Name: effect of hyaluronic acid 35 kda on an in vitro model of preterm small intestinal injury and healing using enteroid-derived monolayers
Uploaded: 2022-07-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers at JoVE.com

Deze inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health. HC wordt ondersteund door subsidie P20GM134973 van de National Institutes of Health. KB wordt ondersteund door een Children's Hospital Foundation (CHF) en Presbyterian Health Foundation (PHF) subsidie. Live-cell imaging-diensten die worden aangeboden door de Cancer Functional Genomics-kern werden gedeeltelijk ondersteund door het National Institute of General Medical Sciences Grant P20GM103639 en national cancer institute grant P30CA225520 van de National Institutes of Health, toegekend aan het University of Oklahoma Health Sciences Center Stephenson Cancer Center.

Alle dierprocedures in deze studie werden goedgekeurd door het University of Oklahoma Health Sciences Center Institutional Animal Care and Use Committee. Na institutionele goedkeuring werden foetale dunne darm gemaksmonsters van een premature niet-menselijke primaat (NHP, 90% dracht, olijfbaviaan, Papio anubis) verkregen na euthanasie voor een afzonderlijke studie (Protocol # 101523-16-039-I) 20.
1. Vaststelling van premature niet-menselijke primaat 3D in...

<ol>
	<li>Lemons, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Very+low+birth+weight+outcomes+of+the+National+Institute+of+Child+Health+and+Human+Development+Neonatal+Research+Network,+January+1995+through+December+1996.">Very low birth weight outcomes of the National Institute of Child Health and Human Development Neonatal Research Network, January 1995 through December 1996.</a> Pediatrics. 107 (1), 1 (2001).</li><li>Burge, K., Vieira, F., Eckert, J., Chaaban, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+composition,+digestion,+and+absorption+differences+among+neonatal+feeding+strategies:+Potential+implications+for+intestinal+inflammation+in+preterm+infants.">Lipid composition, digestion, and absorption differences among neonatal feeding strategies: Potential implications for intestinal inflammation in preterm infants.</a> Nutrients. 13 (2), 550 (2021).</li><li>Duffy, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+mediating+bacterial+translocation+in+the+immature+intestine.">Interactions mediating bacterial translocation in the immature intestine.</a> The Journal of Nutrition. 130, 432-436 (2000).</li><li>Nanthakumar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+excessive+intestinal+inflammation+in+necrotizing+enterocolitis:+An+immature+innate+immune+response.">The mechanism of excessive intestinal inflammation in necrotizing enterocolitis: An immature innate immune response.</a> PLoS One. 6 (3), 17776 (2011).</li><li>Nanthakumar, N. N., Fusunyan, R. D., Sanderson, I., Walker, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+in+the+developing+human+intestine:+A+possible+pathophysiologic+contribution+to+necrotizing+enterocolitis.">Inflammation in the developing human intestine: A possible pathophysiologic contribution to necrotizing enterocolitis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 6043-6048 (2000).</li><li>He, Y., Lawlor, N. T., Newburg, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+milk+components+modulate+toll-like+receptor-mediated+inflammation.">Human milk components modulate toll-like receptor-mediated inflammation.</a> Advances in Nutrition. 7 (1), 102-111 (2016).</li><li>Walker, W. A., Iyengar, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+milk,+microbiota,+and+intestinal+immune+homeostasis.">Breast milk, microbiota, and intestinal immune homeostasis.</a> Pediatric Research. 77 (1-2), 220-228 (2015).</li><li>Westerbeek, E. A., vanden Berg, A., Lafeber, H. N., Fetter, W. P., van Elburg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+enteral+supplementation+of+a+prebiotic+mixture+of+non-human+milk+galacto-,+fructo-+and+acidic+oligosaccharides+on+intestinal+permeability+in+preterm+infants.">The effect of enteral supplementation of a prebiotic mixture of non-human milk galacto-, fructo- and acidic oligosaccharides on intestinal permeability in preterm infants.</a> British Journal of Nutrition. 105 (2), 268-274 (2011).</li><li>vanden Berg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+glutamine-enriched+enteral+nutrition+on+intestinal+permeability+in+very-low-birth-weight+infants:+A+randomized+controlled+trial.">The effect of glutamine-enriched enteral nutrition on intestinal permeability in very-low-birth-weight infants: A randomized controlled trial.</a> Journal of Parenteral and Enteral Nutrition. 30 (5), 408-414 (2006).</li><li>Foster, J. P., Seth, R., Cole, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+immunoglobulin+for+preventing+necrotizing+enterocolitis+in+preterm+and+low+birth+weight+neonates.">Oral immunoglobulin for preventing necrotizing enterocolitis in preterm and low birth weight neonates.</a> The Cochrane Database of Systematic Reviews. 4 (4), (2016).</li><li>Maffei, D., Schanler, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+milk+is+the+feeding+strategy+to+prevent+necrotizing+enterocolitis.">Human milk is the feeding strategy to prevent necrotizing enterocolitis.</a> Seminars in Perinatology. 41 (1), 36-40 (2017).</li><li>Patel, A. L., Kim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+milk+and+necrotizing+enterocolitis.">Human milk and necrotizing enterocolitis.</a> Seminars in Pediatric Surgery. 27 (1), 34-38 (2018).</li><li>Nolan, L. S., Parks, O. B., Good, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+immunomodulating+components+of+maternal+breast+milk+and+protection+against+necrotizing+enterocolitis.">A review of the immunomodulating components of maternal breast milk and protection against necrotizing enterocolitis.</a> Nutrients. 12 (1), 14 (2019).</li><li>Hill, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+milk+hyaluronan+enhances+innate+defense+of+the+intestinal+epithelium.">Human milk hyaluronan enhances innate defense of the intestinal epithelium.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (40), 29090-29104 (2013).</li><li>Burge, K., Bergner, E., Gunasekaran, A., Eckert, J., Chaaban, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+glycosaminoglycans+in+protection+from+neonatal+necrotizing+enterocolitis:+A+narrative+review.">The role of glycosaminoglycans in protection from neonatal necrotizing enterocolitis: A narrative review.</a> Nutrients. 12 (2), 546 (2020).</li><li>Chaaban, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acceleration+of+small+intestine+development+and+remodeling+of+the+microbiome+following+hyaluronan+35+kDa+treatment+in+neonatal+mice.">Acceleration of small intestine development and remodeling of the microbiome following hyaluronan 35 kDa treatment in neonatal mice.</a> Nutrients. 13 (6), 2030 (2021).</li><li>Gunasekaran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan+35+kDa+enhances+epithelial+barrier+function+and+protects+against+the+development+of+murine+necrotizing+enterocolitis.">Hyaluronan 35 kDa enhances epithelial barrier function and protects against the development of murine necrotizing enterocolitis.</a> Pediatric Research. 87 (7), 1177-1184 (2020).</li><li>Montenegro-Miranda, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+organoid+model+of+damage+and+repair+identifies+HNF4&#945;+as+a+critical+regulator+of+intestinal+epithelial+regeneration.">A novel organoid model of damage and repair identifies HNF4&#945; as a critical regulator of intestinal epithelial regeneration.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (2), 209-223 (2020).</li><li>Lee, C., Hong, S. N., Kim, E. R., Chang, D. K., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+regeneration+ability+of+Crohn's+disease+assessed+using+patient-derived+intestinal+organoids.">Epithelial regeneration ability of Crohn's disease assessed using patient-derived intestinal organoids.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 6013 (2021).</li><li>Gurung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+Zika+virus+(ZIKV)+infection+following+vaginal+inoculation+with+ZIKV-infected+semen+in+timed-pregnant+olive+baboons.">Maternal Zika virus (ZIKV) infection following vaginal inoculation with ZIKV-infected semen in timed-pregnant olive baboons.</a> Journal of Virology. 94 (11), 00058 (2020).</li><li>Suarez-Arnedo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+image+J+plugin+for+the+high+throughput+image+analysis+of+in+vitro+scratch+wound+healing+assays.">An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays.</a> PLoS One. 15 (7), 0232565 (2020).</li><li>Kobelt, D., Walther, W., Stein, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+cell+migration+monitoring+to+analyze+drug+synergism+in+the+scratch+assay+using+the+IncuCyte+system.">Real-time cell migration monitoring to analyze drug synergism in the scratch assay using the IncuCyte system.</a> Methods in Molecular Biology. 2294, 133-142 (2021).</li><li>de Jong, J. C. W., Ijssennagger, N., van Mil, S. W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+milk+nutrients+driving+intestinal+epithelial+layer+maturation+via+Wnt+and+Notch+signaling:+Implications+for+necrotizing+enterocolitis.">Breast milk nutrients driving intestinal epithelial layer maturation via Wnt and Notch signaling: Implications for necrotizing enterocolitis.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1867 (11), 166229 (2021).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietin+protects+epithelial+cells+from+excessive+autophagy+and+apoptosis+in+experimental+neonatal+necrotizing+enterocolitis.">Erythropoietin protects epithelial cells from excessive autophagy and apoptosis in experimental neonatal necrotizing enterocolitis.</a> PLoS One. 8 (7), 69620 (2013).</li><li>Kessler, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+role+of+35+kilodalton+hyaluronan+in+promoting+defense+of+the+intestinal+epithelium.">Multifunctional role of 35 kilodalton hyaluronan in promoting defense of the intestinal epithelium.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 66 (4), 273-287 (2018).</li><li>Fraser, J. R. E., Laurent, T. C., Laurent, U. B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan:+Its+nature,+distribution,+functions+and+turnover.">Hyaluronan: Its nature, distribution, functions and turnover.</a> Journal of Internal Medicine. 242 (1), 27-33 (1997).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan+35kDa+treatment+protects+mice+from+Citrobacter+rodentium+infection+and+induces+epithelial+tight+junction+protein+ZO-1+in+vivo.">Hyaluronan 35kDa treatment protects mice from Citrobacter rodentium infection and induces epithelial tight junction protein ZO-1 in vivo.</a> Matrix Biology. 62, 28-39 (2017).</li><li>Prehm, P., Schumacher, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+hyaluronan+export+from+human+fibroblasts+by+inhibitors+of+multidrug+resistance+transporters.">Inhibition of hyaluronan export from human fibroblasts by inhibitors of multidrug resistance transporters.</a> Biochemical Pharmacology. 68 (7), 1401-1410 (2004).</li><li>Stenson, W. F., Ciorba, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonmicrobial+activation+of+TLRs+controls+intestinal+growth,+wound+repair,+and+radioprotection.">Nonmicrobial activation of TLRs controls intestinal growth, wound repair, and radioprotection.</a> Frontiers in Immunology. 11 (3591), 617510 (2021).</li><li>Riehl, T. E., Ee, X., Stenson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronic+acid+regulates+normal+intestinal+and+colonic+growth+in+mice.">Hyaluronic acid regulates normal intestinal and colonic growth in mice.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 303 (3), 377-388 (2012).</li><li>Riehl, T. E., Santhanam, S., Foster, L., Ciorba, M., Stenson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44+and+TLR4+mediate+hyaluronic+acid+regulation+of+Lgr5++stem+cell+proliferation,+crypt+fission,+and+intestinal+growth+in+postnatal+and+adult+mice.">CD44 and TLR4 mediate hyaluronic acid regulation of Lgr5+ stem cell proliferation, crypt fission, and intestinal growth in postnatal and adult mice.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309 (11), 874-887 (2015).</li><li>Hill, D. R., Kessler, S. P., Rho, H. K., Cowman, M. K., de la Motte, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific-sized+hyaluronan+fragments+promote+expression+of+human+beta-defensin+2+in+intestinal+epithelium.">Specific-sized hyaluronan fragments promote expression of human beta-defensin 2 in intestinal epithelium.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (36), 30610-30624 (2012).</li><li>Fernando, E. H., Gordon, M. H., Beck, P. L., MacNaughton, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+intestinal+epithelial+wound+healing+through+protease-activated+receptor-2+activation+in+Caco2+cells.">Inhibition of intestinal epithelial wound healing through protease-activated receptor-2 activation in Caco2 cells.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 367 (2), 382-392 (2018).</li><li>Nyegaard, S., Christensen, B., Rasmussen, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+accurate+quantification+of+cell+migration+using+human+small+intestine+cells.">An optimized method for accurate quantification of cell migration using human small intestine cells.</a> Metabolic Engineering Communications. 3, 76-83 (2016).</li><li>Roodsant, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+2D+primary+organoid-derived+epithelial+monolayer+model+to+study+host-pathogen+interaction+in+the+small+intestine.">A human 2D primary organoid-derived epithelial monolayer model to study host-pathogen interaction in the small intestine.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 272 (2020).</li><li>Singh, A., Poling, H. M., Spence, J. R., Wells, J. M., Helmrath, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+organoids:+a+next-generation+tool+for+modeling+human+development.">Gastrointestinal organoids: a next-generation tool for modeling human development.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 319 (3), 375-381 (2020).</li><li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids+as+an+ex-vivo+model+of+host-pathogen+interactions+in+the+gastrointestinal+tract.">Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract.</a> Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1124-1134 (2014).</li><li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids+as+a+model+of+upper+small+intestinal+ion+transport+physiology+and+pathophysiology.">Human enteroids as a model of upper small intestinal ion transport physiology and pathophysiology.</a> Gastroenterology. 150 (3), 638-649 (2016).</li></ol>

Het maagdarmkanaal van een te vroeg geboren baby staat onder voortdurende regeneratieve druk van herhaalde blootstelling aan milieu-beledigingen geassocieerd met dysbiose, inflammatoire bacteriële metabolieten en toxines, en intermitterende hypoxie23,24. Helaas is het darmepitheel van het te vroeg geboren kind niet in staat om snel functionele integriteit vast te stellen23, wat resulteert in barrièredisfunctie, verhoogde darmdoorlaatbaar...

Necrotiserende enterocolitis (NEC) is een van de meest voorkomende gastro-intestinale noodsituaties bij te vroeg geboren baby's1. De ziekte wordt gekenmerkt door ernstige darmontsteking die snel kan verslechteren tot darmnecrose, sepsis en mogelijk de dood. Hoewel de etiologie onduidelijk is, suggereert bewijs dat NEC multifactorieel is en het resultaat van een complexe interactie van voeding, abnormale bacteriële kolonisatie en een onrijp darmepitheel 2,3. Premature baby's hebben een verhoogde darmdoorlaatbaarheid, abnormale bacteriële kolonisatie en een laag regeneratief vermogen van enterocyten 4,5, waardoor hun risico op intestinale barrièredisfunctie, bacteriële translocatie en NEC-ontwikkeling toeneemt. Daarom is het identificeren van strategieën of interventies om de intestinale epitheliale rijping te versnellen en regeneratie of genezing van het darmepitheel te bevorderen van cruciaal belang bij het voorkomen van deze dodelijke ziekte.
Studies hebben aangetoond dat moedermelk (HM) beschermend is tegen NEC bij te vroeg geboren baby's 6,7,8,9,10,11. Zowel menselijke als dierlijke studies hebben aangetoond dat op runderen gebaseerde formule de darmdoorlaatbaarheid verhoogt en direct toxisch is voor intestinale epitheelcellen 2,12. Hoewel niet volledig opgehelderd, suggereert bewijs dat de beschermende effecten van HM worden gemedieerd door bioactieve componenten zoals lactoferrine, immunoglobuline A (IgA) en HM oligosacchariden13. HM is ook rijk aan hyaluronaat (HA), een uniek niet-gesulfateerd glycosaminoglycaan met herhalend D-glucuronzuur en N-acetyl-D-glucosaminedisachariden14,15. Belangrijk is dat we hebben aangetoond dat orale 35 kDa HA (HA35), een HM HA-nabootsing, de ernst van darmletsel verzwakt, bacteriële translocatie voorkomt en de mortaliteit vermindert in een muizenNEC-achtig darmletselmodel16,17.
Hier worden de effecten van HA35 op darmgenezing en regeneratie in vitro verder onderzocht. Momenteel is de meest gebruikte in vitro assay voor darmbeschadiging en -reparatie een kraswondtest uitgevoerd in colorectale kanker (CRC) celmonolagen. De fysiologische relevantie van een dergelijk model voor de te vroeg geboren darm is beperkt, omdat wondherstel van CRC-cellen sterk afhankelijk is van de zeer proliferatieve aard van kankercellen in plaats van stamcelgestuurde reparatieprocessen18. Om deze beperking te overwinnen, wordt de oprichting van een 2D enteroïde kraswondmodel, inclusief de procedure voor het isoleren en onderhouden van primaire stamcel-afgeleide dunne darm enteroïden van premature niet-menselijke primaten (NHP), hier beschreven. Aangezien premature NEC meestal wordt gemeld in de distale dunne darm, biedt het gebruik van primaire epitheelcelorganoïden in een model van darmbeschadiging en -reparatie een meer fysiologisch vertaalbaar in vitro model in vergelijking met bestaande modellen die traditionele colorectale monolagen gebruiken18,19.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-675-49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x21mm Dish, Nunclon Delta</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>172931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well, TC-Treated, Flat Bottom Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#181;M Reversible Cell Strainer</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>27215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Sterile Cell Strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin, Bovine (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium/Nutrient Ham&#39;s Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>36254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>100-0485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte S3 Live-Cell Analysis Instrument</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>4647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte Scratch Wound Analysis Software Module</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>9600-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>06010</td>
			<td>This is HOGMY, but without the Y-27632 or antibiotics. Also used as base for HOGM, but then only missing the antibiotics.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L3012-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>136101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate-Buffered Saline), 1X [-] Calcium, Magnesium, pH 7.4</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>This is broad-spectrum antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hyaluronate, Research Grade, HA20K</td>
			<td>Lifecore Biomedical</td>
			<td>HA20K-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20 Automated Cell Counter</td>
			<td>Company: Bio-Rad</td>
			<td>1450102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 1X, 0.25% Trypsin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT25053CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72302</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effect of hyaluronic acid 35 kda on an in vitro model of preterm small intestinal injury and healing using enteroid-derived monolayers

In vitro kraswondtesten worden vaak gebruikt om de mechanismen en kenmerken van epitheliale genezing in verschillende weefseltypen te onderzoeken. Hier beschrijven we een protocol om een tweedimensionale (2D) monolaag te genereren uit driedimensionale (3D) niet-menselijke primaat enteroïden afgeleid van darmcrypten van het terminale ileum. Deze van enteroïden afgeleide monolagen werden vervolgens gebruikt in een in vitro kraswondtest om het vermogen van hyaluronaat 35 kDa (HA35), een ha-mimiek voor moedermelk, te testen om celmigratie en proliferatie langs de epitheliale wondrand te bevorderen. Nadat de monolagen tot confluentie waren gegroeid, werden ze handmatig bekrast en behandeld met HA35 (50 μg / ml, 100 μg / ml, 200 μg / ml) of controle (PBS). Celmigratie en proliferatie in de kloof werden in beeld gebracht met behulp van een doorgelaten lichtmicroscoop die is uitgerust voor live-cell imaging. Wondsluiting werd gekwantificeerd als percentage wondgenezing met behulp van de Wound Healing Size Plugin in ImageJ. Het krasgebied en de snelheid van celmigratie en het percentage wondsluiting werden gemeten gedurende 24 uur. HA35 in vitro versnelt wondgenezing in enteroïde monolagen in de dunne darm, waarschijnlijk door een combinatie van celproliferatie aan de wondrand en migratie naar het wondgebied. Deze methoden kunnen mogelijk worden gebruikt als een model om darmregeneratie in de premature menselijke dunne darm te onderzoeken.

De effecten van HA op weefselherstel en wondgenezing in verschillende weefsels en organen zijn goed gedocumenteerd; de specifieke effecten van HA met een molecuulgewicht van 35 kDa op foetale of neonatale genezing en regeneratie van de dunne darm zijn momenteel echter onbekend. Om het vermogen van HA35 te testen om wondgenezing te bevorderen in een model van de foetale of neonatale dunne darm, genereerden we 3D-intestinale enteroïden uit NHP-ileaal weefsel en dissocieerden we dit weefsel verder in afzonderlijke cellen o...

Watch this Scientific Journal Video about Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers at JoVE.com

Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers

Dit protocol beschrijft een methode om een kraswondtest vast te stellen en uit te voeren op tweedimensionale (2D) monolagen afgeleid van driedimensionale (3D) enteroïden geïsoleerd uit niet-menselijke primatenileum.

Effect van hyaluronzuur 35 kDa op een in vitro model van te vroeg geboren darmletsel en genezing met behulp van enteroïde-afgeleide monolagen

In vitro scratch wound assays are commonly used to investigate the mechanisms and characteristics of epithelial healing in a variety of tissue types. ...

Dit protocol breidt de veel voorkomende kraswondtest uit die wordt gebruikt voor regeneratiestudies met enteroïde-afgeleide monolagen die alle belangrijke celtypen van de dunne darm vertegenwoordigen. Deze techniek maakt real-time visualisatie van wondsluiting mogelijk in een prematuur 2D enteroïde monolaagmodel van darmregeneratie. Onze techniek kan worden toegepast op de studie van te vroeg geboren darm van zoogdieren, die meestal slecht gemodelleerd is met behulp van getransformeerde colorectale kankercellijnen.Begin met het ontdooien van 96 microliter extracellulaire matrix, of op ECM gebaseerde hydrogel BME, 's nachts op ijs bij twee tot acht graden Celsius. Verdun de op ECM gebaseerde hydrogel en ijskoude PBS zonder calcium of magnesium in een verhouding van één tot 50. Bedek elke put van een 24-well weefselkweekplaat met 200 microliter ijskoude verdunde HYDROGEL op basis van ECM en incubeer de gecoate plaat gedurende minimaal een uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.Adem vervolgens de media op uit de 24-well kweekplaat met de 3D-enteroïden die bestemd zijn voor monolagen en vervang deze door 500 microliter celdissociatiereagens per put. Verstoor de op ECM gebaseerde hydrogelkoepels handmatig door acht tot 12 keer op en neer te pipetteren en de inhoud van 12 putten over te brengen naar een conische buis van 15 milliliter. Was de 12 lege putten met 250 microliter celdissociatiereagens om ervoor te zorgen dat alle enteroïden zijn verwijderd en breng de inhoud over naar conische buizen van 15 milliliter.Centrifugeer de conische buizen op 300 g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius en gooi het supernatant weg. Voeg 10 milliliter ijskoude DMEM/F-12 wasbuffer toe aan de conische buizen en suspensie de enteroïde pellets door de buizen om te keren. Centrifugeer op 300g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius en verwijder het supernatant.Resuspenseer de celpellets in 12 milliliter van 37 graden Celsius Trypsin-EDTA en plaats de buisjes gedurende 10 minuten in een waterbad van 37 graden Celsius of totdat de cellen oplosbaar lijken. Voeg drie milliliter DMEM/F-12 wasbuffer toe aan elke buis om Trypsine-EDTA te verdunnen. Meng door de buizen om te keren en op ijs te plaatsen.Filter de gedissocieerde enteroïden door een 37 micrometer mesh celzeef. Verzamel de inhoud in schone conische buizen van 15 milliliter en centrifugeer de buizen gedurende vijf minuten op 300 g bij vier graden Celsius. Verwijder het supernatant uit de conische buizen en resuspenseer de celpellets met zes milliliter HOMGY.Verwijder vervolgens de op ECM gebaseerde hydrogel-gecoate plaat uit de incubator en zuig overtollige HYDROGEL-oplossing op basis van ECU op zonder het gecoate oppervlak te krassen of de plaat volledig te drogen. Voeg 500 microliter van de gecombineerde HOMGY-celsuspensie van 12 milliliter toe aan elke put van de 24-wellplaat bedekt met ECM-gebaseerde hydrogel. Draai de plaat rond met het deksel erop om een gelijkmatige verdeling van cellen in de putten te garanderen.Incubeer de plaat bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide en wissel elke twee dagen HOMGY-media uit totdat de monolagen meer dan 90% samenvloeiing bereiken. Zodra de monolagen meer dan 90% confluency bereiken, ademt u de media op om cellen te verwijderen die zich niet hechten. Behandel de cellen met 500 microliter HA35 of PBS opgelost in HOMGY gedurende 24 uur.Verwijder daarna de media zonder het oppervlak van de monolaag te verstoren. Maak met behulp van een pipetpunt van 200 microliter een lineaire kras over de volledige oppervlaktediameter van de monolaag in elke put, waarbij u moet oppassen dat u de monolagen niet laat drogen. Was de bekraste monolagen eenmaal met 500 microliter 1X PBS en voeg 500 microliter HA35 of PBS opgelost in HOMGY toe.Breng de plaat over naar het live celanalyse-instrument in een incubator van 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Klik onder het pictogram Schema in de live celanalysesoftware op het pictogram Wizard Nieuw vaartuig starten. Selecteer Scannen op schema en klik vervolgens op Volgende.Selecteer Nieuw onder Vaartuig maken en klik op Volgende, selecteer vervolgens Hele put onder Scantype en klik op Volgende. Kies Fase voor beeldkanalen en 4x voor het objectief. Selecteer de plaatfabrikant en het catalogusnummer in de lijst en klik op Volgende.Selecteer een lege vatlocatie gevolgd door het gewenste scanpatroon. Voer de naam van het bord in bij Naam en selecteer plus om een plaatindeling te maken. Selecteer kleine plus om een behandelingsnaam te maken.Voer een korte naam in en vervolgens OK. Markeer de plaatputten die overeenkomen met die behandeling en sla grote plus om putten aan te wijzen met die behandeling. Voer de samengestelde concentratie in en klik op OK. Wanneer de plaat is voltooid, selecteert u OK, Volgende. Selecteer Analyse uitstellen tot later, gevolgd door Nieuw schema maken met scans met tussenpozen van vier uur.Stop met scannen op één dag, nul uur. Zorg ervoor dat de samenvatting correct is en voeg deze vervolgens toe aan de planning. In live celanalysesoftware selecteert u Weergave boven aan het scherm.Navigeer in het menu Scheepsnaam naar uw voltooide 24-uursscan en dubbelklik op de scheepsnaam. Selecteer het pictogram Afbeeldingen en films exporteren aan de linkerkant, gevolgd door de optie Zoals weergegeven. Markeer de interessante bronnen en selecteer vervolgens nuttige tijdspunten en reeks afbeeldingen zoals weergegeven.Zorg ervoor dat het sequentietype en de scans correct zijn. Selecteer de gewenste locatie van de doelmap. Kies JPEG in het vervolgkeuzemenu en vervolgens Exporteren.Open ImageJ-software en upload de kraswondtestafbeelding. Selecteer Afbeelding en typ vervolgens 8-bits om de afbeelding te wijzigen van 24-bits RGB. Selecteer Plug-ins, Macro's, Installeren Wound_healing_size plug-in om de Wound Healing Size Plugin te installeren.Stel daarna de straal van het variantievenster in op 20, de drempelwaarde op 100 en het percentage verzadigde pixels op 0,001. Ja voor Schaal globaal instellen en klik vervolgens op OK. Controleer of het omlijnde gebied het wondgebied is en herhaal dit voor extra krassen. Bereken ten slotte het percentage van het wondgenezing van het krasgebied van migrerende of prolifererende cellen gedurende 24 uur met behulp van de vergelijking die op het scherm wordt weergegeven.Hier is T0 het gebied op tijd nul uur, en TC is het gebied op nul uur, vier uur, 12 uur of 24 uur. Enteroïde generatie en enteroïde-afgeleide monolayer wondgenezingsprocedure worden getoond in deze afbeeldingen. Een cultuur van driedimensionale, niet-menselijke intestinale enteroïden van primaten wordt gebruikt om te dissociëren in tweedimensionale monolagen.Monolagen werden gekweekt tot meer dan 90% samenvloeiing in een 24-well plaat en vervolgens behandeld met HA35 of PBS gedurende 24 uur. Monolayers werden vervolgens bekrast met een P200 pipetpunt. Hier zijn de representatieve beelden van HA35 in controlebehandelingen van niet-menselijke primaten enteroïde monolagen.Beelden werden verkregen op nul uur, vier uur, 12 uur en 24 uur na het uitvoeren van een kras met een P200 pipetpunt. Het effect van HA35 op wondgenezing andoïde monolagen wordt hier getoond. De verandering in wondgenezing in de loop van de tijd bij enteroïde monolagen is afhankelijk van de HA35-behandelingsconcentratie.HA35 verhoogde de wondgenezing aanzienlijk na vier uur en 12 uur bij 100 microgram per milliliter en 200 microgram per milliliter in vergelijking met controle, maar de genezingssnelheden convergeerden tussen behandelingen met 24 uur. Een van de belangrijkste dingen om te onthouden met deze procedure is dat intestinale enteroïde monolagen van korte duur zijn. Dus als ze eenmaal voor 90% vertrouwd zijn, moeten onderzoekers proberen ze snel te gebruiken.Deze techniek is ons go-to-model geworden voor premature darmregeneratie in vitro, vooral als we geïnteresseerd zijn in meer mechanische in plaats van inflammatoire letsels.

Research

JoVE Journal

Medicine

Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers

A Contusive Model of Unilateral Cervical Spinal Cord Injury Using the Infinite Horizon Impactor

Een Contusive model van eenzijdige cervicale ruggenmerg letsel met behulp van de Oneindige Horizon Impactor

While the majority of human spinal cord injuries occur in the cervical spinal cord, the vast majority of laboratory research employs animal models of ...

Murine Model of Wound Healing

Muizenmodel van wondgenezing

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

An Alkali-burn Injury Model of Corneal Neovascularization in the Mouse

Een alkali-brandwonden Model van Cornea Neovascularisatie in de muis

Under normal conditions, the cornea is avascular, and this transparency is essential for maintaining good visual acuity. Neovascularization (NV) of the ...

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Muizen Endoscopie voor<em&gt; In Vivo</em&gt; Multimodal Imaging van Carcinogenese en Evaluatie van intestinale wondgenezing en ontsteking

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions ...

Development of an Algorithm to Perform a Comprehensive Study of Autonomic Dysreflexia in Animals with High Spinal Cord Injury Using a Telemetry Device

De ontwikkeling van een algoritme om een ​​uitgebreide studie van Autonomic dysreflexie in Dieren voeren met hoge Spinal Cord Injury Met behulp van een telemetrie-apparaat

Spinal cord injury (SCI) is a debilitating neurological condition characterized by somatic and autonomic dysfunctions. In particular, SCI above the ...

Murine Model of Intestinal Ischemia-reperfusion Injury

Muizenmodel van Intestinale ischemie-reperfusie schade

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, ...

Open Tracheostomy Gastric Acid Aspiration Murine Model of Acute Lung Injury Results in Maximal Acute Nonlethal Lung Injury

Open Tracheostomie Maagzuur Aspiration muizenmodel van Acute Lung Injury Resultaten in Maximal Acute Lung Injury nonlethal

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

Verbeterde methode voor de vaststelling van een In Vitro bloed - hersenbarrière Model gebaseerd op varkens Endothelial hersencellen

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

In Vivo Evaluatie van de fractuur Callus ontwikkeling tijdens het bot genezing in muizen met behulp van een MRI-compatibele osteosynthese apparaat voor de muis dijbeen

Endochondral fracture healing is a complex process involving the development of fibrous, cartilaginous, and osseous tissue in the fracture callus. The ...