Name: effect of hyaluronic acid 35 kda on an in vitro model of preterm small intestinal injury and healing using enteroid-derived monolayers
Uploaded: 2022-07-28T13:00:00
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Dieser Inhalt liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health dar. HC wird durch den Zuschuss P20GM134973 der National Institutes of Health unterstützt. KB wird durch einen Zuschuss der Children's Hospital Foundation (CHF) und der Presbyterian Health Foundation (PHF) unterstützt. Lebendzellbildgebungsdienste, die vom Kern der Cancer Functional Genomics bereitgestellt werden, wurden teilweise durch den National Institute of General Medical Sciences Grant P20GM103639 und den National Cancer Institute Grant P30CA225520 der National Institutes of Health unterstützt, die an das Stephenson Cancer Center der University of Oklahoma Health Sciences Center vergeben wurden.

Alle Tierverfahren in dieser Studie wurden vom University of Oklahoma Health Sciences Center Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt. Nach institutioneller Zulassung wurden fetale Dünndarmproben von einem frühgeborenen nichtmenschlichen Primaten (NHP, 90% Trächtigkeit, Olivenpavian, Papio anubis) nach Euthanasie für eine separate Studie gewonnen (Protokoll #101523-16-039-I)20.
1. Etablierung von frühgeborenen nicht-menschlichen Primaten...

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	<li>Lemons, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Very+low+birth+weight+outcomes+of+the+National+Institute+of+Child+Health+and+Human+Development+Neonatal+Research+Network,+January+1995+through+December+1996.">Very low birth weight outcomes of the National Institute of Child Health and Human Development Neonatal Research Network, January 1995 through December 1996.</a> Pediatrics. 107 (1), 1 (2001).</li><li>Burge, K., Vieira, F., Eckert, J., Chaaban, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+composition,+digestion,+and+absorption+differences+among+neonatal+feeding+strategies:+Potential+implications+for+intestinal+inflammation+in+preterm+infants.">Lipid composition, digestion, and absorption differences among neonatal feeding strategies: Potential implications for intestinal inflammation in preterm infants.</a> Nutrients. 13 (2), 550 (2021).</li><li>Duffy, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+mediating+bacterial+translocation+in+the+immature+intestine.">Interactions mediating bacterial translocation in the immature intestine.</a> The Journal of Nutrition. 130, 432-436 (2000).</li><li>Nanthakumar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+excessive+intestinal+inflammation+in+necrotizing+enterocolitis:+An+immature+innate+immune+response.">The mechanism of excessive intestinal inflammation in necrotizing enterocolitis: An immature innate immune response.</a> PLoS One. 6 (3), 17776 (2011).</li><li>Nanthakumar, N. N., Fusunyan, R. D., Sanderson, I., Walker, W. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+milk,+microbiota,+and+intestinal+immune+homeostasis.">Breast milk, microbiota, and intestinal immune homeostasis.</a> Pediatric Research. 77 (1-2), 220-228 (2015).</li><li>Westerbeek, E. A., vanden Berg, A., Lafeber, H. N., Fetter, W. P., van Elburg, R. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+organoid+model+of+damage+and+repair+identifies+HNF4&#945;+as+a+critical+regulator+of+intestinal+epithelial+regeneration.">A novel organoid model of damage and repair identifies HNF4&#945; as a critical regulator of intestinal epithelial regeneration.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (2), 209-223 (2020).</li><li>Lee, C., Hong, S. N., Kim, E. R., Chang, D. K., Kim, Y. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+role+of+35+kilodalton+hyaluronan+in+promoting+defense+of+the+intestinal+epithelium.">Multifunctional role of 35 kilodalton hyaluronan in promoting defense of the intestinal epithelium.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 66 (4), 273-287 (2018).</li><li>Fraser, J. R. E., Laurent, T. C., Laurent, U. B. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+organoids:+a+next-generation+tool+for+modeling+human+development.">Gastrointestinal organoids: a next-generation tool for modeling human development.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 319 (3), 375-381 (2020).</li><li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids+as+an+ex-vivo+model+of+host-pathogen+interactions+in+the+gastrointestinal+tract.">Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract.</a> Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1124-1134 (2014).</li><li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids+as+a+model+of+upper+small+intestinal+ion+transport+physiology+and+pathophysiology.">Human enteroids as a model of upper small intestinal ion transport physiology and pathophysiology.</a> Gastroenterology. 150 (3), 638-649 (2016).</li></ol>

Der Magen-Darm-Trakt eines Frühgeborenen steht unter ständigem regenerativem Druck durch wiederholte Exposition gegenüber Umwelteinflüssen im Zusammenhang mit Dysbiose, entzündlichen bakteriellen Metaboliten und Toxinen und intermittierender Hypoxie23,24. Leider ist das Darmepithel des Frühgeborenen nicht in der Lage, schnell funktionelle Integrität herzustellen23, was zu Barrierestörungen, erhöhter Darmpermeabilität und in schwe...

Die nekrotisierende Enterokolitis (NEC) ist einer der häufigsten gastrointestinalen Notfälle bei Frühgeborenen1. Die Krankheit ist durch eine schwere Darmentzündung gekennzeichnet, die sich schnell zu Darmnekrose, Sepsis und möglicherweise zum Tod verschlechtern kann. Obwohl die Ätiologie unklar ist, deuten Hinweise darauf hin, dass NEC multifaktoriell ist und das Ergebnis einer komplexen Wechselwirkung von Fütterung, abnormaler bakterieller Besiedlung und einem unreifen Darmepithelist 2,3. Frühgeborene haben eine erhöhte Darmpermeabilität, eine abnormale bakterielle Besiedlung und eine niedrige Enterozytenregenerationskapazität4,5, was ihr Risiko für Darmbarrierestörungen, bakterielle Translokation und NEC-Entwicklung erhöht. Daher ist die Identifizierung von Strategien oder Interventionen zur Beschleunigung der Darmepithelreifung und zur Förderung der Regeneration oder Heilung des Darmepithels entscheidend für die Verhinderung dieser tödlichen Krankheit.
Studien haben gezeigt, dass Muttermilch (HM) bei Frühgeborenen 6,7,8,9,10,11 vor NEC schützt. Sowohl Human- als auch Tierstudien haben gezeigt, dass die Formel auf Rinderbasis die Darmpermeabilität erhöht und direkt toxisch für Darmepithelzellen ist 2,12. Obwohl nicht vollständig aufgeklärt, deuten Beweise darauf hin, dass die schützende Wirkung von HM durch bioaktive Komponenten wie Lactoferrin, Immunglobulin A (IgA) und HM-Oligosaccharide vermitteltwird 13. HM ist auch reich an Hyaluron (HA), einem einzigartigen sulfatfreien Glykosaminoglykan mit wiederholter D-Glucuronsäure und N-Acetyl-D-Glucosamindisaccharide14,15. Wichtig ist, dass wir gezeigt haben, dass orale 35 kDa HA (HA35), eine HM HA-Nachahmung, die Schwere der Darmverletzung abschwächt, bakterielle Translokation verhindert und die Mortalität in einem murinen NEC-ähnlichen Darmverletzungsmodell verringert16,17. 
Hier werden die Wirkungen von HA35 auf die Darmheilung und Regeneration in vitro weiter untersucht. Derzeit ist der am weitesten verbreitete In-vitro-Assay für Darmverletzung und -reparatur ein Kratzwundtest, der in Darmkrebszellmonoschichten (CRC) durchgeführt wird. Die physiologische Relevanz eines solchen Modells für den Frühgeborenendarm ist begrenzt, da die Wundreparatur von Darmkrebszellen stark von der hochgradig proliferativen Natur von Krebszellen und nicht von stammzellgesteuerten Reparaturprozessen abhängt18. Um diese Einschränkung zu überwinden, wird hier die Etablierung eines enteroiden 2D-Kratzwundmodells beschrieben, einschließlich des Verfahrens zur Isolierung und Aufrechterhaltung primärer Stammzell-abgeleiteter Dünndarmenteroide von Frühgeborenen nicht-menschlichen Primaten (NHP). Da vorzeitige NEC am häufigsten im distalen Dünndarm berichtet wird, liefert die Verwendung von primären Epithelzellorganoiden in einem Modell der Darmschädigung und -reparatur ein physiologisch besser übersetzbares In-vitro-Modell im Vergleich zu bestehenden Modellen, die traditionelle kolorektale Monoschichten verwenden18,19.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-675-49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x21mm Dish, Nunclon Delta</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>172931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well, TC-Treated, Flat Bottom Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#181;M Reversible Cell Strainer</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>27215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Sterile Cell Strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin, Bovine (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium/Nutrient Ham&#39;s Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>36254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>100-0485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte S3 Live-Cell Analysis Instrument</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>4647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte Scratch Wound Analysis Software Module</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>9600-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>06010</td>
			<td>This is HOGMY, but without the Y-27632 or antibiotics. Also used as base for HOGM, but then only missing the antibiotics.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L3012-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>136101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate-Buffered Saline), 1X [-] Calcium, Magnesium, pH 7.4</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>This is broad-spectrum antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hyaluronate, Research Grade, HA20K</td>
			<td>Lifecore Biomedical</td>
			<td>HA20K-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20 Automated Cell Counter</td>
			<td>Company: Bio-Rad</td>
			<td>1450102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 1X, 0.25% Trypsin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT25053CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72302</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effect of hyaluronic acid 35 kda on an in vitro model of preterm small intestinal injury and healing using enteroid-derived monolayers

In-vitro-Kratzwund-Assays werden häufig verwendet, um die Mechanismen und Eigenschaften der Epithelheilung in einer Vielzahl von Gewebetypen zu untersuchen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Erzeugung einer zweidimensionalen (2D) Monoschicht aus dreidimensionalen (3D) nichtmenschlichen Primatenenteroiden, die aus Darmkrypten des terminalen Ileums stammen. Diese enteroid-abgeleiteten Monoschichten wurden dann in einem In-vitro-Kratzwund-Assay verwendet, um die Fähigkeit von Hyaluron 35 kDa (HA35), einer menschlichen Milch-HA-Nachahmung, zu testen, Zellmigration und -proliferation entlang der epithelialen Wundkante zu fördern. Nachdem die Monolagen bis zum Konfluenzen gewachsen waren, wurden sie manuell zerkratzt und mit HA35 (50 μg/ml, 100 μg/ml, 200 μg/ml) oder Kontrolle (PBS) behandelt. Die Zellmigration und -proliferation in die Lücke wurde mit einem Durchlichtmikroskop abgebildet, das für die Bildgebung lebender Zellen ausgestattet war. Der Wundverschluss wurde mit dem Wundheilungsgrößen-Plugin in ImageJ als prozentuale Wundheilung quantifiziert. Die Kratzfläche und die Rate der Zellmigration sowie der Prozentsatz des Wundverschlusses wurden über 24 h gemessen. HA35 beschleunigt in vitro die Wundheilung in Dünndarm-Enteroid-Monoschichten, wahrscheinlich durch eine Kombination aus Zellproliferation am Wundrand und Migration in den Wundbereich. Diese Methoden können möglicherweise als Modell verwendet werden, um die Darmregeneration im Frühdarm des menschlichen Dünndarms zu untersuchen.

Die Auswirkungen von HA auf die Gewebereparatur und Wundheilung in verschiedenen Geweben und Organen sind gut dokumentiert; Die spezifischen Wirkungen von HA mit einem Molekulargewicht von 35 kDa auf die fetale oder neonatale Dünndarmheilung und -regeneration sind derzeit jedoch nicht bekannt. Um die Fähigkeit von HA35 zu testen, die Wundheilung in einem Modell des fetalen oder neonatalen Dünndarms zu fördern, erzeugten wir 3D-Darmenteroide aus NHP-Ileumgewebe und dissoziierten dieses Gewebe weiter in einzelne Zellen...

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Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Erstellung und Durchführung eines Kratzwundtests an zweidimensionalen (2D) Monoschichten, die aus dreidimensionalen (3D) Enteroiden abgeleitet sind, die aus nichtmenschlichem Primatenileum isoliert wurden.

Wirkung von Hyaluronsäure 35 kDa auf ein In-vitro-Modell der vorzeitigen Dünndarmverletzung und Heilung unter Verwendung enteroid-abgeleiteter Monoschichten

In vitro scratch wound assays are commonly used to investigate the mechanisms and characteristics of epithelial healing in a variety of tissue types. ...

Dieses Protokoll erweitert den sehr gebräuchlichen Kratzwundtest, der für Regenerationsstudien verwendet wird, um enteroid-abgeleitete Monoschichten, die alle wichtigen Zelltypen des Dünndarms repräsentieren. Diese Technik ermöglicht die Echtzeit-Visualisierung des Wundverschlusses in einem vorzeitigen enteroiden 2D-Monolayer-Modell der Darmregeneration. Unsere Technik kann auf die Untersuchung des Frühgeborenendarms von Säugetieren angewendet werden, der typischerweise schlecht mit transformierten Darmkrebszelllinien modelliert wird.Beginnen Sie mit dem Auftauen von 96 Mikrolitern extrazellulärer Matrix oder ECM-basiertem Hydrogel BME über Nacht auf Eis bei zwei bis acht Grad Celsius. Verdünnen Sie das ECM-basierte Hydrogel und eiskaltes PBS ohne Kalzium oder Magnesium im Verhältnis eins zu 50. Beschichten Sie jede Vertiefung einer 24-Well-Gewebekulturplatte mit 200 Mikrolitern eiskalt verdünntem Hydrogel auf ECM-Basis und inkubieren Sie die beschichtete Platte für mindestens eine Stunde bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.Dann saugen Sie das Medium von der 24-Well-Kulturplatte ab, die die für Monoschichten bestimmten 3D-Enteroide enthält, und ersetzen Sie es durch 500 Mikroliter Zelldissoziationsreagenz pro Well. Brechen Sie die ECM-basierten Hydrogelkuppeln manuell, indem Sie acht- bis 12-mal auf und ab pipettieren und den Inhalt von 12 Vertiefungen in ein 15-Milliliter-konisches Rohr übertragen. Waschen Sie die 12 leeren Vertiefungen mit 250 Mikrolitern Zelldissoziationsreagenz, um sicherzustellen, dass alle Enteroide entfernt wurden, und geben Sie den Inhalt in konische 15-Milliliter-Röhrchen.Die konischen Röhrchen bei 300g fünf Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren und den Überstand verwerfen. 10 Milliliter eiskalter DMEM/F-12-Waschpuffer in die konischen Röhrchen geben und die enteroiden Pellets durch Inverdrehen der Röhrchen aufhängen. Bei 300g fünf Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren und den Überstand entfernen.Resuspendieren Sie die Zellpellets in 12 Milliliter 37 Grad Celsius Trypsin-EDTA und legen Sie die Röhrchen für 10 Minuten in ein 37 Grad Celsius warmes Wasserbad oder bis die Zellen löslich erscheinen. Fügen Sie drei Milliliter DMEM / F-12-Waschpuffer in jedes Röhrchen hinzu, um Trypsin-EDTA zu verdünnen. Durch Umdrehen der Röhrchen mischen und auf Eis legen.Filtern Sie die dissoziierten Enteroide durch ein 37 Mikrometer großes Maschenzellsieb. Sammeln Sie den Inhalt in sauberen 15-Milliliter-konischen Röhrchen und zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 300 g fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand aus den konischen Röhrchen und resuspendieren Sie die Zellpellets mit sechs Milliliter HOMGY.Als nächstes entfernen Sie die ECM-basierte Hydrogel-beschichtete Platte aus dem Inkubator und saugen Sie überschüssige ECM-basierte Hydrogellösung ab, ohne die beschichtete Oberfläche zu zerkratzen oder die Platte vollständig auszutrocknen. Fügen Sie 500 Mikroliter der kombinierten 12 Milliliter HOMGY-Zellsuspension in jede Vertiefung der 24-Well-Platte hinzu, die mit ECM-basiertem Hydrogel beschichtet ist. Schwenken Sie die Platte mit aufgesetztem Deckel, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen in den Vertiefungen zu gewährleisten.Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid und wechseln Sie alle zwei Tage HOMGY-Medien, bis die Monoschichten mehr als 90% Konfluenz erreichen. Sobald die Monoschichten eine Konfluenz von mehr als 90% erreicht haben, saugen Sie das Medium ab, um alle Zellen zu entfernen, die sich nicht anhaften. Behandeln Sie die Zellen mit 500 Mikrolitern HA35 oder PBS, gelöst in HOMGY für 24 Stunden.Danach entfernen Sie das Medium, ohne die Oberfläche der Monoschicht zu stören. Machen Sie mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze einen linearen Kratzer über den gesamten Oberflächendurchmesser der Monoschicht in jeder Vertiefung und achten Sie darauf, die Monoschichten nicht trocknen zu lassen. Waschen Sie die zerkratzten Monolagen einmal mit 500 Mikrolitern 1X PBS und fügen Sie 500 Mikroliter HA35 oder PBS gelöst in HOMGY hinzu.Die Platte wird innerhalb eines Inkubators mit 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid in das Analysegerät für lebende Zellen überführt. Klicken Sie in der Live-Zellanalyse-Software unter dem Symbol Zeitplan auf das Symbol Assistent zum Hinzufügen neuer Schiffe starten. Wählen Sie Scan on Schedule (Nach Zeitplan scannen) und klicken Sie dann auf Next (Weiter).Wählen Sie Neu unter Schiff erstellen und klicken Sie auf Weiter, wählen Sie dann Whole Well unter Scan Type (Scantyp) und klicken Sie auf Next (Weiter). Wählen Sie Phase für Bildkanäle und 4x für das Objektiv. Wählen Sie den Plattenhersteller und die Katalognummer aus der bereitgestellten Liste aus und klicken Sie auf Weiter.Wählen Sie eine leere Gefäßposition gefolgt von dem gewünschten Scanmuster aus. Geben Sie den Kennzeichennamen in Name ein, und wählen Sie dann plus aus, um ein Plattenlayout zu erstellen. Wählen Sie ein kleines Plus, um einen Behandlungsnamen zu erstellen.Geben Sie den Kurznamen und dann OK ein. Markieren Sie die Plattenschächten, die dieser Behandlung entsprechen, und treffen Sie ein großes Plus, um Vertiefungen mit dieser Behandlung zu kennzeichnen. Geben Sie die Konzentration der Verbindung ein und klicken Sie auf OK. Wenn die Platte fertig ist, wählen Sie OK, Weiter. Wählen Sie Analyse auf später verschieben und anschließend Neuen Zeitplan mit Scans in Intervallen von vier Stunden erstellen.Stoppen Sie das Scannen an einem Tag, null Stunden. Stellen Sie sicher, dass die Zusammenfassung korrekt ist, und fügen Sie sie dann dem Zeitplan hinzu. Wählen Sie in der Live-Zellanalyse-Software oben auf dem Bildschirm Ansicht aus.Navigieren Sie im Menü Schiffsname zu Ihrem abgeschlossenen 24-Stunden-Scan und doppelklicken Sie auf den Schiffsnamen. Wählen Sie das Symbol Bilder und Filme exportieren auf der linken Seite, gefolgt von der Option Wie angezeigt. Markieren Sie die Vertiefungen von Interesse, und wählen Sie dann die gewünschten Zeitpunkte und die angezeigte Bildserie aus.Stellen Sie sicher, dass der Sequenztyp und die Scans korrekt sind. Wählen Sie den gewünschten Speicherort des Zielordners aus. Wählen Sie JPEG aus dem Dropdown-Menü und dann Exportieren.Öffnen Sie die ImageJ-Software und laden Sie das Kratzwund-Assay-Bild hoch. Wählen Sie Bild aus, und geben Sie dann 8-Bit ein, um das Bild von 24-Bit-RGB zu ändern. Wählen Sie Plugins, Makros, Installieren Wound_healing_size Plugin aus, um das Wundheilungsgrößen-Plugin zu installieren.Danach setzen Sie den Radius des Varianzfensters auf 20, den Schwellenwert auf 100, den Prozentsatz der gesättigten Pixel auf 0,001. Ja für Set Scale global und klicken Sie dann auf OK. Stellen Sie sicher, dass der umrissene Bereich der Wundbereich ist, und wiederholen Sie den Vorgang für zusätzliche Kratzer. Berechnen Sie schließlich den Prozentsatz der Wundheilung im Kratzbereich von wandernden oder proliferierenden Zellen über 24 Stunden unter Verwendung der auf dem Bildschirm angezeigten Gleichung.Hier ist T0 der Bereich zum Zeitpunkt Null Stunden und TC ist der Bereich bei null Stunden, vier Stunden, 12 Stunden oder 24 Stunden. Die enteroide Generierung und das enteroid-abgeleitete Monolayer-Wundheilungsverfahren sind in diesen Bildern dargestellt. Eine Kultur von dreidimensionalen, nicht-menschlichen Primaten-Darm-Enteroiden wird verwendet, um in zweidimensionale Monoschichten zu dissoziieren.Monoschichten wurden auf mehr als 90% Konfluenz in einer 24-Well-Platte gezüchtet und dann 24 Stunden lang mit HA35 oder PBS behandelt. Monolagen wurden dann mit einer P200-Pipettenspitze zerkratzt. Hier sind die repräsentativen Bilder von HA35 in Kontrollbehandlungen von enteroiden Monoschichten nichtmenschlicher Primaten gezeigt.Die Bilder wurden nach null Stunden, vier Stunden, 12 Stunden und 24 Stunden nach dem Scratchen mit einer P200-Pipettenspitze aufgenommen. Die Wirkung von HA35 auf Wundheilung und oide Monoschichten wird hier gezeigt. Die Veränderung der Wundheilung im Laufe der Zeit in enteroiden Monoschichten ist abhängig von der HA35-Behandlungskonzentration.HA35 erhöhte signifikant die Wundheilung nach vier Stunden und 12 Stunden bei 100 Mikrogramm pro Milliliter und 200 Mikrogramm pro Milliliter im Vergleich zur Kontrolle, aber die Heilungsraten konvergierten zwischen den Behandlungen um 24 Stunden. Eines der wichtigsten Dinge, an die man sich bei diesem Verfahren erinnern sollte, ist, dass intestinale enteroide Monoschichten kurzlebig sind. Sobald sie zu 90% konflüssig sind, sollten die Ermittler versuchen, sie schnell zu verwenden.Diese Technik ist zu unserem bevorzugten Modell für die vorzeitige Darmregeneration in vitro geworden, insbesondere wenn wir eher an mechanischen als an entzündlichen Verletzungen interessiert sind.

Research

JoVE Journal

Medicine

Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers

A Contusive Model of Unilateral Cervical Spinal Cord Injury Using the Infinite Horizon Impactor

Ein Modell von gequetscht Einseitige Cervical Spinal Cord Injury Mit dem Infinite Horizon Impactor

While the majority of human spinal cord injuries occur in the cervical spinal cord, the vast majority of laboratory research employs animal models of ...

Forschung

Medizin

Murine Model of Wound Healing

Mausmodell der Wundheilung

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

An Alkali-burn Injury Model of Corneal Neovascularization in the Mouse

Eine Alkali-brennen Verletzungsmodell der Hornhaut Neovaskularisation bei der Maus

Under normal conditions, the cornea is avascular, and this transparency is essential for maintaining good visual acuity. Neovascularization (NV) of the ...

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Murine Endoskopie für<em&gt; In Vivo</em&gt; Multimodale Bildgebung der Krebsentstehung und Bewertung der Darm Wundheilung und Entzündung

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions ...

Development of an Algorithm to Perform a Comprehensive Study of Autonomic Dysreflexia in Animals with High Spinal Cord Injury Using a Telemetry Device

Entwicklung eines Algorithmus einer umfassenden Studie von Autonomic Dysreflexie in Tiere zu Führen mit hoher Rückenmark-Verletzung ein Telemetrie-Gerät verwenden

Spinal cord injury (SCI) is a debilitating neurological condition characterized by somatic and autonomic dysfunctions. In particular, SCI above the ...

Murine Model of Intestinal Ischemia-reperfusion Injury

Murine Modell der intestinalen Ischämie-Reperfusionsschaden

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, ...

Open Tracheostomy Gastric Acid Aspiration Murine Model of Acute Lung Injury Results in Maximal Acute Nonlethal Lung Injury

Offene Tracheotomie Magensäure Aspiration Mausmodell der akuten Lungenschädigung Ergebnisse in Maximal Akute nonlethal Lung Injury

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

Verbesserte Methode für die Einrichtung einer In-vitro- Blut - Hirn-Schranke Modell auf porcinen Endothelzellen Gehirnzellen basiert

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

In Vivo Bewertung der Fraktur Kallus Entwicklung während der Knochenheilung bei Mäusen mit einem MRI-kompatiblen Osteosynthese Gerät für Maus Femur

Endochondral fracture healing is a complex process involving the development of fibrous, cartilaginous, and osseous tissue in the fracture callus. The ...