Name: effect of hyaluronic acid 35 kda on an in vitro model of preterm small intestinal injury and healing using enteroid-derived monolayers
Uploaded: 2022-07-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers at JoVE.com

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Toutes les procédures animales de cette étude ont été approuvées par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux du Centre des sciences de la santé de l’Université de l’Oklahoma. À la suite de l’approbation institutionnelle, des échantillons de commodité de l’intestin grêle fœtal provenant d’un primate prématuré non humain (PSN, gestation à 90 %, babouin olive, Papio anubis) ont été prélevés après l’euthanasie pour une étude distincte (Protocole #101523-16-03...

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	<li>Lemons, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Very+low+birth+weight+outcomes+of+the+National+Institute+of+Child+Health+and+Human+Development+Neonatal+Research+Network,+January+1995+through+December+1996.">Very low birth weight outcomes of the National Institute of Child Health and Human Development Neonatal Research Network, January 1995 through December 1996.</a> Pediatrics. 107 (1), 1 (2001).</li><li>Burge, K., Vieira, F., Eckert, J., Chaaban, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+composition,+digestion,+and+absorption+differences+among+neonatal+feeding+strategies:+Potential+implications+for+intestinal+inflammation+in+preterm+infants.">Lipid composition, digestion, and absorption differences among neonatal feeding strategies: Potential implications for intestinal inflammation in preterm infants.</a> Nutrients. 13 (2), 550 (2021).</li><li>Duffy, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+mediating+bacterial+translocation+in+the+immature+intestine.">Interactions mediating bacterial translocation in the immature intestine.</a> The Journal of Nutrition. 130, 432-436 (2000).</li><li>Nanthakumar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+excessive+intestinal+inflammation+in+necrotizing+enterocolitis:+An+immature+innate+immune+response.">The mechanism of excessive intestinal inflammation in necrotizing enterocolitis: An immature innate immune response.</a> PLoS One. 6 (3), 17776 (2011).</li><li>Nanthakumar, N. N., Fusunyan, R. D., Sanderson, I., Walker, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+in+the+developing+human+intestine:+A+possible+pathophysiologic+contribution+to+necrotizing+enterocolitis.">Inflammation in the developing human intestine: A possible pathophysiologic contribution to necrotizing enterocolitis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 6043-6048 (2000).</li><li>He, Y., Lawlor, N. T., Newburg, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+milk+components+modulate+toll-like+receptor-mediated+inflammation.">Human milk components modulate toll-like receptor-mediated inflammation.</a> Advances in Nutrition. 7 (1), 102-111 (2016).</li><li>Walker, W. A., Iyengar, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+milk,+microbiota,+and+intestinal+immune+homeostasis.">Breast milk, microbiota, and intestinal immune homeostasis.</a> Pediatric Research. 77 (1-2), 220-228 (2015).</li><li>Westerbeek, E. A., vanden Berg, A., Lafeber, H. N., Fetter, W. P., van Elburg, R. 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P., Seth, R., Cole, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+immunoglobulin+for+preventing+necrotizing+enterocolitis+in+preterm+and+low+birth+weight+neonates.">Oral immunoglobulin for preventing necrotizing enterocolitis in preterm and low birth weight neonates.</a> The Cochrane Database of Systematic Reviews. 4 (4), (2016).</li><li>Maffei, D., Schanler, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+milk+is+the+feeding+strategy+to+prevent+necrotizing+enterocolitis.">Human milk is the feeding strategy to prevent necrotizing enterocolitis.</a> Seminars in Perinatology. 41 (1), 36-40 (2017).</li><li>Patel, A. L., Kim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+milk+and+necrotizing+enterocolitis.">Human milk and necrotizing enterocolitis.</a> Seminars in Pediatric Surgery. 27 (1), 34-38 (2018).</li><li>Nolan, L. S., Parks, O. B., Good, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+immunomodulating+components+of+maternal+breast+milk+and+protection+against+necrotizing+enterocolitis.">A review of the immunomodulating components of maternal breast milk and protection against necrotizing enterocolitis.</a> Nutrients. 12 (1), 14 (2019).</li><li>Hill, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+milk+hyaluronan+enhances+innate+defense+of+the+intestinal+epithelium.">Human milk hyaluronan enhances innate defense of the intestinal epithelium.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (40), 29090-29104 (2013).</li><li>Burge, K., Bergner, E., Gunasekaran, A., Eckert, J., Chaaban, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+glycosaminoglycans+in+protection+from+neonatal+necrotizing+enterocolitis:+A+narrative+review.">The role of glycosaminoglycans in protection from neonatal necrotizing enterocolitis: A narrative review.</a> Nutrients. 12 (2), 546 (2020).</li><li>Chaaban, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acceleration+of+small+intestine+development+and+remodeling+of+the+microbiome+following+hyaluronan+35+kDa+treatment+in+neonatal+mice.">Acceleration of small intestine development and remodeling of the microbiome following hyaluronan 35 kDa treatment in neonatal mice.</a> Nutrients. 13 (6), 2030 (2021).</li><li>Gunasekaran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan+35+kDa+enhances+epithelial+barrier+function+and+protects+against+the+development+of+murine+necrotizing+enterocolitis.">Hyaluronan 35 kDa enhances epithelial barrier function and protects against the development of murine necrotizing enterocolitis.</a> Pediatric Research. 87 (7), 1177-1184 (2020).</li><li>Montenegro-Miranda, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+organoid+model+of+damage+and+repair+identifies+HNF4&#945;+as+a+critical+regulator+of+intestinal+epithelial+regeneration.">A novel organoid model of damage and repair identifies HNF4&#945; as a critical regulator of intestinal epithelial regeneration.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (2), 209-223 (2020).</li><li>Lee, C., Hong, S. N., Kim, E. R., Chang, D. K., Kim, Y. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+cell+migration+monitoring+to+analyze+drug+synergism+in+the+scratch+assay+using+the+IncuCyte+system.">Real-time cell migration monitoring to analyze drug synergism in the scratch assay using the IncuCyte system.</a> Methods in Molecular Biology. 2294, 133-142 (2021).</li><li>de Jong, J. C. W., Ijssennagger, N., van Mil, S. W. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+role+of+35+kilodalton+hyaluronan+in+promoting+defense+of+the+intestinal+epithelium.">Multifunctional role of 35 kilodalton hyaluronan in promoting defense of the intestinal epithelium.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 66 (4), 273-287 (2018).</li><li>Fraser, J. R. E., Laurent, T. C., Laurent, U. B. 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F., Ciorba, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonmicrobial+activation+of+TLRs+controls+intestinal+growth,+wound+repair,+and+radioprotection.">Nonmicrobial activation of TLRs controls intestinal growth, wound repair, and radioprotection.</a> Frontiers in Immunology. 11 (3591), 617510 (2021).</li><li>Riehl, T. E., Ee, X., Stenson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronic+acid+regulates+normal+intestinal+and+colonic+growth+in+mice.">Hyaluronic acid regulates normal intestinal and colonic growth in mice.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 303 (3), 377-388 (2012).</li><li>Riehl, T. E., Santhanam, S., Foster, L., Ciorba, M., Stenson, W. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+accurate+quantification+of+cell+migration+using+human+small+intestine+cells.">An optimized method for accurate quantification of cell migration using human small intestine cells.</a> Metabolic Engineering Communications. 3, 76-83 (2016).</li><li>Roodsant, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+2D+primary+organoid-derived+epithelial+monolayer+model+to+study+host-pathogen+interaction+in+the+small+intestine.">A human 2D primary organoid-derived epithelial monolayer model to study host-pathogen interaction in the small intestine.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 272 (2020).</li><li>Singh, A., Poling, H. M., Spence, J. R., Wells, J. M., Helmrath, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+organoids:+a+next-generation+tool+for+modeling+human+development.">Gastrointestinal organoids: a next-generation tool for modeling human development.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 319 (3), 375-381 (2020).</li><li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids+as+an+ex-vivo+model+of+host-pathogen+interactions+in+the+gastrointestinal+tract.">Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract.</a> Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1124-1134 (2014).</li><li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids+as+a+model+of+upper+small+intestinal+ion+transport+physiology+and+pathophysiology.">Human enteroids as a model of upper small intestinal ion transport physiology and pathophysiology.</a> Gastroenterology. 150 (3), 638-649 (2016).</li></ol>

Le tractus gastro-intestinal d’un nouveau-né prématuré est soumis à une pression régénératrice continue due à des expositions répétées à des agressions environnementales associées à la dysbiose, aux métabolites bactériens inflammatoires et aux toxines, et à l’hypoxie intermittente23,24. Malheureusement, l’épithélium intestinal du nouveau-né prématuré est incapable d’établir rapidement l’intégrité fonctionnelle2...

L’entérocolite nécrosante (ECN) est l’une des urgences gastro-intestinales les plus courantes chez les nouveau-nés prématurés1. La maladie se caractérise par une inflammation intestinale sévère qui peut rapidement se détériorer en nécrose intestinale, septicémie et potentiellement la mort. Bien que l’étiologie ne soit pas claire, les preuves suggèrent que l’ECN est multifactorielle et le résultat d’une interaction complexe de l’alimentation, d’une colonisation bactérienne anormale et d’un épithélium intestinal immature 2,3. Les nouveau-nés prématurés ont une perméabilité intestinale accrue, une colonisation bactérienne anormale et une faible capacité de régénération des entérocytes4,5, ce qui augmente leur risque de dysfonctionnement de la barrière intestinale, de translocation bactérienne et de développement d’ECN. Par conséquent, l’identification de stratégies ou d’interventions pour accélérer la maturation épithéliale intestinale et promouvoir la régénération ou la guérison de l’épithélium intestinal est essentielle pour prévenir cette maladie mortelle.
Des études ont démontré que le lait maternel (HM) protège contre l’ECN chez les nouveau-nés prématurés 6,7,8,9,10,11. Des études humaines et animales ont montré que les préparations à base de bovins augmentent la perméabilité intestinale et sont directement toxiques pour les cellules épithéliales intestinales 2,12. Bien qu’elles ne soient pas entièrement élucidées, les preuves suggèrent que les effets protecteurs de la HM sont médiés par des composants bioactifs tels que la lactoferrine, l’immunoglobuline A (IgA) et les oligosaccharides HM13. HM est également riche en hyaluronane (HA), un glycosaminoglycane uniquement non sulfaté avec de l’acide D-glucuronique répétitif et des disaccharides N-acétyl-D-glucosamine14,15. Fait important, nous avons montré que l’HA oral de 35 kDa (HA35), un imitateur de HM HA, atténue la gravité des lésions intestinales, empêche la translocation bactérienne et diminue la mortalité dans un modèle de lésion intestinale murine de type NEC16,17. 
Ici, les effets de HA35 sur la guérison intestinale et la régénération in vitro sont étudiés plus avant. Actuellement, le test in vitro le plus largement utilisé pour les lésions intestinales et la réparation est un test de plaie par égratignure effectué dans les monocouches de cellules du cancer colorectal (CCR). La pertinence physiologique d’un tel modèle pour l’intestin prématuré du nourrisson est limitée, car la réparation des plaies des cellules du CCR repose fortement sur la nature hautement proliférative des cellules cancéreuses plutôt que sur les processus de réparation induits par les cellules souches18. Pour surmonter cette limitation, l’établissement d’un modèle 2D de plaies entéroïdes égratignables, y compris la procédure d’isolement et de maintien des entéroïdes intestinaux grêles dérivés de cellules souches primaires provenant de primates prématurés non humains (PNH), est décrit ici. Étant donné que l’ECN prématurée est le plus souvent signalée dans l’intestin grêle distal, l’utilisation d’organoïdes de cellules épithéliales primaires dans un modèle de lésions et de réparations intestinales fournit un modèle in vitro plus physiologiquement traduisible par rapport aux modèles existants utilisant des monocouches colorectales traditionnelles18,19.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-675-49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x21mm Dish, Nunclon Delta</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>172931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well, TC-Treated, Flat Bottom Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#181;M Reversible Cell Strainer</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>27215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Sterile Cell Strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin, Bovine (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium/Nutrient Ham&#39;s Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>36254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>100-0485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte S3 Live-Cell Analysis Instrument</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>4647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte Scratch Wound Analysis Software Module</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>9600-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>06010</td>
			<td>This is HOGMY, but without the Y-27632 or antibiotics. Also used as base for HOGM, but then only missing the antibiotics.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L3012-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>136101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate-Buffered Saline), 1X [-] Calcium, Magnesium, pH 7.4</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>This is broad-spectrum antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hyaluronate, Research Grade, HA20K</td>
			<td>Lifecore Biomedical</td>
			<td>HA20K-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20 Automated Cell Counter</td>
			<td>Company: Bio-Rad</td>
			<td>1450102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 1X, 0.25% Trypsin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT25053CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72302</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effect of hyaluronic acid 35 kda on an in vitro model of preterm small intestinal injury and healing using enteroid-derived monolayers

Les tests in vitro sur les rayures sont couramment utilisés pour étudier les mécanismes et les caractéristiques de la cicatrisation épithéliale dans divers types de tissus. Ici, nous décrivons un protocole pour générer une monocouche bidimensionnelle (2D) à partir d’entéroïdes de primates non humains tridimensionnels (3D) dérivés des cryptes intestinales de l’iléon terminal. Ces monocouches dérivées d’entéroïdes ont ensuite été utilisées dans un essai in vitro sur des rayures pour tester la capacité de l’hyaluronane 35 kDa (HA35), un imitateur HA du lait humain, à favoriser la migration et la prolifération cellulaires le long du bord de la plaie épithéliale. Une fois que les monocouches ont été cultivées jusqu’à la confluence, elles ont été grattées manuellement et traitées avec HA35 (50 μg/mL, 100 μg/mL, 200 μg/mL) ou témoin (PBS). La migration et la prolifération des cellules dans l’espace ont été imagées à l’aide d’un microscope à lumière transmise équipé pour l’imagerie de cellules vivantes. La fermeture des plaies a été quantifiée en pourcentage de cicatrisation à l’aide du plug-in Wound Healing Size dans ImageJ. La zone de rayure, le taux de migration cellulaire et le pourcentage de fermeture de la plaie ont été mesurés sur 24 heures. HA35 in vitro accélère la cicatrisation des plaies dans les monocouches entéroïdes de l’intestin grêle, probablement par une combinaison de prolifération cellulaire au bord de la plaie et de migration vers la zone de la plaie. Ces méthodes peuvent potentiellement être utilisées comme modèle pour explorer la régénération intestinale dans l’intestin grêle humain prématuré.

Les effets de l’AH sur la réparation tissulaire et la cicatrisation des plaies dans divers tissus et organes sont bien documentés; cependant, les effets spécifiques de l’HA d’un poids moléculaire de 35 kDa sur la cicatrisation et la régénération de l’intestin grêle fœtal ou néonatal sont actuellement inconnus. Pour tester la capacité de HA35 à favoriser la cicatrisation des plaies dans un modèle de l’intestin grêle fœtal ou néonatal, nous avons généré des entéroïdes intestinaux 3D à partir...

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Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers

Ce protocole décrit une méthode pour établir et effectuer un essai de plaie par égratignures sur des monocouches bidimensionnelles (2D) dérivées d’entéroïdes tridimensionnels (3D) isolés de l’iléon de primates non humains.

Effet de l’acide hyaluronique 35 kDa sur un modèle in vitro de lésion prématurée de l’intestin grêle prématuré et cicatrisation à l’aide de monocouches dérivées d’entéroïdes

In vitro scratch wound assays are commonly used to investigate the mechanisms and characteristics of epithelial healing in a variety of tissue types. ...

Ce protocole étend le test très courant des plaies par égratignures utilisé pour les études de régénération avec des monocouches dérivées d’entéroïdes représentant tous les principaux types de cellules de l’intestin grêle. Cette technique permet de visualiser en temps réel la fermeture de la plaie dans un modèle monocouche entéroïde 2D prématuré de régénération intestinale. Notre technique peut être appliquée à l’étude de l’intestin des mammifères prématurés, qui est généralement mal modélisé à l’aide de lignées cellulaires transformées de cancer colorectal.Commencez par décongeler 96 microlitres de matrice extracellulaire, ou BME d’hydrogel à base d’ECM, pendant la nuit sur de la glace à deux à huit degrés Celsius. Diluer l’hydrogel à base d’ECM et le PBS glacé sans calcium ni magnésium dans un rapport de un à 50. Enduisez chaque puits d’une plaque de culture tissulaire de 24 puits avec 200 microlitres d’hydrogel à base d’ECM dilué glacé et incuber la plaque enduite pendant au moins une heure à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.Aspirez ensuite le média de la plaque de culture de 24 puits contenant les entéroïdes 3D destinés aux monocouches et remplacez-le par 500 microlitres de réactif de dissociation cellulaire par puits. Perturbez manuellement les dômes d’hydrogel à base d’ECM en pipetant de haut en bas huit à 12 fois et en transférant le contenu de 12 puits dans un tube conique de 15 millilitres. Lavez les 12 puits vides avec 250 microlitres de réactif de dissociation cellulaire pour vous assurer que tous les entéroïdes ont été éliminés et transférez le contenu dans des tubes coniques de 15 millilitres.Centrifuger les tubes coniques à 300 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et jeter le surnageant. Ajouter 10 millilitres de tampon de lavage DMEM/F-12 glacé aux tubes coniques et suspendre les pastilles entéroïdes en retournant les tubes. Centrifuger à 300g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et retirer le surnageant.Remettez en suspension les granulés cellulaires dans 12 millilitres de trypsine-EDTA à 37 degrés Celsius et placez les tubes dans un bain-marie de 37 degrés Celsius pendant 10 minutes ou jusqu’à ce que les cellules semblent solubles. Ajouter trois millilitres de tampon de lavage DMEM / F-12 à chaque tube pour diluer la trypsine-EDTA. Mélanger en inversant les tubes et placer sur de la glace.Filtrer les entéroïdes dissociés à travers une crépine à mailles de 37 micromètres. Recueillir le contenu dans des tubes coniques propres de 15 millilitres et centrifuger les tubes à 300 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Retirez le surnageant des tubes coniques et remettez en suspension les pastilles de la cellule avec six millilitres de HOMGY.Ensuite, retirez la plaque enduite d’hydrogel à base d’ECM de l’incubateur et aspirez tout excès de solution d’hydrogel à base d’ECM sans rayer la surface revêtue ou sécher complètement la plaque. Ajouter 500 microlitres de la suspension cellulaire combinée HOMGY de 12 millilitres dans chaque puits de la plaque de 24 puits recouverte d’hydrogel à base d’ECM. Faites tourner la plaque avec le couvercle pour assurer une répartition uniforme des cellules dans les puits.Incuber la plaque à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone, en échangeant les milieux HOMGY tous les deux jours jusqu’à ce que les monocouches atteignent plus de 90% de confluence. Une fois que les monocouches atteignent plus de 90% de confluence, aspirez le support pour éliminer toutes les cellules qui ne parviennent pas à se fixer. Traiter les cellules avec 500 microlitres de HA35 ou de PBS dissous dans HOMGY pendant 24 heures.Après cela, retirez le support sans perturber la surface de la monocouche. À l’aide d’une pointe de pipette de 200 microlitres, effectuez une rayure linéaire sur tout le diamètre de surface de la monocouche dans chaque puits, en prenant soin de ne pas laisser sécher les monocouches. Lavez les monocouches rayées une fois avec 500 microlitres de 1X PBS et ajoutez 500 microlitres de HA35 ou PBS dissous dans HOMGY.Transférez la plaque à l’instrument d’analyse de cellules vivantes dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Sous l’icône Planifier dans le logiciel d’analyse de cellules en direct, cliquez sur l’icône Assistant Lancer l’ajout d’un nouveau navire. Sélectionnez Analyser selon le calendrier, puis cliquez sur Suivant.Sélectionnez Nouveau sous Créer un vaisseau et cliquez sur Suivant, puis sélectionnez Puits entier sous Type de numérisation et cliquez sur Suivant. Choisissez Phase pour les canaux d’image et 4x pour l’objectif. Sélectionnez le fabricant de la plaque et le numéro de catalogue dans la liste fournie et cliquez sur Suivant.Sélectionnez un emplacement de navire vide suivi du modèle de balayage souhaité. Entrez le nom de la plaque dans Nom, puis sélectionnez plus pour créer une disposition de plaque. Sélectionnez petit plus pour créer un nom de traitement.Entrez le nom court, puis OK. Mettez en évidence les puits à plaques correspondant à ce traitement et frappez grand plus pour désigner les puits avec ce traitement. Entrez la concentration du composé et cliquez sur OK. Lorsque la plaque est terminée, sélectionnez OK, Suivant. Sélectionnez Reporter l’analyse à plus tard, puis Créer une nouvelle planification avec des analyses à des intervalles de quatre heures.Arrêtez l’analyse à un jour, zéro heure. Assurez-vous que le résumé est correct, puis ajoutez-le à la planification. Dans le logiciel d’analyse de cellules dynamiques, sélectionnez Afficher en haut de l’écran.Dans le menu Nom du navire, accédez à votre analyse terminée sur 24 heures et double-cliquez sur le nom du navire. Sélectionnez l’icône Exporter les images et les films sur la gauche, suivie de l’option Comme affiché. Mettez en surbrillance les puits d’intérêt, puis sélectionnez les points d’intérêt temporels et la série d’images affichée.Assurez-vous que le type de séquence et les analyses sont corrects. Sélectionnez l’emplacement du dossier cible souhaité. Choisissez JPEG dans le menu déroulant, puis Exporter.Ouvrez le logiciel ImageJ et téléchargez l’image du test de la plaie par rayure. Sélectionnez Image, puis tapez 8 bits pour modifier l’image à partir de RVB 24 bits. Sélectionnez Plugins, Macros, Installer Wound_healing_size plugin pour installer le plugin Wound Healing Size.Après cela, définissez le rayon de la fenêtre de variance sur 20, la valeur seuil sur 100, le pourcentage de pixels saturés sur 0,001. Oui pour Set Scale global, puis cliquez sur OK. Vérifiez que la zone définie est la zone de la plaie et répétez l’opération pour d’autres égratignures. Enfin, calculez le pourcentage de cicatrisation de la zone de rayure des cellules migrantes ou proliférantes sur 24 heures à l’aide de l’équation affichée à l’écran.Ici, T0 est la zone au temps zéro heure, et TC est la zone à zéro heure, quatre heures, 12 heures ou 24 heures. La génération d’entéroïdes et la procédure de cicatrisation des plaies monocouche dérivée d’entéroïdes sont montrées dans ces images. Une culture d’entéroïdes intestinaux tridimensionnels non humains de primates est utilisée pour se dissocier en monocouches bidimensionnelles.Les monocouches ont été cultivées à plus de 90% de confluence dans une plaque de 24 puits, puis traitées avec HA35 ou PBS pendant 24 heures. Les monocouches ont ensuite été rayées avec une pointe de pipette P200. Voici les images représentatives de HA35 dans les traitements de contrôle des monocouches entéroïdes de primates non humains.Les images ont été obtenues à zéro heure, quatre heures, 12 heures et 24 heures après avoir effectué une rayure avec une pointe de pipette P200. L’effet de HA35 sur les monocouches andoïdes cicatrisantes est montré ici. Le changement dans la cicatrisation des plaies au fil du temps dans les monocouches entéroïdes dépend de la concentration du traitement HA35.HA35 a significativement augmenté la cicatrisation des plaies après quatre heures et 12 heures à 100 microgrammes par millilitre et 200 microgrammes par millilitre par rapport au contrôle, mais les taux de guérison ont convergé entre les traitements de 24 heures. L’une des choses les plus importantes à retenir avec cette procédure est que les monocouches entéroïdes intestinales sont de courte durée. Ainsi, une fois qu’ils sont à 90% confluides, les enquêteurs devraient chercher à les utiliser rapidement.Cette technique est devenue notre modèle de prédilection pour la régénération intestinale prématurée in vitro, surtout si nous sommes intéressés par des lésions plus mécaniques qu’inflammatoires.

Research

JoVE Journal

Medicine

Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers

A Contusive Model of Unilateral Cervical Spinal Cord Injury Using the Infinite Horizon Impactor

Un modèle de contusion unilatérale des blessures moelle épinière cervicale aide de l&#39;impacteur Infinite Horizon

While the majority of human spinal cord injuries occur in the cervical spinal cord, the vast majority of laboratory research employs animal models of ...

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Médecine

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Murin endoscopie pour<em&gt; In Vivo</em&gt; Guérison multimodale d&#39;imagerie de la cancérogenèse et de l&#39;évaluation de la plaie intestinale et l&#39;inflammation

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions ...

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Développement d&#39;un algorithme d&#39;exécution d&#39;une étude approfondie des Autonomic Dysréflexie chez les animaux avec High Spinal Cord Injury utilisation d&#39;un périphérique Télémétrie

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