כדי למשוך את הפרפילם מהצלחת העליונה בתנועה מהירה.פרפילם קפוא קל יותר להסרה. מניחים את תבנית הפרפילם שהושלמה בתבנית מכוסה וסטרילית של תרבית תאים באורך 10 סנטימטרים. כדי להכין את ההשעיה החד-תאית מגליובלסטומה או מתרבית דבק GBM, הסר את המדיה המשומשת מהצלחת.לאחר מכן מוסיפים שני מיליליטר של תמיסת ניתוק תאים בטמפרטורת החדר לצלחת, ודוגרים את הצלחת ב 37 מעלות במשך שלוש דקות. לאחר אישור ניתוק התא מהצלחת מתחת למיקרוסקופ, הוסף שמונה מיליליטר של Neurobasal Medium שלם, או מדיום NBMC, כדי לנטרל את תמיסת ניתוק התא. מסננים את המתלים דרך מסננת תאים אחת של 70 מיקרון.סובבו את התאים בטמפרטורה של 120 פעמים G למשך חמש דקות. לאחר מכן להסיר את supernatant ו resushed את התאים במיליליטר אחד של NBMc. לספור את התאים מן ההשעיה של תא יחיד באמצעות כתם impermeant התא.כדי ליצור אורגנואידים מתרחיף חד-תאי, הוסף כמות מתאימה של מטריצה חוץ-תאית עשירה בלמינין, או lrECM, לתוך צינור צנטריפוגה קטן בדלי קרח או בלוק קר. הכן תערובת תאים המכילה 20, 000 תאים לכל organoid. ערבבו היטב את תערובת תרחיף התאים lrECM כדי למנוע התיישבות של התאים, מה שיגרום להיווצרות אורגנואידית לא אחידה.לאחר מכן, פיפטה בזהירות 20 מיקרוליטר של התערובת על תבנית parafilm כדי ליצור טיפה דמוית פנינה. הקפידו לקרר את קצה הפיפטה כל שניים עד שלושה אורגנואידים כדי למנוע פילמור lrECM. לאחר שמספר האורגנואידים הרצוי יונף על תבנית הפרפילם בצלחת תרבית באורך 10 סנטימטרים, דגרו את האורגנואידים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה עד שעתיים באינקובטור של תרבית תאים.לאחר שהאורגנואידים מתמצקים, שטפו את האורגנואידים בעדינות מתבנית הפרפילם עם מדיום NBMc באמצעות קצה P1000 ואספו אותם לצלחת תרבית חדשה באורך 10 ס"מ המכילה 20 מיליליטר של NBMc. מניחים את צלחת התרבית באינקובטור מבלי לרעוד במשך ארבעה ימים. לאחר ארבעה ימים, החלף את המדיה בצלחת.לשם כך, הניחו פיסת נייר כהה מתחת לצלחת תרבית התא. הטה את הצלחת והמתן 20 שניות. כאשר האורגנואידים מתיישבים לחלוטין בתחתית המנה, מסירים באיטיות את המדיה עם פיפטה זכוכית גדולה הנפתחת.לאחר הוספת מדיה חדשה, מניחים את הצלחת באינקובטור על שייקר מסלולי ב-80 סל"ד, ומחליפים מדיה כל יומיים-שלושה לאחר מכן. הצמיחה של האורגנואיד נצפתה באמצעות מיקרוסקופ אור. במבט המרכזי, גידול אורגנואידים מוקדם הראה נדידה ופלישה חד-תאית דרך lrECM.האורגנואידים הבוגרים בגיל שבעה שבועות היו יחסית לגודל של אגורה. הכתם האימונוהיסטוכימי של האורגנואידים GBM עם פוספו-היסטון H3 חשף תאים מתרבים מאוד עם מראה חום או סגול בהיקף האורגנואידי בהשוואה לליבה. נתוני הכדאיות של התאים עבור אורגנואידים ב-0.1% DMSO הדגימו עקביות תוך-אורגנית ואינטראורגנידית.שימו לב לביומסה אורגנואידית ולהחמצת מדיה. אם האורגנואידים עוברים מדיה מהר מדי, הקפד להחליף את המדיה בתדירות גבוהה יותר או לפצל את האורגנואידים בין צלחות נוספות. אורגנואידים בוגרים יכולים לשמש לניסויים עם טיפולים או מוטבעים ומחולקים לשימוש עם אימונוהיסטוכימיה או אימונופלואורסצנציה.ניתן להשתמש באורגנואידים מנותקים לניתוח FACS. אורגנואידים אלה שימשו לאחרונה בבדיקות תפקודיות תלת-ממדיות כדי לגלות מטרות חיוניות בנישות של תאי גזע סרטניים מובחנים מרחבית. אנחנו גם משתמשים במודלים האלה כדי לתעדף תרופות וטיפולים שונים לפני בדיקות in vivo.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

לשעבר Vivo הדמיה של לימפוציטים מסוג T CD8 תושב באמבריולוגיה הגידול פרוסות משתמש מיקרוסקופיה קונפוקלית

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

קרינה פלואורסצנטית טומוגרפיה מולקולרית עבור הדמיה In Vivo של גליובלסטומה Xenografts

Tumorigenicity is the capability of cancer cells to form a tumor mass. A widely used approach to determine if the cells are tumorigenic is by injecting ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

האורך פיזיולוגיים מורפולוגיים ניטור של Spheroids תלת מימדי הגידול באמצעות טומוגרפיה אופטית קוהרנטית

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

מטריקס מבוסס על גידול אדם במלואו באופן שלוש מימדי הפלישה ספרואיד שיטת

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

הערכת יכולת בידול של העכבר תאים אפיתל הערמונית באמצעות תרבות אורגאיד

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

תרבות משותפת של תאים דמויי גזע גליובלסטומה על נוירונים בדוגמת ללמוד הגירה ואינטראקציות הסלולר

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

מודל ביומימטי תלת מימדי במבחנה של נוירובלסטומה באמצעות פיגומים מבוססי קולגן

Neuroblastoma is the most common extracranial solid tumor in children, accounting for 15% of overall pediatric cancer deaths. The native tumor tissue is a ...

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

אקס ויוו מודל אורגנואידי של מחיקות גנים בתיווך אדנו-וירוס-Cre בתאי אורותל של עכבר

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites ...

Phospholipid Mediator Induced Transformation in Three-Dimensional Cultures

מתווך פוספוליפידים המושרה טרנספורמציה בתרבויות תלת מימדיות

Several models have been developed to study cancer, such as rodent models and established cell lines. Valuable insights into carcinogenesis have been ...

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

תרבית תלת-ממדית של קריפטות המעי הגס של מורין לחקר תפקוד תאי גזע במעיים ex vivo

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of ...