Name: maintaining human glioblastoma cellular diversity ex vivo using three-dimensional organoid culture
Uploaded: 2022-08-25T13:10:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture at JoVE.com

Dr. Justin Lathia'ya paha biçilmez tavsiyeleri ve sürekli desteği için teşekkür ederiz. Ayrıca Katrina Fife, Lisa Wallace ve Maya Camhi'ye mükemmel teknik destekleri için teşekkür ederiz.

<ol>
	<li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma.">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.</a> New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).</li><li>Heffernan, J. M., Sirianni, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+microenvironmental+regulation+of+glioblastoma+stem+cells:+a+biomaterials+perspective.">Modeling microenvironmental regulation of glioblastoma stem cells: a biomaterials perspective.</a> Frontiers in Materials. 5, 7 (2018).</li><li>Zanders, E. D., Svensson, F., Bailey, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapy+for+glioblastoma:+is+it+working.">Therapy for glioblastoma: is it working.</a> Drug Discovery Today. 24 (5), 1193-1201 (2019).</li><li>Hubert, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Three-dimensional+organoid+culture+system+derived+from+human+glioblastomas+recapitulates+the+hypoxic+gradients+and+cancer+stem+cell+heterogeneity+of+tumors+found+in+vivo.">A Three-dimensional organoid culture system derived from human glioblastomas recapitulates the hypoxic gradients and cancer stem cell heterogeneity of tumors found in vivo.</a> Cancer Research. 76 (8), 2465-2477 (2016).</li><li>Lathia, J. D., Heddleston, J. M., Venere, M., Rich, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deadly+teamwork:+neural+cancer+stem+cells+and+the+tumor+microenvironment.">Deadly teamwork: neural cancer stem cells and the tumor microenvironment.</a> Cell Stem Cell. 8 (5), 482-485 (2011).</li><li>Meyer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell-derived+clonal+analysis+of+human+glioblastoma+links+functional+and+genomic+heterogeneity.">Single cell-derived clonal analysis of human glioblastoma links functional and genomic heterogeneity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 851-856 (2015).</li><li>Bao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-like+glioma+cells+promote+tumor+angiogenesis+through+vascular+endothelial+growth+factor.">Stem cell-like glioma cells promote tumor angiogenesis through vascular endothelial growth factor.</a> Cancer Research. 66 (16), 7843-7848 (2006).</li><li>Yu, S. C., Bian, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+cancer+stem+cells+based+on+heterogeneity+of+invasiveness.">Enrichment of cancer stem cells based on heterogeneity of invasiveness.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 5 (1), 66-71 (2009).</li><li>Bao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+stem+cells+promote+radioresistance+by+preferential+activation+of+the+DNA+damage+response.">Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response.</a> Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).</li><li>Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+tumour+stem+cells.">Brain tumour stem cells.</a> Nature Reviews. Cancer. 6 (6), 425-436 (2006).</li><li>Zhu, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+create+a+stem+cell+niche+in+glioblastoma+by+providing+NOTCH+ligands+that+nurture+self-renewal+of+cancer+stem-like+cells.">Endothelial cells create a stem cell niche in glioblastoma by providing NOTCH ligands that nurture self-renewal of cancer stem-like cells.</a> Cancer Research. 71 (18), 6061-6072 (2011).</li><li>Calabrese, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perivascular+niche+for+brain+tumor+stem+cells.">A perivascular niche for brain tumor stem cells.</a> Cancer Cell. 11 (1), 69-82 (2007).</li><li>Charles, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+nitric+oxide+activates+notch+signaling+and+promotes+stem-like+character+in+PDGF-induced+glioma+cells.">Perivascular nitric oxide activates notch signaling and promotes stem-like character in PDGF-induced glioma cells.</a> Cell Stem Cell. 6 (2), 141-152 (2010).</li><li>Seidel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hypoxic+niche+regulates+glioblastoma+stem+cells+through+hypoxia+inducible+factor+2+alpha.">A hypoxic niche regulates glioblastoma stem cells through hypoxia inducible factor 2 alpha.</a> Brain. 133, 983-995 (2010).</li><li>Yan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+cancer+stem+cells+secrete+Gremlin1+to+promote+their+maintenance+within+the+tumor+hierarchy.">Glioma cancer stem cells secrete Gremlin1 to promote their maintenance within the tumor hierarchy.</a> Genes &amp; Development. 28 (10), 1085-1100 (2014).</li><li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+stem+cells+generate+vascular+pericytes+to+support+vessel+function+and+tumor+growth.">Glioblastoma stem cells generate vascular pericytes to support vessel function and tumor growth.</a> Cell. 153 (1), 139-152 (2013).</li><li>Flavahan, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+tumor+initiating+cells+adapt+to+restricted+nutrition+through+preferential+glucose+uptake.">Brain tumor initiating cells adapt to restricted nutrition through preferential glucose uptake.</a> Nature Neuroscience. 16 (10), 1373-1382 (2013).</li><li>Hjelmeland, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidic+stress+promotes+a+glioma+stem+cell+phenotype.">Acidic stress promotes a glioma stem cell phenotype.</a> Cell Death and Differentiation. 18 (5), 829-840 (2011).</li><li>Bar, E. E., Lin, A., Mahairaki, V., Matsui, W., Eberhart, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+increases+the+expression+of+stem-cell+markers+and+promotes+clonogenicity+in+glioblastoma+neurospheres.">Hypoxia increases the expression of stem-cell markers and promotes clonogenicity in glioblastoma neurospheres.</a> The American Journal of Pathology. 177 (3), 1491-1502 (2010).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-inducible+factors+regulate+tumorigenic+capacity+of+glioma+stem+cells.">Hypoxia-inducible factors regulate tumorigenic capacity of glioma stem cells.</a> Cancer Cell. 15 (6), 501-513 (2009).</li><li>Azzarelli, R., Ori, M., Philpott, A., Simons, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+model+of+glioblastoma+by+co-culturing+tumor+stem+cells+with+human+brain+organoids.">Three-dimensional model of glioblastoma by co-culturing tumor stem cells with human brain organoids.</a> Biology Open. 10 (2), 056416 (2021).</li><li>Linkous, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+patient-derived+glioblastoma+with+cerebral+organoids.">Modeling patient-derived glioblastoma with cerebral organoids.</a> Cell Reports. 26 (12), 3203-3211 (2019).</li><li>da Silva, B., Mathew, R. K., Polson, E. S., Williams, J., Wurdak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+glioblastoma+spheroid+infiltration+of+early-stage+cerebral+organoids+models+brain+tumor+invasion.">Spontaneous glioblastoma spheroid infiltration of early-stage cerebral organoids models brain tumor invasion.</a> SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R &amp; D. 23 (8), 862-868 (2018).</li><li>Jacob, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Patient-derived+glioblastoma+organoid+model+and+biobank+recapitulates+inter-+and+intra-tumoral+heterogeneity.">A Patient-derived glioblastoma organoid model and biobank recapitulates inter- and intra-tumoral heterogeneity.</a> Cell. 180 (1), 188-204 (2020).</li><li>Boretto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+from+endometrial+disease+capture+clinical+heterogeneity+and+are+amenable+to+drug+screening.">Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening.</a> Nature Cell Biology. 21 (8), 1041-1051 (2019).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ductal+pancreatic+cancer+modeling+and+drug+screening+using+human+pluripotent+stem+cell-and+patient-derived+tumor+organoids.">Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell-and patient-derived tumor organoids.</a> Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).</li><li>Ledur, P. F., Onzi, G. R., Zong, H., Lenz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+conditions+defining+glioblastoma+cells+behavior:+what+is+the+impact+for+novel+discoveries.">Culture conditions defining glioblastoma cells behavior: what is the impact for novel discoveries.</a> Oncotarget. 8 (40), 69185-69197 (2017).</li><li>Lenin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+drug+screening+pipeline+using+2D+and+3D+patient-derived+in+vitro+models+for+preclinical+analysis+of+therapy+response+in+glioblastoma.">A drug screening pipeline using 2D and 3D patient-derived in vitro models for preclinical analysis of therapy response in glioblastoma.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (9), 4322 (2021).</li><li>Rybin, M. J., Ivan, M. E., Ayad, N. G., Zeier, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+glioblastoma+and+their+role+in+drug+discovery.">Organoid models of glioblastoma and their role in drug discovery.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 15 (4), 605255 (2021).</li><li>Shakya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+lipid+metabolism+marks+glioblastoma+stem+and+non-stem+cells+in+separate+tumor+niches.">Altered lipid metabolism marks glioblastoma stem and non-stem cells in separate tumor niches.</a> Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 101 (2021).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+stem+cells+derived+from+glioblastomas+cultured+in+bFGF+and+EGF+more+closely+mirror+the+phenotype+and+genotype+of+primary+tumors+than+do+serum-cultured+cell+lines.">Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines.</a> Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).</li><li>Bian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+engineered+cerebral+organoids+model+brain+tumor+formation.">Genetically engineered cerebral organoids model brain tumor formation.</a> Nature Methods. 15 (8), 631-639 (2018).</li><li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+cerebral+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).</li><li>Sundar, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+organoid+culture+unveils+resistance+to+clinical+therapies+in+adult+and+pediatric+glioblastoma.">Three-dimensional organoid culture unveils resistance to clinical therapies in adult and pediatric glioblastoma.</a> Translational Oncology. 15 (1), 101251 (2021).</li></ol>

Yazarların açıklanacak herhangi bir çatışması yoktur.

GBM organoidleri, daha büyük hücresel ve mikroçevresel heterojenliği içeren geleneksel kürelere tamamlayıcı bir kültür yöntemidir 4,22,30. Daha fazla zaman ve kaynak yoğun olmasına rağmen, organoid kültür, tümör içi davranış ve ilaç direnci mekanizmaları hakkında değerli bilgiler sunabilir.
GBM, CSC 5,31'lik bir popülasyon tarafından yönlendirilmektedir ve bu yöntemler, buCSC popülasyonunun sürekli büyümesine ve kendini yenilemesine izin vermek için geliştirilmiştir. Epidermal büyüme faktörü (EGF) ve fibroblast büyüme faktörünün (FGF) kök hücre bakımını ve büyümesini arttırdığı ve aktif reseptör tirozin kinaz (RTK) sinyallemesi sağladığı bilinmektedir. GBM tümörleri içinde heterojen hücresel popülasyonların ve farklı tümör mikroortamlarının oluşumu, CSC davranışlarını desteklemeye dayanır. Bir lrECM seçimi, laminin bakımından zengin beyin ortamını taklit eder ve organoid kültürdeki hücrelerin kendi kendini organize etmesini ve istila yoluyla göç etmesini destekler. Her ne kadar bazı gruplar lrECM veya EGF / FGF zenginleştirilmiş medya24,28 kullanmadan organoid kültürü kurmuş olsalar da, bu kültür yönteminin daha zaman verimli bir yolunu ve büyümeyi yönlendirmek için onkojenik sinyallemenin daha güçlü seçimini sunabilir, bu yöntemler organoidlerin hücresel heterojenliğini en iyi şekilde oluşturmak için pro-kök hücre ortamını optimize etmek için seçilmiştir. Hem serebral organoidler hem de GBM organoidleri literatürde daha önce21,32,33 lrECM ile yapılmıştır. Organoidlerde bulunan tümör popülasyonları ve mekansal varyasyon ile ilgili veriler oluşturmamıza rağmen, organoidler içindeki tümör dışı popülasyonlar ve orijinal hasta örneklerinden ne kadar süre hayatta kaldıkları hakkında daha az şey bilinmektedir. Bazı IHC lekeleri (CD45 gibi) bu verileri sağlayabilir ve gelecekte organoidlerle ilgili ilginç bir araştırma noktası olabilir.
Organoid kültürün kullanım amacının bilinmesi, uygun yöntemlerin seçilmesi açısından önemlidir. Belirli deneyler için büyüyen üniform organoidlere karşı birincil örneklerden organoidlerin oluşturulması biraz farklı prosedürlere sahiptir. Organoidlerin lrECM iskelesinde nasıl olgunlaştığını ve görsel olarak nasıl doldurduğunu takdir etmek, organoid kültüre uygun zaman ve kaynakları tahsis edebilmek için önemlidir. Organoidlerdeki hücrelerin seyrek bölgeleri, numunenin davranışına bağlı olarak 2-8 hafta arasında herhangi bir yerde alabilen lrECM'yi doldurmak için yavaşça genişleyecek ve büyüyecektir. Bu büyüme oranı, her bir numuneye biraz özgüdür; farklı organoid grupları arasında korunur ve küre büyümesinin göreceli hızı ile oldukça tutarlıdır. Organoidler 1 yıldan fazla korunabilir ve ksenogreftte farelere tümör oluşum yeteneklerini koruyabilir; ancak, laboratuvar kaynaklarını (hem malzeme hem de zaman) boşa harcamamak için ayrı bir amaçla yetiştirilmeleri önerilir4. Organoid büyümesi birden fazla kuyucuk boyutu ve formatında test edilmiştir ve 10 cm'lik bir plakanın optimal hücre canlılığını korumak için ideal ayar olduğunu, ardından kuyu başına üç organoid içeren 6 delikli bir plakanın34 olduğunu göstermektedir. Organoidler, iki boyutlu kültür muadillerine kıyasla daha fazla ortam tüketir ve daha küçük bir kuyu formatı kullanmak uygun bakıma yol açmaz. Örneğin, 96 delikli formattaki bir plakanın bir kuyusu, organoid büyümeyi sürdürmek için bir organoidin boyutuna göre yeterli alana veya ortam hacmine sahip değildir.
Organoidlerin kurduğu gibi, gözlemci olmak başarıyı arttırmak için önemlidir. Başlangıçta, organoidler medyayı yavaş tüketir, ancak daha yoğun ve daha olgun hale geldikçe, medyayı daha hızlı tüketirler. Medyaya fenol kırmızısı eklemek, medya tüketiminin bir göstergesi olarak hizmet etmeye yardımcı olabilir. Medya daha sarı olduğunda, daha yüksek hacimli bir ortam değişimi, plakadaki toplam ortam miktarını artırmak, organoidleri büyümelerine ayak uydurmak için çoklu hücre kültürü plakaları arasında bölmek veya hatta deneyler için zaman çizelgesini ayarlamak için besleme düzenini ayarlamamızı isteyebilir. 
Birçok yönden, organoidler kanser araştırması yapmanın verimsiz bir yoludur. Uzun zaman ölçekleri içerirler ve GBM küre kültürüne kıyasla pahalı ve kaynak ağırlıklıdırlar. Bununla birlikte, hücresel ve mikro çevresel çeşitliliği yeniden yaratmak için alternatif bir yöntem olan hasta kaynaklı ksenogreftlerle karşılaştırıldığında, daha basit, daha ucuz ve kontrol edilebilirler. Organoidlerin en iyi ne zaman kullanılacağının seçimi kanser araştırmacıları için önemlidir. Geleneksel kürenin veya bağlı kültürün yerini alması ve ksenogreft modellerinin yerini alması amaçlanmamıştır. Organoidler, doğru bilimsel soruya uygulandığında, her iki sistemin faydalarını birleştirebilir ve aksi takdirde gizli kalacak tümör hücresi biyolojisini gözlemlememize izin verebilir. Bilimsel topluluk, organoidlerin hangi öğrenme fırsatlarını sunduğunu anlamaya yeni başlıyor, ancak gelecekte GBM'nin karmaşık biyolojisini anlamak için paha biçilmez bir araç olacakları açık.

Glioblastoma (GBM), tanıdan itibaren yaklaşık 15 aylık korkunç bir prognozu olan en sık görülen primer beyin tümörüdür1. Preklinik çalışmalarda etkili olan tedaviler genellikle hastalarda zayıf etkili olabilir 2,3. Zayıf klinik yanıt, GBM'nin mikroçevresel heterojenliği ve karmaşık tümöral içi etkileşimler de dahil olmak üzere birçok faktöre atfedilir. Bunların, geleneksel yapışkan veya küre kültürü yöntemleriyle laboratuvar ortamında yeniden oluşturulması zor olabilir4. GBM içinde kendi kendini yenileyen kanser kök hücrelerinin (CSC'ler) bir alt kümesinin varlığı da bu karmaşıklığa katkıda bulunabilir 5,6. CSC'ler tümör yayılımı için çok önemlidir ve aktif anjiyogenezi, kanser invazyonunu ve radyasyon dahil tedavilere direnci teşvik ederek tümör büyümesini sürdürür 7,8,9. CSC'ler tümörler boyunca eşit olarak dağılmamıştır, bunun yerine perivasküler niş ve perinekrotik bölgeler de dahil olmak üzere belirli mikro ortamlar içinde zenginleştirilmiştir ve her biri hücresel durumlarının10,11,12,13,14 farklı moleküler düzenlemesini sağlar. CSC'ler mikroçevresel ipuçlarının pasif alıcıları değildir, bunun yerine kendi mikro ortamlarını yeniden şekillendirme yeteneğine sahiptir 7,15,16. Bir CSC'nin mikro ortamı, besin kıtlığı, pH ve hipoksi17,18,19,20 gibi baskılara yanıt olarak kök hücre durumunun korunmasını teşvik edebilir ve bu koşulların model bir sistemde önemini düşündürmektedir. Bu nedenle, tümörlerdeki çeşitli hücresel mikro ortamın özetlenmesi, terapötik direnci anlamak ve yeni tedavileri tanımlamak için kritik öneme sahiptir.
Üç boyutlu kültürün popülaritesi son yıllardaartmıştır 21,22. Organoidler diğer kanser türlerinde kullanılmıştır ve hücreleri organoidler olarak tutmanın birincil amacı, heterojen hücre popülasyonlarının (birçoğu normalde daha homojen küre kültüründe rekabet edebilir) ve genetik özgüllüğe sahip bölgesel tümör mikro ortamları olarak görülen mekansal çeşitliliğin büyümesine izin vermektir 4,23,24,25,26 . Kanser hücrelerinin üç boyutlu kültürü için birçok yöntem vardır, bunların her birinin avantajları ve dezavantajları vardır27,28,29. Organoid kültürün, geleneksel yapışkan veya küre kültürünün yerini alması amaçlanmamıştır. Hücre mikroçevresi ile tümör hücresi yanıtları arasındaki etkileşimin kritik olduğu spesifik sorular olduğunda iki boyutlu yöntemlere tamamlayıcı bir teknik olarak en iyi şekilde kullanılır.
Bu makalede, birincil hasta örneklerinden veya hasta kaynaklı kültürlerden GBM organoidleri oluşturmak için güvenilir ve tekrarlanabilir yöntemler açıklanmaktadır. Üç boyutlu organoid kültür için iki farklı hedefi ele alıyoruz: (1) birincil hasta dokusundan, tekdüzelikten bağımsız olarak maksimum engraftment potansiyeline sahip organoidlerin oluşturulması veya (2) daha kantitatif deneysel kullanım için üniform organoidlerin yetiştirilmesi. Birincil bir örneği organoidler olarak oluştururken, tek hücreler için filtrelemek veya hücreleri saymak gerekli değildir, çünkü başlangıç kültürünü oluşturmak için maksimum hücre sayılarını ve türlerini korumak bir önceliktir. Bununla birlikte, karşılaştırmalı deneyler için organoidler yetiştirilirken, replikasyon organoidlerinin deneysel tutarlılık için karşılaştırılabilir olmasını sağlamak için tek hücreli filtrasyon ve hücre sayımı gereklidir. Bu protokol, organoid kültürlerin nasıl oluşturulacağını ve üniform organoidlerin nasıl oluşturulacağını, ayrıca organoidlerin gömülmesi ve korunması için rafine edilmiş yöntemleri ve immünohistokimya, immünofloresan ve GBM organoidlerinde toplam hücre canlılığının değerlendirilmesi dahil olmak üzere standart hücre kültürü deneylerini detaylandırmaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3,3-Diaminobenzidine (DAB) tablets</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>08980681</td>
			<td>3,3-Diaminobenzidine (DAB) tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR plates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>96-well PCR plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>SCR005</td>
			<td>Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td>Antibiotic-antimycotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement minus vitamin A</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12587001</td>
			<td>B-27 supplement minus vitamin A (50x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelCode Blue Stain Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>24590</td>
			<td>Bluing reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer (70 &#181;m)</td>
			<td>CellTreat Scientific</td>
			<td>229483</td>
			<td>Cell strainer (70 &#181;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo 3D</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9681</td>
			<td>Luminescent cell viability assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clarifier 2</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>7301</td>
			<td>Nuclear hematoxylin clarifying reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear-Rite 3</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>6901</td>
			<td>xylene substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia Gill 2 Hematoxylin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>72504</td>
			<td>Hematoxylin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine in 0.85% NaCl</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Glutamine in 0.85% NaCl (200 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>354234</td>
			<td>Laminin-enriched extracellular matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini PAP pen</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>008877</td>
			<td>Hydrophobic barrier pen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>22-050-102</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal media minus phenol red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12349015</td>
			<td>Neurobasal media minus phenol red (500 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum (NDS)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td>Normal donkey serum (NDS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 4% in PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td>Paraformaldehyde 4% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0290</td>
			<td>Phenol red (0.5%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P10144</td>
			<td>Liquid curing mountant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human EGF protein</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>236-EG-01M</td>
			<td>Recombinant human EGF protein (250 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human FGF basic</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>4144-TC-01</td>
			<td>Recombinant human FGF basic (250 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SignalStain Antibody Diluent</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>8112</td>
			<td>Antibody diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SignalStain Boost IHC Detection Reagent</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>8114</td>
			<td>Immunohistochemistry detection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SignalStain Citrate Unmasking Solution</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>14746</td>
			<td>Citrate unmasking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge razor blade</td>
			<td>Uline</td>
			<td>H-595B</td>
			<td>Single edge razor blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td>Sodium pyruvate (100 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Cryomolds</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-916</td>
			<td>Disposable cryomolds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-930</td>
			<td>Optimal cutting temperature compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td>Cell impermeant stain (0.4%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>X3P-1GAL</td>
			<td>Xylene</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

maintaining human glioblastoma cellular diversity ex vivo using three-dimensional organoid culture

Glioblastoma (GBM), son derece kötü prognozu ile en sık görülen primer malign beyin kanseridir. İntra-tümöral hücresel ve moleküler çeşitliliğin yanı sıra tümör mikro ortamları arasındaki karmaşık etkileşimler, etkili tedaviler bulmayı zorlaştırabilir. Geleneksel yapışkan veya küre kültürü yöntemleri bu tür karmaşıklıkları maskeleyebilirken, üç boyutlu organoid kültür bölgesel mikro çevresel gradyanları özetleyebilir. Organoidler, hasta tümör mimarisini daha iyi taklit eden, fenotipik olarak çeşitli hücre popülasyonları içeren ve orta verimli deneyler için kullanılabilen üç boyutlu GBM kültürünün bir yöntemidir. Üç boyutlu organoid kültür, geleneksel kültüre kıyasla daha zahmetli ve zaman alıcı olmasına rağmen, benzersiz faydalar sunar ve akım in vitro ve in vivo sistemler arasındaki boşluğu kapatmaya hizmet edebilir. Organoidler, tümör davranışını ve direnç mekanizmalarını daha iyi anlamak için kanser biyologlarının cephaneliğinde paha biçilmez araçlar olarak kendilerini kanıtlamışlardır ve uygulamaları sadece büyümeye devam etmektedir. Burada, GBM organoidlerinin üretilmesi ve bakımı için yöntemler hakkında ayrıntılı bilgi verilmektedir. Hem dondurulmuş hem de parafin gömme teknikleri kullanılarak organoid numune gömme ve bölümlemenin nasıl yapılacağına dair talimatların yanı sıra organoid kesitlerde immünohistokimya ve immünofloresan protokolleri için öneriler ve toplam organoid hücre canlılığının ölçülmesi de açıklanmaktadır.

Şekil 1 , ışık mikroskobu ile 10x büyütmede görülen erken organoid büyümeyi göstermektedir. Şekil 1A, merkez görünümde lrECM aracılığıyla tek hücrelerin göçünü ve istilasını göstermektedir. Hücreler lrECM'yi genişletmeye ve 'kolonize etmeye' devam edecek ve görsel inceleme ile daha yoğun ve sonunda opak görünecekler. Şekil 1B, bir kuruşun boyutuna göre büyütme olmadan birkaç olgun organoid (7 haftada) göstermektedir.
Şekil 2 , aktif proliferasyonun bir belirteci olan fosfo-histon H3 için GBM organoidlerinin immünohistokimyasal boyanmasını göstermektedir. En yüksek proliferatif hücreler, organoid çekirdeğe kıyasla organoid çevrede görülür. Pozitif boyama kahverengi/bakır bir görünüme sahip olacaktır.
Şekil 3, GBM organoidlerindeki toplam hücre sayısını, 3D'ye özgü ışıldayan hücre canlılığı testi kullanarak homojenize etme ve ölçme işlemini açıklamaktadır. GBM organoidlerinde bulunan çok sayıda hücre nedeniyle, daha büyük organoid yapı başlangıçta ışıldayan tahlil reaktifinde tritüre edilerek homojenize edilir. Daha sonra toplam organoid lizatın fraksiyonları ayrı kuyucuklara yüklenir ve inkübasyondan ve uygun bir çok kuyucuklu plaka okuyucuda okunmadan önce ek ışıldayan tahlil reaktifi ile seyreltilir.
Şekil 4 , organoidler için DMSO (ortak araç) kontrol verilerini temsil etmektedir. Çizilen veriler intra-organoid ve inter-organoid tutarlılığı göstermektedir. Işıldayan canlılık verileri tipik olarak deneysel veriler üretilirken her numune için kontrollere normalleştirilecektir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63745/63745fig01.jpg"> Şekil 1: Işık mikroskobundan görünüm (10x). (A) Laminin bakımından zengin hücre dışı matriks boyunca GBM hücrelerinin göçünü / istilasını gösteren erken organoid büyüme. (B) Bir kuruşun büyüklüğüne göre olgun organoidler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63745/63745fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63745/63745fig02.jpg"> Şekil 2: GBM organoidlerinin immünohistokimyası. (A, B) Aktif proliferasyon için fosfo-histon H3 boyalı hücreleri gösteren GBM organoidleri. Ölçek çubukları, A ve B için sırasıyla 600 μm ve 300 μm'dir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63745/63745fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63745/63745fig03.jpg"> Şekil 3: Organoidler için ışıldayan hücre canlılığı protokolü . (A) Tek tek organoidleri küçük santrifüj tüplerine taşıyın ve fazla ortamı çıkarın. (B) Organoidi parçalamak için her tüpe ve pipete agresif bir şekilde 500 μL 1:1 PBS ve ışıldayan hücre canlılığı testi karışımı ekleyin. (C) Bu organoid karışımın 25 μL'sini ve aynı 1: 1 PBS ve ışıldayan hücre canlılığı tahlil karışımının 75 μL'sini 96 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna ekleyin. (D) 2 dakika boyunca bir çalkalayıcıya yerleştirin, ardından RT'de 20 dakika inkübasyon yapın ve ardından bir plaka okuyucuda ışıltıyı okuyun. Şekil BioRender.com kullanılarak yapılmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63745/63745fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63745/63745fig04.jpg"> Şekil 4: Hücre canlılığı. Dört hasta örneği için dört organoidin altı teknik kopyası için% 0.1 dimetil sülfoksit (DMSO) içindeki organoidler için hücre canlılığı verileri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63745/63745fig04large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Parça</td>
			<td>Miktar</td>
		</tr><tr><td>Nörobazal orta eksi fenol kırmızı</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr><tr><td>B-27 takviyesi eksi A vitamini (50x)</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr><tr><td>Antibiyotik-antimikotik (100x)</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr><tr><td>Sodyum piruvat (100 mM)</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr><tr><td>%0.85 NaCl (200 mM) cinsinden glutamin</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr><tr><td>Rekombinant insan FGF bazik (250 μg/mL)</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr><tr><td>Rekombinant insan EFG proteini (250 μg/mL)</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr><tr><td>Fenol kırmızısı</td>
			<td>500 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: Nörobazal ortam tam (NBMc) formülasyonu
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reaktif</td>
			<td>Saat</td>
		</tr><tr><td>%50 Etanol</td>
			<td>3 dk</td>
		</tr><tr><td>%75 Etanol</td>
			<td>3 dk</td>
		</tr><tr><td>%95 Etanol</td>
			<td>3 dk</td>
		</tr><tr><td>%95 Etanol</td>
			<td>4 dk</td>
		</tr><tr><td>%100 Etanol</td>
			<td>2 dk</td>
		</tr><tr><td>%100 Etanol</td>
			<td>3 dk</td>
		</tr><tr><td>%100 Etanol</td>
			<td>4 dk</td>
		</tr><tr><td>Ksilen ikamesi</td>
			<td>2 dk</td>
		</tr><tr><td>Ksilen ikamesi</td>
			<td>3 dk</td>
		</tr><tr><td>Ksilen ikamesi</td>
			<td>4 dk</td>
		</tr><tr><td>Parafin balmumu</td>
			<td>15 dk</td>
		</tr><tr><td>Parafin balmumu</td>
			<td>15 dk</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 2: Küçük organoidler için işleme programı (çapı 3 mm'nin altında)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reaktif</td>
			<td>Saat</td>
		</tr><tr><td>%50 Etanol</td>
			<td>6 dk</td>
		</tr><tr><td>%75 Etanol</td>
			<td>6 dk</td>
		</tr><tr><td>%95 Etanol</td>
			<td>5 dk</td>
		</tr><tr><td>%95 Etanol</td>
			<td>8 dk</td>
		</tr><tr><td>%100 Etanol</td>
			<td>5 dk</td>
		</tr><tr><td>%100 Etanol</td>
			<td>5 dk</td>
		</tr><tr><td>%100 Etanol</td>
			<td>8 dk</td>
		</tr><tr><td>Ksilen ikamesi</td>
			<td>5 dk</td>
		</tr><tr><td>Ksilen ikamesi</td>
			<td>5 dk</td>
		</tr><tr><td>Ksilen ikamesi</td>
			<td>8 dk</td>
		</tr><tr><td>Parafin balmumu</td>
			<td>30 dk</td>
		</tr><tr><td>Parafin balmumu</td>
			<td>30 dk</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 3: Büyük organoidler için işleme programı (çapı 3 mm'nin üzerinde)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reaktif</td>
			<td>Saat</td>
		</tr><tr><td>Hematoksilen</td>
			<td>2 dk</td>
		</tr><tr><td>Koşu diH2O</td>
			<td>2 dk</td>
		</tr><tr><td>Nükleer hematoksilin berraklaştırıcı reaktif</td>
			<td>1 dk</td>
		</tr><tr><td>Koşu diH2O</td>
			<td>1 dk</td>
		</tr><tr><td>Bluing Reaktifi</td>
			<td>1 dk</td>
		</tr><tr><td>Koşu diH2O</td>
			<td>2 dk</td>
		</tr><tr><td>%70 etanol</td>
			<td>1 dk</td>
		</tr><tr><td>%100 etanol</td>
			<td>1 dk</td>
		</tr><tr><td>%100 etanol</td>
			<td>1 dk</td>
		</tr><tr><td>Ksilen ikamesi</td>
			<td>2 dk</td>
		</tr><tr><td>Ksilen ikamesi</td>
			<td>2 dk</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 4: Hematoksilin karşı boyası

Watch this Scientific Journal Video about Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture at JoVE.com

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

Burada, birincil hasta örneklerinden veya hasta kaynaklı hücre kültürlerinden glioblastoma (GBM) organoidleri üretme ve olgunluğa kadar sürdürme yöntemini açıklıyoruz. Bu GBM organoidleri fenotipik olarak çeşitli hücre popülasyonları içerir ve tümör mikroortamlarını ex vivo olarak yeniden yaratır.

Üç Boyutlu Organoid Kültür Kullanarak İnsan Glioblastoma Hücresel Çeşitliliğinin Ex vivo Korunması

Glioblastoma (GBM) is the most commonly occurring primary malignant brain cancer with an extremely poor prognosis. Intra-tumoral cellular and molecular ...

Glioblastoma için tedavi bulmak, tümörlerde var olan hücresel çeşitlilik ve çeşitli mikro ortamlar arasındaki etkileşimler nedeniyle zordur. Organoidler bu mekansal çeşitliliğin bir kısmını yeniden yaratmaya yardımcı olabilir ve bunu tümörlerin biyolojisini daha iyi anlamak için kullanabiliriz. Geleneksel hücre kültürü yöntemleri homojen tümör hücresi popülasyonları üretme eğilimindeyken, organoidler glioblastomun moleküler ve hücresel çeşitliliğini daha iyi taklit edebilir ve intratümöral etkileşimleri daha iyi modelleyebilir.Organoidler ilaç etkinliğini ve direnç mekanizmalarını araştırmak için kullanılabilir. Klinik tedavilere direnç, bu hastalığın klinik gerçekliğini yansıtan geleneksel küre kültüründe değil, sadece organoidlerde ortaya çıkabilir. Organoidler, kemoterapilerin bölgesel etkilerini göstermeye yardımcı olabilir.Yeni niş spesifik terapileri keşfetmek için kullanılabilirler ve gelecekte kişiselleştirilmiş tıp için öngörücü bir araç olarak da hareket edebilirler. Organoidleri oluşturmak için kullanılan bazı malzemeler sıcaklığa duyarlıdır ve bu malzemeleri uygun sıcaklıklarında tutmayı ihmal etmek, organoidlerin oluşturulmasında veya korunmasında zorluklara yol açabilir. Balmumu kağıdını parafilm tabakasından çıkarıp iki steril 96 delikli polimeraz zincir reaksiyonu veya PCR plakası arasına yerleştirerek organoid kalıpları bir kültür başlığı altında hazırlamaya başlayın.Parafilmin içinin temiz olduğundan emin olun. Parafilmde delik açmadan iki milimetre derinliğinde küçük çukurlar oluşturmak için üst plakaya eşit basınç uygulayın. Plakaları ayırın.Çukurlu parafilm üst plakaya yapışacaktır. Ardından üst plakayı 30 saniye boyunca kuru buz üzerine yerleştirin. Parafilmi üst plakadan hızlı bir hareketle çekmek için steril forseps kullanın.Dondurulmuş parafilmin çıkarılması daha kolaydır. Tamamlanan parafilm kalıbını kaplı, steril 10 santimetrelik bir hücre kültürü kabına yerleştirin. Tek hücreli süspansiyonu glioblastoma veya GBM yapışkan kültürden hazırlamak için, kullanılan ortamı plakadan çıkarın.Daha sonra plakaya oda sıcaklığında iki mililitre hücre ayırma çözeltisi ekleyin ve plakayı üç dakika boyunca 37 derecede inkübe edin. Mikroskop altında plakadan hücre ayrılmasını doğruladıktan sonra, hücre ayrılma çözeltisini nötralize etmek için sekiz mililitre Nörobazal Orta tam veya NBMc ortamı ekleyin. Süspansiyonu 70 mikronluk tek bir hücre süzgecinden süzün.Hücreleri beş dakika boyunca 120 kez G'de döndürün. Daha sonra süpernatantı çıkarın ve hücreleri bir mililitre NBMc'de yeniden askıya alın.Tek hücreli bir süspansiyondan organoidler yapmak için, bir buz kovasında veya soğuk blokta küçük bir santrifüj tüpüne uygun miktarda laminin bakımından zengin hücre dışı matris veya lrECM ekleyin. Organoid başına 20.000 hücre içeren bir hücre karışımı hazırlayın. Hücrelerin yerleşmesini önlemek için lrECM hücre süspansiyon karışımını iyice karıştırın, bu da düzgün olmayan organoid oluşumuna neden olur.Daha sonra, inci benzeri bir damlacık oluşturmak için karışımın 20 mikrolitresini bir parafilm kalıbına dikkatlice pipetleyin. LrECM polimerizasyonunu önlemek için pipet ucunu her iki ila üç organoidde bir soğuttuğunuzdan emin olun. İstenilen sayıda organoid, 10 santimetrelik bir kültür plakasında parafilm kalıbına pipetlendikten sonra, organoidleri bir hücre kültürü inkübatöründe bir ila iki saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.Organoidler katılaştıktan sonra, organoidleri bir P1000 ucu kullanarak NBMc ortamı ile parafilm kalıbından yavaşça yıkayın ve bunları 20 mililitre NBMc içeren yeni bir 10 santimetrelik kültür plakasına toplayın. Dört gün sonra, plakadaki ortamı değiştirin.Bunu yapmak için, hücre kültürü plakasının altına bir parça koyu renkli kağıt yerleştirin. Plakayı eğin ve 20 saniye bekleyin. Organoidler kabın dibine tamamen yerleştikçe, ortamı büyük açılı bir cam pipetle yavaşça çıkarın.Yeni medya ekledikten sonra, plakayı inkübatöre 80 RPM'de bir yörüngesel çalkalayıcı üzerine yerleştirin ve bundan sonra her iki ila üç günde bir ortam alışverişinde bulunun. Organoidin büyümesi ışık mikroskobu kullanılarak gözlendi. Merkez görünümde, erken organoid büyümesi lrECM yoluyla göç ve tek hücreli invazyon gösterdi.Yedi haftadaki olgun organoidler bir kuruşun büyüklüğüne göreydi. GBM organoidlerinin fosfo-histon H3 ile immünohistokimyasal boyanması, organoid çevrede çekirdeğe kıyasla kahverengi veya mor görünümlü oldukça proliferatif hücreler ortaya çıkardı. %0.1 DMSO'daki organoidler için hücre canlılığı verileri, intraorganoid ve interorganoid tutarlılık göstermiştir.Organoid biyokütle ve medya asitlenmesine dikkat edin. Organoidler ortamdan çok hızlı geçiyorsa, medyayı daha sık değiştirdiğinizden veya organoidleri ek plakalar arasında böldüğünüzden emin olun. Olgun organoidler, terapilerle yapılan deneyler için kullanılabilir veya immünohistokimya veya immünofloresan ile kullanım için gömülü ve kesitli olarak kullanılabilir.Ayrışmış organoidler FACS analizi için kullanılabilir. Bu organoidler son zamanlarda mekansal olarak farklı kanser kök hücre nişlerinde gerekli olan hedefleri keşfetmek için üç boyutlu fonksiyonel taramada kullanılmıştır. Bu modelleri, in vivo testlerden önce farklı ilaçlara ve tedavilere öncelik vermek için de kullanıyoruz.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo İnsan akciğer tümörü içinde ikamet CD8 T lenfositlerin görüntüleme Confocal mikroskobu kullanma dilim

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Floresans moleküler tomografi Glioblastoma Xenografts in Vivo içinde görüntüleme için

Tumorigenicity is the capability of cancer cells to form a tumor mass. A widely used approach to determine if the cells are tumorigenic is by injecting ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

Boyuna morfolojik ve fizyolojik izleme optik koherens tomografi kullanarak üç boyutlu tümör pulcuklarının

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Üç boyutlu Küroid Istilası tahlil tam ınsan tümör tabanlı matris

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

Organoid Kültürü Kullanarak Fare Prostat Epitel Hücrelerinin Ayırt Etme Kapasitesinin Değerlendirilmesi

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

Göç ve Hücresel Etkileşimleri İncelemek İçin Desenli Nöronlarda Glioblastoma Kök Benzeri Hücrelerin Ortak Kültürü

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

Kollajen Bazlı İskeleler Kullanılarak Nöroblastomun Üç Boyutlu İn Vitro Biyomimetik Modeli

Neuroblastoma is the most common extracranial solid tumor in children, accounting for 15% of overall pediatric cancer deaths. The native tumor tissue is a ...

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Eski Vivo Fare Ürotelyal Hücrelerinde Adenovirüs-Cre Aracılı Gen Delesyonlarının Organoid Modeli

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites ...

Phospholipid Mediator Induced Transformation in Three-Dimensional Cultures

Üç Boyutlu Kültürlerde Fosfolipid Aracısı İndüklenmiş Transformasyon

Several models have been developed to study cancer, such as rodent models and established cell lines. Valuable insights into carcinogenesis have been ...

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

Bağırsak Kök Hücre Fonksiyonunu Incelemek için Murin Kolonik Kriptlerinin Üç Boyutlu Kültürü Ex Vivo

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of ...