Name: effect of hyaluronic acid 35 kda on an in vitro model of preterm small intestinal injury and healing using enteroid-derived monolayers
Uploaded: 2022-07-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers at JoVE.com

Dette indhold er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra National Institutes of Health. HC er støttet af tilskud P20GM134973 fra National Institutes of Health. KB er støttet af en Children's Hospital Foundation (CHF) og Presbyterian Health Foundation (PHF) bevilling. Live-cell imaging tjenester leveret af Cancer Functional Genomics kerne blev støttet dels af National Institute of General Medical Sciences Grant P20GM103639 og National Cancer Institute Grant P30CA225520 fra National Institutes of Health, tildelt University of Oklahoma Health Sciences Center Stephenson Cancer Center.

Alle dyreforsøg i denne undersøgelse blev godkendt af University of Oklahoma Health Sciences Center Institutional Animal Care and Use Committee. Efter institutionel godkendelse blev føtale tyndtarmsprøver fra en for tidlig ikke-menneskelig primat (NHP, 90% drægtighed, olivenbavian, Papio anubis) opnået efter eutanasi til en separat undersøgelse (protokol # 101523-16-039-I)20.
1. Etablering af for tidligt 3D-enteroider af non-human primat primat</st...

<ol>
	<li>Lemons, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Very+low+birth+weight+outcomes+of+the+National+Institute+of+Child+Health+and+Human+Development+Neonatal+Research+Network,+January+1995+through+December+1996.">Very low birth weight outcomes of the National Institute of Child Health and Human Development Neonatal Research Network, January 1995 through December 1996.</a> Pediatrics. 107 (1), 1 (2001).</li><li>Burge, K., Vieira, F., Eckert, J., Chaaban, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+composition,+digestion,+and+absorption+differences+among+neonatal+feeding+strategies:+Potential+implications+for+intestinal+inflammation+in+preterm+infants.">Lipid composition, digestion, and absorption differences among neonatal feeding strategies: Potential implications for intestinal inflammation in preterm infants.</a> Nutrients. 13 (2), 550 (2021).</li><li>Duffy, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+mediating+bacterial+translocation+in+the+immature+intestine.">Interactions mediating bacterial translocation in the immature intestine.</a> The Journal of Nutrition. 130, 432-436 (2000).</li><li>Nanthakumar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+excessive+intestinal+inflammation+in+necrotizing+enterocolitis:+An+immature+innate+immune+response.">The mechanism of excessive intestinal inflammation in necrotizing enterocolitis: An immature innate immune response.</a> PLoS One. 6 (3), 17776 (2011).</li><li>Nanthakumar, N. N., Fusunyan, R. D., Sanderson, I., Walker, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+in+the+developing+human+intestine:+A+possible+pathophysiologic+contribution+to+necrotizing+enterocolitis.">Inflammation in the developing human intestine: A possible pathophysiologic contribution to necrotizing enterocolitis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 6043-6048 (2000).</li><li>He, Y., Lawlor, N. T., Newburg, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+milk+components+modulate+toll-like+receptor-mediated+inflammation.">Human milk components modulate toll-like receptor-mediated inflammation.</a> Advances in Nutrition. 7 (1), 102-111 (2016).</li><li>Walker, W. A., Iyengar, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+milk,+microbiota,+and+intestinal+immune+homeostasis.">Breast milk, microbiota, and intestinal immune homeostasis.</a> Pediatric Research. 77 (1-2), 220-228 (2015).</li><li>Westerbeek, E. A., vanden Berg, A., Lafeber, H. N., Fetter, W. P., van Elburg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+enteral+supplementation+of+a+prebiotic+mixture+of+non-human+milk+galacto-,+fructo-+and+acidic+oligosaccharides+on+intestinal+permeability+in+preterm+infants.">The effect of enteral supplementation of a prebiotic mixture of non-human milk galacto-, fructo- and acidic oligosaccharides on intestinal permeability in preterm infants.</a> British Journal of Nutrition. 105 (2), 268-274 (2011).</li><li>vanden Berg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+glutamine-enriched+enteral+nutrition+on+intestinal+permeability+in+very-low-birth-weight+infants:+A+randomized+controlled+trial.">The effect of glutamine-enriched enteral nutrition on intestinal permeability in very-low-birth-weight infants: A randomized controlled trial.</a> Journal of Parenteral and Enteral Nutrition. 30 (5), 408-414 (2006).</li><li>Foster, J. P., Seth, R., Cole, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+immunoglobulin+for+preventing+necrotizing+enterocolitis+in+preterm+and+low+birth+weight+neonates.">Oral immunoglobulin for preventing necrotizing enterocolitis in preterm and low birth weight neonates.</a> The Cochrane Database of Systematic Reviews. 4 (4), (2016).</li><li>Maffei, D., Schanler, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+milk+is+the+feeding+strategy+to+prevent+necrotizing+enterocolitis.">Human milk is the feeding strategy to prevent necrotizing enterocolitis.</a> Seminars in Perinatology. 41 (1), 36-40 (2017).</li><li>Patel, A. L., Kim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+milk+and+necrotizing+enterocolitis.">Human milk and necrotizing enterocolitis.</a> Seminars in Pediatric Surgery. 27 (1), 34-38 (2018).</li><li>Nolan, L. S., Parks, O. B., Good, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+immunomodulating+components+of+maternal+breast+milk+and+protection+against+necrotizing+enterocolitis.">A review of the immunomodulating components of maternal breast milk and protection against necrotizing enterocolitis.</a> Nutrients. 12 (1), 14 (2019).</li><li>Hill, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+milk+hyaluronan+enhances+innate+defense+of+the+intestinal+epithelium.">Human milk hyaluronan enhances innate defense of the intestinal epithelium.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (40), 29090-29104 (2013).</li><li>Burge, K., Bergner, E., Gunasekaran, A., Eckert, J., Chaaban, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+glycosaminoglycans+in+protection+from+neonatal+necrotizing+enterocolitis:+A+narrative+review.">The role of glycosaminoglycans in protection from neonatal necrotizing enterocolitis: A narrative review.</a> Nutrients. 12 (2), 546 (2020).</li><li>Chaaban, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acceleration+of+small+intestine+development+and+remodeling+of+the+microbiome+following+hyaluronan+35+kDa+treatment+in+neonatal+mice.">Acceleration of small intestine development and remodeling of the microbiome following hyaluronan 35 kDa treatment in neonatal mice.</a> Nutrients. 13 (6), 2030 (2021).</li><li>Gunasekaran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan+35+kDa+enhances+epithelial+barrier+function+and+protects+against+the+development+of+murine+necrotizing+enterocolitis.">Hyaluronan 35 kDa enhances epithelial barrier function and protects against the development of murine necrotizing enterocolitis.</a> Pediatric Research. 87 (7), 1177-1184 (2020).</li><li>Montenegro-Miranda, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+organoid+model+of+damage+and+repair+identifies+HNF4&#945;+as+a+critical+regulator+of+intestinal+epithelial+regeneration.">A novel organoid model of damage and repair identifies HNF4&#945; as a critical regulator of intestinal epithelial regeneration.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (2), 209-223 (2020).</li><li>Lee, C., Hong, S. N., Kim, E. R., Chang, D. K., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+regeneration+ability+of+Crohn's+disease+assessed+using+patient-derived+intestinal+organoids.">Epithelial regeneration ability of Crohn's disease assessed using patient-derived intestinal organoids.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 6013 (2021).</li><li>Gurung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+Zika+virus+(ZIKV)+infection+following+vaginal+inoculation+with+ZIKV-infected+semen+in+timed-pregnant+olive+baboons.">Maternal Zika virus (ZIKV) infection following vaginal inoculation with ZIKV-infected semen in timed-pregnant olive baboons.</a> Journal of Virology. 94 (11), 00058 (2020).</li><li>Suarez-Arnedo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+image+J+plugin+for+the+high+throughput+image+analysis+of+in+vitro+scratch+wound+healing+assays.">An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays.</a> PLoS One. 15 (7), 0232565 (2020).</li><li>Kobelt, D., Walther, W., Stein, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+cell+migration+monitoring+to+analyze+drug+synergism+in+the+scratch+assay+using+the+IncuCyte+system.">Real-time cell migration monitoring to analyze drug synergism in the scratch assay using the IncuCyte system.</a> Methods in Molecular Biology. 2294, 133-142 (2021).</li><li>de Jong, J. C. W., Ijssennagger, N., van Mil, S. W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+milk+nutrients+driving+intestinal+epithelial+layer+maturation+via+Wnt+and+Notch+signaling:+Implications+for+necrotizing+enterocolitis.">Breast milk nutrients driving intestinal epithelial layer maturation via Wnt and Notch signaling: Implications for necrotizing enterocolitis.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1867 (11), 166229 (2021).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietin+protects+epithelial+cells+from+excessive+autophagy+and+apoptosis+in+experimental+neonatal+necrotizing+enterocolitis.">Erythropoietin protects epithelial cells from excessive autophagy and apoptosis in experimental neonatal necrotizing enterocolitis.</a> PLoS One. 8 (7), 69620 (2013).</li><li>Kessler, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+role+of+35+kilodalton+hyaluronan+in+promoting+defense+of+the+intestinal+epithelium.">Multifunctional role of 35 kilodalton hyaluronan in promoting defense of the intestinal epithelium.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 66 (4), 273-287 (2018).</li><li>Fraser, J. R. E., Laurent, T. C., Laurent, U. B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan:+Its+nature,+distribution,+functions+and+turnover.">Hyaluronan: Its nature, distribution, functions and turnover.</a> Journal of Internal Medicine. 242 (1), 27-33 (1997).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan+35kDa+treatment+protects+mice+from+Citrobacter+rodentium+infection+and+induces+epithelial+tight+junction+protein+ZO-1+in+vivo.">Hyaluronan 35kDa treatment protects mice from Citrobacter rodentium infection and induces epithelial tight junction protein ZO-1 in vivo.</a> Matrix Biology. 62, 28-39 (2017).</li><li>Prehm, P., Schumacher, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+hyaluronan+export+from+human+fibroblasts+by+inhibitors+of+multidrug+resistance+transporters.">Inhibition of hyaluronan export from human fibroblasts by inhibitors of multidrug resistance transporters.</a> Biochemical Pharmacology. 68 (7), 1401-1410 (2004).</li><li>Stenson, W. F., Ciorba, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonmicrobial+activation+of+TLRs+controls+intestinal+growth,+wound+repair,+and+radioprotection.">Nonmicrobial activation of TLRs controls intestinal growth, wound repair, and radioprotection.</a> Frontiers in Immunology. 11 (3591), 617510 (2021).</li><li>Riehl, T. E., Ee, X., Stenson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronic+acid+regulates+normal+intestinal+and+colonic+growth+in+mice.">Hyaluronic acid regulates normal intestinal and colonic growth in mice.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 303 (3), 377-388 (2012).</li><li>Riehl, T. E., Santhanam, S., Foster, L., Ciorba, M., Stenson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44+and+TLR4+mediate+hyaluronic+acid+regulation+of+Lgr5++stem+cell+proliferation,+crypt+fission,+and+intestinal+growth+in+postnatal+and+adult+mice.">CD44 and TLR4 mediate hyaluronic acid regulation of Lgr5+ stem cell proliferation, crypt fission, and intestinal growth in postnatal and adult mice.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309 (11), 874-887 (2015).</li><li>Hill, D. R., Kessler, S. P., Rho, H. K., Cowman, M. K., de la Motte, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific-sized+hyaluronan+fragments+promote+expression+of+human+beta-defensin+2+in+intestinal+epithelium.">Specific-sized hyaluronan fragments promote expression of human beta-defensin 2 in intestinal epithelium.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (36), 30610-30624 (2012).</li><li>Fernando, E. H., Gordon, M. H., Beck, P. L., MacNaughton, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+intestinal+epithelial+wound+healing+through+protease-activated+receptor-2+activation+in+Caco2+cells.">Inhibition of intestinal epithelial wound healing through protease-activated receptor-2 activation in Caco2 cells.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 367 (2), 382-392 (2018).</li><li>Nyegaard, S., Christensen, B., Rasmussen, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+accurate+quantification+of+cell+migration+using+human+small+intestine+cells.">An optimized method for accurate quantification of cell migration using human small intestine cells.</a> Metabolic Engineering Communications. 3, 76-83 (2016).</li><li>Roodsant, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+2D+primary+organoid-derived+epithelial+monolayer+model+to+study+host-pathogen+interaction+in+the+small+intestine.">A human 2D primary organoid-derived epithelial monolayer model to study host-pathogen interaction in the small intestine.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 272 (2020).</li><li>Singh, A., Poling, H. M., Spence, J. R., Wells, J. M., Helmrath, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+organoids:+a+next-generation+tool+for+modeling+human+development.">Gastrointestinal organoids: a next-generation tool for modeling human development.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 319 (3), 375-381 (2020).</li><li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids+as+an+ex-vivo+model+of+host-pathogen+interactions+in+the+gastrointestinal+tract.">Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract.</a> Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1124-1134 (2014).</li><li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids+as+a+model+of+upper+small+intestinal+ion+transport+physiology+and+pathophysiology.">Human enteroids as a model of upper small intestinal ion transport physiology and pathophysiology.</a> Gastroenterology. 150 (3), 638-649 (2016).</li></ol>

Mave-tarmkanalen hos et for tidligt født barn er under kontinuerligt regenerativt pres fra gentagne eksponeringer for miljømæssige fornærmelser forbundet med dysbiose, inflammatoriske bakterielle metabolitter og toksiner og intermitterende hypoxi23,24. Desværre er tarmepitelet hos det for tidligt fødte spædbarn ikke i stand til hurtigt at etablere funktionel integritet23, hvilket resulterer i barrieredysfunktion, øget tarmpermeabil...

Nekrotiserende enterocolitis (NEC) er en af de mest almindelige gastrointestinale nødsituationer hos for tidligt fødte spædbørn1. Sygdommen er karakteriseret ved alvorlig tarmbetændelse, der hurtigt kan forringes til tarmnekrose, sepsis og potentielt død. Selvom ætiologien er uklar, tyder beviser på, at NEC er multifaktoriel og resultatet af en kompleks interaktion mellem fodring, unormal bakteriel kolonisering og et umodent tarmepitel 2,3. For tidligt fødte spædbørn har øget tarmpermeabilitet, unormal bakteriel kolonisering og lav enterocytregenerativ kapacitet4,5, hvilket øger deres risiko for tarmbarrieredysfunktion, bakteriel translokation og NEC-udvikling. Derfor er identifikation af strategier eller interventioner for at fremskynde tarmens epitelmodning og fremme regenerering eller helbredelse af tarmepitelet afgørende for at forhindre denne dødelige sygdom.
Undersøgelser har vist, at modermælk (HM) beskytter mod NEC hos for tidligt fødte børn 6,7,8,9,10,11. Både humane og dyreforsøg har vist, at kvægbaseret formel øger tarmpermeabiliteten og er direkte giftig for tarmepitelceller 2,12. Selvom det ikke er fuldt belyst, tyder beviser på, at de beskyttende virkninger af HM medieres gennem bioaktive komponenter såsom lactoferrin, immunoglobulin A (IgA) og HM oligosaccharider13. HM er også rig på hyaluronan (HA), en unik ikke-sulfateret glycosaminoglycan med gentagende D-glucuronsyre og N-acetyl-D-glucosamindisaccharider14,15. Det er vigtigt, at vi har vist, at oral 35 kDa HA (HA35), en HM HA-efterligning, dæmper sværhedsgraden af tarmskade, forhindrer bakteriel translokation og reducerer dødeligheden i en murine NEC-lignende tarmskademodel16,17. 
Her undersøges virkningerne af HA35 på tarmheling og regenerering in vitro yderligere. I øjeblikket er det mest anvendte in vitro-assay til tarmsår og reparation et ridsesårassay udført i kolorektal cancer (CRC) cellemonolag. Den fysiologiske relevans af en sådan model for den for tidlige spædbarnstarm er begrænset, da sårreparation af CRC-celler er stærkt afhængig af kræftcellernes stærkt proliferative karakter snarere end stamcelledrevne reparationsprocesser18. For at overvinde denne begrænsning er etableringen af en 2D enteroid ridsesårmodel, herunder proceduren for isolering og vedligeholdelse af primære stamcelleafledte tyndtarmsenteroider fra for tidlige ikke-menneskelige primater (NHP), beskrevet her. Da for tidlig NEC oftest rapporteres i den distale tyndtarm, giver brugen af primære epitelcelleorganoider i en model for tarmskader og reparation en mere fysiologisk oversættelig in vitro-model sammenlignet med eksisterende modeller, der anvender traditionelle kolorektale monolag18,19.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-675-49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x21mm Dish, Nunclon Delta</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>172931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well, TC-Treated, Flat Bottom Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#181;M Reversible Cell Strainer</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>27215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Sterile Cell Strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin, Bovine (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium/Nutrient Ham&#39;s Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>36254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>100-0485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte S3 Live-Cell Analysis Instrument</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>4647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte Scratch Wound Analysis Software Module</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>9600-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>06010</td>
			<td>This is HOGMY, but without the Y-27632 or antibiotics. Also used as base for HOGM, but then only missing the antibiotics.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L3012-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>136101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate-Buffered Saline), 1X [-] Calcium, Magnesium, pH 7.4</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>This is broad-spectrum antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hyaluronate, Research Grade, HA20K</td>
			<td>Lifecore Biomedical</td>
			<td>HA20K-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20 Automated Cell Counter</td>
			<td>Company: Bio-Rad</td>
			<td>1450102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 1X, 0.25% Trypsin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT25053CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72302</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effect of hyaluronic acid 35 kda on an in vitro model of preterm small intestinal injury and healing using enteroid-derived monolayers

In vitro ridse sår assays er almindeligt anvendt til at undersøge mekanismerne og karakteristika for epitel heling i en række vævstyper. Her beskriver vi en protokol til at generere et todimensionelt (2D) monolag fra tredimensionelle (3D) ikke-humane primatenteroider afledt af tarmkrypter i det terminale ileum. Disse enteroidafledte monolag blev derefter anvendt i et in vitro ridsesårassay for at teste evnen hos hyaluronan 35 kDa (HA35), en human mælk HA-efterligning, til at fremme cellemigration og spredning langs epitelsårkanten. Efter at monolagene var vokset til sammenløb, blev de manuelt ridset og behandlet med HA35 (50 μg / ml, 100 μg / ml, 200 μg / ml) eller kontrol (PBS). Cellemigration og spredning i hullet blev afbildet ved hjælp af et mikroskop med transmitteret lys udstyret til levende cellebilleddannelse. Sårlukning blev kvantificeret som procent sårheling ved hjælp af Wound Healing Size Plugin i ImageJ. Kradseområdet og cellemigrationshastigheden og procentdelen af sårlukning blev målt over 24 timer. HA35 in vitro fremskynder sårheling i tyndtarms enteroide monolag, sandsynligvis gennem en kombination af celleproliferation ved sårkanten og migration til sårområdet. Disse metoder kan potentielt bruges som en model til at udforske tarmregenerering i den for tidlige humane tyndtarm.

Virkningerne af HA på vævsreparation og sårheling i forskellige væv og organer er veldokumenterede; Imidlertid er de specifikke virkninger af HA med en molekylvægt på 35 kDa på føtal eller neonatal tyndtarmheling og regenerering i øjeblikket ukendt. For at teste HA35's evne til at fremme sårheling i en model af fosteret eller neonatal tyndtarmen genererede vi 3D-tarmenteroider fra NHP-ilealvæv og dissocierede yderligere dette væv i enkeltceller for at skabe 2D enteroidafledte monolag (fig...

Watch this Scientific Journal Video about Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers at JoVE.com

Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers

Denne protokol beskriver en metode til at etablere og udføre et ridsesårassay på todimensionale (2D) monolag afledt af tredimensionale (3D) enteroider isoleret fra ikke-humant primat ileum.

Effekt af hyaluronsyre 35 kDa på en in vitro-model af for tidlig tarmskade og heling ved hjælp af enteroidafledte monolag

In vitro scratch wound assays are commonly used to investigate the mechanisms and characteristics of epithelial healing in a variety of tissue types. ...

Denne protokol udvider det meget almindelige ridsesårassay, der anvendes til regenereringsundersøgelser med enteroidafledte monolag, der repræsenterer alle større celletyper i tyndtarmen. Denne teknik muliggør realtidsvisualisering af sårlukning i en for tidlig 2D enteroid monolagsmodel af tarmregenerering. Vores teknik kan anvendes til undersøgelse af for tidlig pattedyrs tarm, som typisk er dårligt modelleret ved hjælp af transformerede kolorektal cancercellelinjer.Begynd med at optø 96 mikroliter ekstracellulær matrix eller ECM-baseret hydrogel BME natten over på is ved to til otte grader Celsius. Fortynd den ECM-baserede hydrogel og iskold PBS uden calcium eller magnesium i et forhold på en til 50. Belæg hver brønd af en 24-brønds vævskulturplade med 200 mikroliter iskold fortyndet ECM-baseret hydrogel og inkuber den overtrukne plade i mindst en time ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid.Derefter opsuges mediet fra 24-brønds kulturpladen indeholdende 3D-enteroider bestemt til monolag og udskift det med 500 mikroliter celledissociationsreagens pr. Brønd. Manuelt forstyrre de ECM-baserede hydrogelkupler ved at pipettere op og ned otte til 12 gange og overføre indholdet af 12 brønde til et 15 milliliter konisk rør. Vask de 12 tomme brønde med 250 mikroliter celledissociationsreagens for at sikre, at alle enteroider er fjernet, og overfør indholdet til 15 milliliter koniske rør.Centrifuger de koniske rør ved 300 g i fem minutter ved fire grader Celsius og kassér supernatanten. Tilsæt 10 ml iskold DMEM / F-12 vaskebuffer til de koniske rør og suspender enteroidpillerne ved at vende rørene om. Centrifuge ved 300 g i fem minutter ved fire grader Celsius og fjern supernatanten.Resuspender cellepillerne i 12 ml 37 grader Celsius Trypsin-EDTA og læg rørene i et 37 grader Celsius vandbad i 10 minutter, eller indtil cellerne ser opløselige ud. Tilsæt tre milliliter DMEM / F-12 vaskebuffer til hvert rør for at fortynde Trypsin-EDTA. Bland ved at vende rørene og læg dem på is.Filtrer de dissocierede enteroider gennem en 37 mikrometer mesh celle sil. Indsaml indholdet i rene 15 milliliter koniske rør og centrifuger rørene ved 300 g i fem minutter ved fire grader Celsius. Fjern supernatanten fra de koniske rør og suspender cellepillerne med seks milliliter HOMGY.Fjern derefter den ECM-baserede hydrogelbelagte plade fra inkubatoren og aspirer enhver overskydende ECM-baseret hydrogelopløsning uden at ridse den belagte overflade eller tørre pladen helt. Der tilsættes 500 mikroliter af den kombinerede 12 ml HOMGY-cellesuspension i hver brønd på 24-brøndspladen belagt med ECM-baseret hydrogel. Hvirvl pladen med låget på for at sikre en jævn fordeling af celler i brøndene.Inkuber pladen ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid, og udskift HOMGY-medier hver anden dag, indtil monolagene når større end 90% sammenløb. Når monolagene når større end 90% sammenløb, skal du opsuge mediet for at fjerne celler, der ikke er fastgjort. Behandl cellerne med 500 mikroliter HA35 eller PBS opløst i HOMGY i 24 timer.Fjern derefter mediet uden at forstyrre overfladen af monolaget. Brug en 200 mikroliter pipettespids til at lave en lineær ridse over monolagets fulde overfladediameter i hver brønd, og pas på ikke at lade monolagene tørre. Vask de ridsede monolag en gang med 500 mikroliter 1X PBS og tilsæt 500 mikroliter HA35 eller PBS opløst i HOMGY.Overfør pladen til det levende celleanalyseinstrument inden for en 37 grader Celsius og 5% kuldioxidinkubator. Under ikonet Planlæg i live cell-analysesoftwaren skal du klikke på ikonet Start Tilføj nyt fartøj. Vælg Scan efter planen, og klik derefter på Næste.Vælg Ny under Opret fartøj, klik på Næste, vælg derefter Hele brønden under Scanningstype, og klik på Næste. Vælg Fase for billedkanaler og 4x for målet. Vælg pladeproducenten og katalognummeret på den angivne liste, og klik på Næste.Vælg en tom beholderplacering efterfulgt af det ønskede scanningsmønster. Indtast pladenavn i Navn, og vælg derefter plus for at oprette et pladelayout. Vælg lille plus for at oprette et behandlingsnavn.Indtast kort navn og derefter OK. Fremhæv pladebrøndene, der svarer til den behandling, og tryk stort plus for at udpege brønde med den behandling. Indtast sammensat koncentration, og klik på OK. Når pladen er færdig, skal du vælge OK, Næste. Vælg Udsæt analysen til senere efterfulgt af Opret ny tidsplan med scanninger med fire timers mellemrum.Stop scanningen på en dag, nul timer. Sørg for, at oversigten er korrekt, og føj derefter til tidsplanen. I live celleanalysesoftware skal du vælge Vis øverst på skærmen.Fra menuen Fartøjsnavn skal du navigere til din afsluttede 24-timers scanning og dobbeltklikke på fartøjets navn. Vælg Eksporter billeder og film ikon til venstre efterfulgt af Som vist mulighed. Fremhæv interessebrøndene, og vælg derefter interessepunkter og billedserier som vist.Sørg for, at sekvenstypen og scanningerne er korrekte. Vælg den ønskede målmappeplacering. Vælg JPEG i rullemenuen og derefter Eksporter.Åbn ImageJ-softwaren, og upload billedet af det ridsårsår. Vælg Billede, og skriv derefter 8-bit for at ændre billedet fra 24-bit RGB. Vælg Plugins, Makroer, Installer Wound_healing_size plugin for at installere pluginet Sårhelingsstørrelse.Derefter skal du indstille variansvinduets radius til 20, tærskelværdi til 100, procentdel af mættede pixels til 0,001. Ja for Indstil skala global, og klik derefter på OK. Kontroller, at det skitserede område er sårområdet, og gentag for yderligere ridser. Endelig skal du beregne procentdelen af ridseområdets sårheling af migrerende eller prolifererende celler over 24 timer ved hjælp af ligningen vist på skærmen.Her er T0 området på tid nul timer, og TC er området på nul timer, fire timer, 12 timer eller 24 timer. Enteroid generation og enteroid-afledt monolag sårheling assay procedure er vist i disse billeder. En kultur af tredimensionelle, ikke-menneskelige primat intestinale enteroider bruges til at dissociere i todimensionale monolag.Monolag blev dyrket til mere end 90% sammenløb i en 24-brøndsplade og derefter behandlet med HA35 eller PBS i 24 timer. Monolag blev derefter ridset med en P200 pipettespids. Her ses de repræsentative billeder af HA35 i kontrolbehandlinger af ikke-menneskelige enteroide mellemlag.Billeder blev opnået på nul timer, fire timer, 12 timer og 24 timer efter at have udført en ridse med en P200 pipettespids. Effekten af HA35 på sårheling og oid monolag er vist her. Ændringen i sårheling over tid i enteroid monolag er afhængig af HA35 behandlingskoncentration.HA35 øgede sårhelingen signifikant efter fire timer og 12 timer ved 100 mikrogram pr. milliliter og 200 mikrogram pr. milliliter sammenlignet med kontrol, men helingshastighederne konvergerede blandt behandlingerne med 24 timer. En af de vigtigste ting at huske med denne procedure er, at intestinale enteroide monolag er kortvarige. Så når de er 90% confluid, bør efterforskere se på at bruge dem hurtigt.Denne teknik er blevet vores go-to model for for tidlig tarmregenerering in vitro, især hvis vi er interesseret i mere mekanisk snarere end inflammatorisk skade.

Research

JoVE Journal

Medicine

Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers

A Contusive Model of Unilateral Cervical Spinal Cord Injury Using the Infinite Horizon Impactor

En Contusive Model af Unilateral Cervikal Rygmarvsskader Brug af Uendelige Horizon Impactor

While the majority of human spinal cord injuries occur in the cervical spinal cord, the vast majority of laboratory research employs animal models of ...

Murine Model of Wound Healing

Musemodel af Sårheling

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

An Alkali-burn Injury Model of Corneal Neovascularization in the Mouse

En Alkali-burn Injury Model hornhindeneovaskularisering i mus

Under normal conditions, the cornea is avascular, and this transparency is essential for maintaining good visual acuity. Neovascularization (NV) of the ...

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Murin Endoskopi til<em&gt; In Vivo</em&gt; Multimodal Imaging af Carcinogenesis og vurdering af Intestinal sårheling og betændelse

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions ...

Development of an Algorithm to Perform a Comprehensive Study of Autonomic Dysreflexia in Animals with High Spinal Cord Injury Using a Telemetry Device

Udvikling af en algoritme til at udføre en omfattende undersøgelse af autonom dysrefleksi i Dyr med høj Rygmarvsskader Brug af en Telemetri Device

Spinal cord injury (SCI) is a debilitating neurological condition characterized by somatic and autonomic dysfunctions. In particular, SCI above the ...

Murine Model of Intestinal Ischemia-reperfusion Injury

Murin model af intestinal iskæmi-reperfusionsskade

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, ...

Open Tracheostomy Gastric Acid Aspiration Murine Model of Acute Lung Injury Results in Maximal Acute Nonlethal Lung Injury

Åbent Tracheostomituber Gastric Acid Aspiration murin model af akut lungeskade Resultater i Maximal Akut ikke-letale Lung Injury

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

Forbedret metode til etablering af et In Vitro blod - hjerne barrieren Model baseret på svin hjernen Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

In Vivo Evaluering af fraktur Callus udvikling under knogleheling i mus ved hjælp af en Mr-kompatible osteosyntese enhed for musen lårben

Endochondral fracture healing is a complex process involving the development of fibrous, cartilaginous, and osseous tissue in the fracture callus. The ...