Name: effect of hyaluronic acid 35 kda on an in vitro model of preterm small intestinal injury and healing using enteroid-derived monolayers
Uploaded: 2022-07-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers at JoVE.com

תוכן זה הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות. HC נתמך על ידי מענק P20GM134973 מהמכונים הלאומיים לבריאות. KB נתמך על ידי מענק של קרן בית החולים לילדים (CHF) וקרן הבריאות הפרסביטריאנית (PHF). שירותי הדמיה של תאים חיים שסופקו על ידי ליבת הגנומיקה הפונקציונלית של הסרטן נתמכו בחלקם על ידי מענק המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית P20GM103639 ומענק המכון הלאומי לסרטן P30CA225520 של המכונים הלאומיים לבריאות, שהוענק למרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת אוקלהומה, מרכז סטיבנסון לסרטן.

כל נהלי בעלי החיים במחקר זה אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים במרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת אוקלהומה. לאחר אישור מוסדי, התקבלו דגימות נוחות עובריות של המעי הדק מפרימט לא אנושי פג (NHP, 90% הריון, בבון זיתים, Papio anubis) בעקבות המתת חסד למחקר נפרד (פרוטוקול #101523-16-039-I)<sup clas...

<ol>
	<li>Lemons, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Very+low+birth+weight+outcomes+of+the+National+Institute+of+Child+Health+and+Human+Development+Neonatal+Research+Network,+January+1995+through+December+1996.">Very low birth weight outcomes of the National Institute of Child Health and Human Development Neonatal Research Network, January 1995 through December 1996.</a> Pediatrics. 107 (1), 1 (2001).</li><li>Burge, K., Vieira, F., Eckert, J., Chaaban, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+composition,+digestion,+and+absorption+differences+among+neonatal+feeding+strategies:+Potential+implications+for+intestinal+inflammation+in+preterm+infants.">Lipid composition, digestion, and absorption differences among neonatal feeding strategies: Potential implications for intestinal inflammation in preterm infants.</a> Nutrients. 13 (2), 550 (2021).</li><li>Duffy, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+mediating+bacterial+translocation+in+the+immature+intestine.">Interactions mediating bacterial translocation in the immature intestine.</a> The Journal of Nutrition. 130, 432-436 (2000).</li><li>Nanthakumar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+excessive+intestinal+inflammation+in+necrotizing+enterocolitis:+An+immature+innate+immune+response.">The mechanism of excessive intestinal inflammation in necrotizing enterocolitis: An immature innate immune response.</a> PLoS One. 6 (3), 17776 (2011).</li><li>Nanthakumar, N. N., Fusunyan, R. D., Sanderson, I., Walker, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+in+the+developing+human+intestine:+A+possible+pathophysiologic+contribution+to+necrotizing+enterocolitis.">Inflammation in the developing human intestine: A possible pathophysiologic contribution to necrotizing enterocolitis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 6043-6048 (2000).</li><li>He, Y., Lawlor, N. T., Newburg, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+milk+components+modulate+toll-like+receptor-mediated+inflammation.">Human milk components modulate toll-like receptor-mediated inflammation.</a> Advances in Nutrition. 7 (1), 102-111 (2016).</li><li>Walker, W. A., Iyengar, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+milk,+microbiota,+and+intestinal+immune+homeostasis.">Breast milk, microbiota, and intestinal immune homeostasis.</a> Pediatric Research. 77 (1-2), 220-228 (2015).</li><li>Westerbeek, E. A., vanden Berg, A., Lafeber, H. N., Fetter, W. P., van Elburg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+enteral+supplementation+of+a+prebiotic+mixture+of+non-human+milk+galacto-,+fructo-+and+acidic+oligosaccharides+on+intestinal+permeability+in+preterm+infants.">The effect of enteral supplementation of a prebiotic mixture of non-human milk galacto-, fructo- and acidic oligosaccharides on intestinal permeability in preterm infants.</a> British Journal of Nutrition. 105 (2), 268-274 (2011).</li><li>vanden Berg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+glutamine-enriched+enteral+nutrition+on+intestinal+permeability+in+very-low-birth-weight+infants:+A+randomized+controlled+trial.">The effect of glutamine-enriched enteral nutrition on intestinal permeability in very-low-birth-weight infants: A randomized controlled trial.</a> Journal of Parenteral and Enteral Nutrition. 30 (5), 408-414 (2006).</li><li>Foster, J. P., Seth, R., Cole, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+immunoglobulin+for+preventing+necrotizing+enterocolitis+in+preterm+and+low+birth+weight+neonates.">Oral immunoglobulin for preventing necrotizing enterocolitis in preterm and low birth weight neonates.</a> The Cochrane Database of Systematic Reviews. 4 (4), (2016).</li><li>Maffei, D., Schanler, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+milk+is+the+feeding+strategy+to+prevent+necrotizing+enterocolitis.">Human milk is the feeding strategy to prevent necrotizing enterocolitis.</a> Seminars in Perinatology. 41 (1), 36-40 (2017).</li><li>Patel, A. L., Kim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+milk+and+necrotizing+enterocolitis.">Human milk and necrotizing enterocolitis.</a> Seminars in Pediatric Surgery. 27 (1), 34-38 (2018).</li><li>Nolan, L. S., Parks, O. B., Good, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+immunomodulating+components+of+maternal+breast+milk+and+protection+against+necrotizing+enterocolitis.">A review of the immunomodulating components of maternal breast milk and protection against necrotizing enterocolitis.</a> Nutrients. 12 (1), 14 (2019).</li><li>Hill, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+milk+hyaluronan+enhances+innate+defense+of+the+intestinal+epithelium.">Human milk hyaluronan enhances innate defense of the intestinal epithelium.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (40), 29090-29104 (2013).</li><li>Burge, K., Bergner, E., Gunasekaran, A., Eckert, J., Chaaban, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+glycosaminoglycans+in+protection+from+neonatal+necrotizing+enterocolitis:+A+narrative+review.">The role of glycosaminoglycans in protection from neonatal necrotizing enterocolitis: A narrative review.</a> Nutrients. 12 (2), 546 (2020).</li><li>Chaaban, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acceleration+of+small+intestine+development+and+remodeling+of+the+microbiome+following+hyaluronan+35+kDa+treatment+in+neonatal+mice.">Acceleration of small intestine development and remodeling of the microbiome following hyaluronan 35 kDa treatment in neonatal mice.</a> Nutrients. 13 (6), 2030 (2021).</li><li>Gunasekaran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan+35+kDa+enhances+epithelial+barrier+function+and+protects+against+the+development+of+murine+necrotizing+enterocolitis.">Hyaluronan 35 kDa enhances epithelial barrier function and protects against the development of murine necrotizing enterocolitis.</a> Pediatric Research. 87 (7), 1177-1184 (2020).</li><li>Montenegro-Miranda, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+organoid+model+of+damage+and+repair+identifies+HNF4&#945;+as+a+critical+regulator+of+intestinal+epithelial+regeneration.">A novel organoid model of damage and repair identifies HNF4&#945; as a critical regulator of intestinal epithelial regeneration.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (2), 209-223 (2020).</li><li>Lee, C., Hong, S. N., Kim, E. R., Chang, D. K., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+regeneration+ability+of+Crohn's+disease+assessed+using+patient-derived+intestinal+organoids.">Epithelial regeneration ability of Crohn's disease assessed using patient-derived intestinal organoids.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 6013 (2021).</li><li>Gurung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+Zika+virus+(ZIKV)+infection+following+vaginal+inoculation+with+ZIKV-infected+semen+in+timed-pregnant+olive+baboons.">Maternal Zika virus (ZIKV) infection following vaginal inoculation with ZIKV-infected semen in timed-pregnant olive baboons.</a> Journal of Virology. 94 (11), 00058 (2020).</li><li>Suarez-Arnedo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+image+J+plugin+for+the+high+throughput+image+analysis+of+in+vitro+scratch+wound+healing+assays.">An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays.</a> PLoS One. 15 (7), 0232565 (2020).</li><li>Kobelt, D., Walther, W., Stein, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+cell+migration+monitoring+to+analyze+drug+synergism+in+the+scratch+assay+using+the+IncuCyte+system.">Real-time cell migration monitoring to analyze drug synergism in the scratch assay using the IncuCyte system.</a> Methods in Molecular Biology. 2294, 133-142 (2021).</li><li>de Jong, J. C. W., Ijssennagger, N., van Mil, S. W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+milk+nutrients+driving+intestinal+epithelial+layer+maturation+via+Wnt+and+Notch+signaling:+Implications+for+necrotizing+enterocolitis.">Breast milk nutrients driving intestinal epithelial layer maturation via Wnt and Notch signaling: Implications for necrotizing enterocolitis.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1867 (11), 166229 (2021).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietin+protects+epithelial+cells+from+excessive+autophagy+and+apoptosis+in+experimental+neonatal+necrotizing+enterocolitis.">Erythropoietin protects epithelial cells from excessive autophagy and apoptosis in experimental neonatal necrotizing enterocolitis.</a> PLoS One. 8 (7), 69620 (2013).</li><li>Kessler, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+role+of+35+kilodalton+hyaluronan+in+promoting+defense+of+the+intestinal+epithelium.">Multifunctional role of 35 kilodalton hyaluronan in promoting defense of the intestinal epithelium.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 66 (4), 273-287 (2018).</li><li>Fraser, J. R. E., Laurent, T. C., Laurent, U. B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan:+Its+nature,+distribution,+functions+and+turnover.">Hyaluronan: Its nature, distribution, functions and turnover.</a> Journal of Internal Medicine. 242 (1), 27-33 (1997).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan+35kDa+treatment+protects+mice+from+Citrobacter+rodentium+infection+and+induces+epithelial+tight+junction+protein+ZO-1+in+vivo.">Hyaluronan 35kDa treatment protects mice from Citrobacter rodentium infection and induces epithelial tight junction protein ZO-1 in vivo.</a> Matrix Biology. 62, 28-39 (2017).</li><li>Prehm, P., Schumacher, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+hyaluronan+export+from+human+fibroblasts+by+inhibitors+of+multidrug+resistance+transporters.">Inhibition of hyaluronan export from human fibroblasts by inhibitors of multidrug resistance transporters.</a> Biochemical Pharmacology. 68 (7), 1401-1410 (2004).</li><li>Stenson, W. F., Ciorba, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonmicrobial+activation+of+TLRs+controls+intestinal+growth,+wound+repair,+and+radioprotection.">Nonmicrobial activation of TLRs controls intestinal growth, wound repair, and radioprotection.</a> Frontiers in Immunology. 11 (3591), 617510 (2021).</li><li>Riehl, T. E., Ee, X., Stenson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronic+acid+regulates+normal+intestinal+and+colonic+growth+in+mice.">Hyaluronic acid regulates normal intestinal and colonic growth in mice.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 303 (3), 377-388 (2012).</li><li>Riehl, T. E., Santhanam, S., Foster, L., Ciorba, M., Stenson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44+and+TLR4+mediate+hyaluronic+acid+regulation+of+Lgr5++stem+cell+proliferation,+crypt+fission,+and+intestinal+growth+in+postnatal+and+adult+mice.">CD44 and TLR4 mediate hyaluronic acid regulation of Lgr5+ stem cell proliferation, crypt fission, and intestinal growth in postnatal and adult mice.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309 (11), 874-887 (2015).</li><li>Hill, D. R., Kessler, S. P., Rho, H. K., Cowman, M. K., de la Motte, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific-sized+hyaluronan+fragments+promote+expression+of+human+beta-defensin+2+in+intestinal+epithelium.">Specific-sized hyaluronan fragments promote expression of human beta-defensin 2 in intestinal epithelium.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (36), 30610-30624 (2012).</li><li>Fernando, E. H., Gordon, M. H., Beck, P. L., MacNaughton, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+intestinal+epithelial+wound+healing+through+protease-activated+receptor-2+activation+in+Caco2+cells.">Inhibition of intestinal epithelial wound healing through protease-activated receptor-2 activation in Caco2 cells.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 367 (2), 382-392 (2018).</li><li>Nyegaard, S., Christensen, B., Rasmussen, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+accurate+quantification+of+cell+migration+using+human+small+intestine+cells.">An optimized method for accurate quantification of cell migration using human small intestine cells.</a> Metabolic Engineering Communications. 3, 76-83 (2016).</li><li>Roodsant, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+2D+primary+organoid-derived+epithelial+monolayer+model+to+study+host-pathogen+interaction+in+the+small+intestine.">A human 2D primary organoid-derived epithelial monolayer model to study host-pathogen interaction in the small intestine.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 272 (2020).</li><li>Singh, A., Poling, H. M., Spence, J. R., Wells, J. M., Helmrath, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+organoids:+a+next-generation+tool+for+modeling+human+development.">Gastrointestinal organoids: a next-generation tool for modeling human development.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 319 (3), 375-381 (2020).</li><li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids+as+an+ex-vivo+model+of+host-pathogen+interactions+in+the+gastrointestinal+tract.">Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract.</a> Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1124-1134 (2014).</li><li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids+as+a+model+of+upper+small+intestinal+ion+transport+physiology+and+pathophysiology.">Human enteroids as a model of upper small intestinal ion transport physiology and pathophysiology.</a> Gastroenterology. 150 (3), 638-649 (2016).</li></ol>

מערכת העיכול של פג נמצאת תחת לחץ רגנרטיבי מתמשך כתוצאה מחשיפה חוזרת ונשנית לעלבונות סביבתיים הקשורים לדיסביוזיס, מטבוליטים ורעלנים חיידקיים דלקתיים, והיפוקסיהלסירוגין 23,24. למרבה הצער, אפיתל המעיים של הפג אינו מסוגל לקבוע במהירות שלמות תפקודית23</...

דלקת מעי נמקית (NEC) היא אחד ממצבי החירום הנפוצים ביותר במערכת העיכול בפגים1. המחלה מאופיינת בדלקת מעיים קשה שיכולה להידרדר במהירות לנמק מעיים, אלח דם ועלול למוות. למרות שהאטיולוגיה אינה ברורה, הראיות מצביעות על כך ש-NEC הוא רב-גורמי ותוצאה של אינטראקציה מורכבת של האכלה, התיישבות חיידקים חריגה ואפיתל מעיים לא בשל 2,3. לפגים יש חדירות מעיים מוגברת, התיישבות חיידקית חריגה ויכולת התחדשות אנטרוציטים נמוכה4,5, מה שמגדיל את הסיכון שלהם לתפקוד לקוי של מחסום המעי, טרנסלוקציה חיידקית והתפתחות NEC. לכן, זיהוי אסטרטגיות או התערבויות כדי להאיץ את הבשלת אפיתל המעי ולקדם התחדשות או ריפוי של אפיתל המעי הוא קריטי במניעת מחלה קטלנית זו.
מחקרים הראו כי חלב אם (HM) מגן מפני NEC בפגים 6,7,8,9,10,11. מחקרים בבני אדם ובבעלי חיים הראו כי נוסחה המבוססת על בקר מגבירה את חדירות המעיים והיא רעילה ישירות לתאי אפיתל במעיים 2,12. למרות שלא הובהר במלואו, הראיות מצביעות על כך שההשפעות המגנות של HM מתווכות באמצעות רכיבים ביו-אקטיביים כגון לקטופרין, אימונוגלובולין A (IgA) ו-HM אוליגוסכרידים13. HM עשיר גם בהיאלורונן (HA), גליקוזאמינוגליקן לא-סולפטי ייחודי עם חומצה D-גלוקורונית חוזרת ו-N-אצטיל-D-גלוקוזאמין דיסכרידים14,15. חשוב לציין שהראינו כי 35 kDa HA (HA35) אוראלי, חיקוי של HM HA, מחליש את חומרת הפגיעה במעיים, מונע טרנסלוקציה חיידקית ומפחית את התמותה במודל 16,17 של פגיעה במעיים דמוי מורין NEC. 
כאן, ההשפעות של HA35 על ריפוי מעיים והתחדשות במבחנה נחקרות עוד יותר. נכון לעכשיו, הבדיקה הנפוצה ביותר במבחנה לפציעה ותיקון מעיים היא בדיקת פצע שריטה המבוצעת במונולרים של תאי סרטן המעי הגס (CRC). הרלוונטיות הפיזיולוגית של מודל כזה למעי הפגים מוגבלת, שכן תיקון פצעים של תאי CRC מסתמך במידה רבה על האופי המתפשט מאוד של תאים סרטניים ולא על תהליכי תיקון מונחי תאי גזע18. כדי להתגבר על מגבלה זו, מתוארת כאן הקמתו של מודל פצע שריטה אנטרואידי דו-ממדי, כולל הליך של בידוד ושמירה על אנטרואידים ראשוניים שמקורם בתאי גזע במעי הדק מפרימטים פגים שאינם אנושיים (NHP). בהינתן NEC מוקדם המדווח לרוב במעי הדק הדיסטלי, השימוש באורגנואידים ראשוניים של תאי אפיתל במודל של נזק ותיקון מעיים מספק מודל מבחנה הניתן לתרגום פיזיולוגי יותר בהשוואה למודלים קיימים המשתמשים במונו-שכבות המעי הגס מסורתיות18,19.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-675-49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x21mm Dish, Nunclon Delta</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>172931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well, TC-Treated, Flat Bottom Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#181;M Reversible Cell Strainer</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>27215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Sterile Cell Strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin, Bovine (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium/Nutrient Ham&#39;s Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>36254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>100-0485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte S3 Live-Cell Analysis Instrument</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>4647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte Scratch Wound Analysis Software Module</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>9600-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>06010</td>
			<td>This is HOGMY, but without the Y-27632 or antibiotics. Also used as base for HOGM, but then only missing the antibiotics.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L3012-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>136101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate-Buffered Saline), 1X [-] Calcium, Magnesium, pH 7.4</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>This is broad-spectrum antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hyaluronate, Research Grade, HA20K</td>
			<td>Lifecore Biomedical</td>
			<td>HA20K-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20 Automated Cell Counter</td>
			<td>Company: Bio-Rad</td>
			<td>1450102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 1X, 0.25% Trypsin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT25053CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72302</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effect of hyaluronic acid 35 kda on an in vitro model of preterm small intestinal injury and healing using enteroid-derived monolayers

מבחני פצעי שריטה במבחנה משמשים בדרך כלל כדי לחקור את המנגנונים והמאפיינים של ריפוי אפיתל במגוון סוגי רקמות. כאן אנו מתארים פרוטוקול ליצירת מונולאייר דו-ממדי (2D) מאנטרואידים תלת-ממדיים (3D) של פרימטים לא אנושיים שמקורם בקריפטות מעיים של האילאום הטרמינלי. מונולרים אלה, שמקורם באנטרואידים, נוצלו לאחר מכן בבדיקת פצעי שריטה במבחנה כדי לבחון את יכולתו של היאלורונן 35 kDa (HA35), חיקוי של HA מחלב אדם, לקדם נדידת תאים והתפשטותם לאורך קצה פצע האפיתל. לאחר שהמונו-שכבות גודלו למפגש, הן נשרטו ידנית וטופלו ב-HA35 (50 מיקרוגרם/מ"ל, 100 מיקרוגרם/מ"ל, 200 מיקרוגרם/מ"ל) או בבקרה (PBS). נדידת התאים והתפשטותם לתוך המרווח צולמו באמצעות מיקרוסקופ אור מועבר המצויד בהדמיית תאים חיים. סגירת פצעים כומתה כאחוז ריפוי פצעים באמצעות תוסף גודל ריפוי פצעים ב- ImageJ. אזור השריטה וקצב נדידת התאים ואחוז סגירת הפצע נמדדו במשך 24 שעות. HA35 in vitro מאיץ ריפוי פצעים במונולרים אנטרואידים במעי הדק, ככל הנראה באמצעות שילוב של התפשטות תאים בקצה הפצע ונדידה לאזור הפצע. שיטות אלה יכולות לשמש כמודל לחקר התחדשות המעיים במעי הדק האנושי הפג.

ההשפעות של HA על תיקון רקמות וריפוי פצעים ברקמות ואיברים שונים מתועדות היטב; עם זאת, ההשפעות הספציפיות של HA עם משקל מולקולרי של 35 kDa על ריפוי והתחדשות מעי דק עוברי או ילודים אינם ידועים כיום. כדי לבחון את היכולת של HA35 לקדם ריפוי פצעים במודל של המעי הדק העוברי או היילודים, יצרנו אנטרואידים תלת-...

Watch this Scientific Journal Video about Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers at JoVE.com

Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers

פרוטוקול זה מתאר שיטה לביסוס וביצוע בדיקת פצע שריטה על מונולרים דו-ממדיים (דו-ממדיים) שמקורם באנטרוידים תלת-ממדיים (3D) שבודדו מאילאום של פרימטים שאינם בני אדם.

ההשפעה של חומצה היאלורונית 35 kDa על מודל in vitro של פגיעה מוקדמת במעי הדק וריפוי באמצעות מונולרים שמקורם באנטרואיד

In vitro scratch wound assays are commonly used to investigate the mechanisms and characteristics of epithelial healing in a variety of tissue types. ...

פרוטוקול זה מרחיב את בדיקת פצע הגירוד הנפוצה מאוד המשמשת למחקרי התחדשות עם מונולרים שמקורם באנטרואיד המייצגים את כל סוגי התאים העיקריים של המעי הדק. טכניקה זו מאפשרת הדמיה בזמן אמת של סגירת פצעים במודל חד-שכבתי דו-ממדי פג של התחדשות מעיים. הטכניקה שלנו יכולה להיות מיושמת בחקר מעיים של יונקים פגים, שבדרך כלל מעוצבים בצורה גרועה באמצעות קווי תאים של סרטן המעי הגס שעברו טרנספורמציה.התחילו בהפשרה של 96 מיקרוליטרים של מטריצה חוץ-תאית, או הידרוג'ל BME מבוסס ECM, למשך הלילה על קרח בטמפרטורה של שתיים עד שמונה מעלות צלזיוס. דלל הידרוג'ל מבוסס ECM ו-PBS קר כקרח ללא סידן או מגנזיום ביחס של אחד עד 50. מצפים כל באר של צלחת תרבית רקמה בת 24 בארות עם 200 מיקרוליטרים של הידרוג'ל מדולל קר כקרח על בסיס ECM ודוגרים על הצלחת המצופה למשך שעה אחת לפחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.לאחר מכן שאפו את המדיה מצלחת התרבית בת 24 הבארות המכילה את האנטרואידים התלת-ממדיים המיועדים למונו-שכבות והחליפו אותה ב-500 מיקרוליטרים של מגיב דיסוציאציה של תאים לכל באר. לשבש באופן ידני את כיפות ההידרוג'ל המבוססות על ECM על ידי צנרת למעלה ולמטה שמונה עד 12 פעמים והעברת התוכן של 12 בארות לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. לשטוף את 12 בארות ריקות עם 250 microliters של מגיב דיסוציאציה התא כדי להבטיח את כל enteroids הוסרו ולהעביר את התוכן צינורות חרוטיים 15 מיליליטר.צנטריפוגה של צינורות חרוטיים ב 300 גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס ולהשליך את supernatant. הוסף 10 מיליליטר של חיץ כביסה DMEM/F-12 קר כקרח לצינורות החרוטיים והשעה את הכדורים האנטרואידים על ידי היפוך הצינורות. צנטריפוגה ב 300 גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס ולהסיר את supernatant.השהה את כדורי התא ב 12 מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס טריפסין-EDTA והנח את הצינורות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות או עד שהתאים נראים מסיסים. הוסף שלושה מיליליטר של מאגר כביסה DMEM/F-12 לכל צינור כדי לדלל טריפסין-EDTA. מערבבים על ידי היפוך הצינורות ומניחים על קרח.סנן את האנטרואידים המנותקים דרך מסננת תאי רשת בגודל 37 מיקרומטר. לאסוף את התוכן לתוך צינורות חרוטיים נקיים 15 מיליליטר צנטריפוגה את הצינורות ב 300g במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. הסר את supernatant מן צינורות חרוטי להשעות את כדורי התא עם שישה מיליליטר של HOMGY.לאחר מכן, הסר את צלחת ציפוי ההידרוג'ל מבוססת ECM מהאינקובטור ושאף כל תמיסת הידרוג'ל עודפת מבוססת ECM מבלי לשרוט את פני השטח המצופים או לייבש לחלוטין את הצלחת. הוסף 500 מיקרוליטרים של תרחיף תאי HOMGY המשולב של 12 מיליליטר לכל באר של צלחת 24 באר המצופה בהידרוג'ל מבוסס ECM. סובבו את הצלחת עם המכסה כדי להבטיח חלוקה שווה של תאים בתוך הבארות.דגירה של הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני, תוך החלפת מדיית HOMGY כל יומיים עד שהמונו-שכבות מגיעות ליותר מ-90% מפגש. ברגע שהמונו-שכבות מגיעות ליותר מ-90% מפגש, שאפו את המדיה כדי להסיר תאים שלא מצליחים להתחבר. לטפל בתאים עם 500 microliters של HA35 או PBS מומס HOMGY במשך 24 שעות.לאחר מכן, להסיר את התקשורת מבלי לשבש את פני השטח של monolayer. באמצעות קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר, צור שריטה ליניארית על פני קוטר המשטח המלא של המונולייר בכל באר, תוך זהירות שלא לתת למונוליירים להתייבש. לשטוף את monolayers שרוט פעם אחת עם 500 microliters של 1X PBS ולהוסיף 500 microliters של HA35 או PBS מומס HOMGY.מעבירים את הצלחת למכשיר ניתוח התאים החיים בתוך אינקובטור של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני. תחת סמל לוח הזמנים בתוכנת ניתוח התאים החיה, לחץ על הפעל הוסף אשף כלי שיט חדש סמל. בחר סרוק לפי לוח זמנים ולאחר מכן לחץ על הבא.בחר חדש תחת צור כלי ולחץ על הבא, ולאחר מכן בחר באר שלמה תחת סוג סריקה ולחץ על הבא. בחרו 'פאזה' לערוצי תמונה ו-4x למטרה. בחר את יצרן הצלחת ואת המספר הקטלוגי מהרשימה שסופקה ולחץ על הבא.בחר מיקום כלי ריק ואחריו תבנית הסריקה הרצויה. הזינו את שם הלוחית ב'שם', ולאחר מכן בחרו 'פלוס' כדי ליצור פריסת לוחית. בחר פלוס קטן כדי ליצור שם טיפול.הזן שם קצר ולאחר מכן אישור. הדגישו את בארות הצלחת המתאימות לטיפול זה ופגעו בפלוס גדול כדי לייעד בארות עם טיפול זה. הזן ריכוז מורכב ולחץ על אישור. לאחר השלמת הצלחת, בחר אישור, הבא. בחר דחה ניתוח למועד מאוחר יותר ולאחר מכן צור לוח זמנים חדש עם סריקות במרווחים של ארבע שעות.להפסיק את הסריקה ביום אחד, שעות אפס. ודא שהסיכום נכון ולאחר מכן הוסף ללוח הזמנים. בתוכנת ניתוח תאים חיים, בחר תצוגה בחלק העליון של המסך.מתפריט שם כלי שיט, נווט אל הסריקה שהושלמה תוך 24 שעות ולחץ פעמיים על שם כלי השיט. בחר ייצוא תמונות וסרטים סמל משמאל ואחריו האפשרות כפי שמוצג. סמן את הבארות המעניינות ולאחר מכן בחר נקודות זמן מעניינות וסדרות של תמונות כפי שהן מוצגות.ודא שסוג הרצף והסריקות נכונים. בחר את מיקום תיקיית היעד הרצוי. בחר JPEG מהתפריט הנפתח ולאחר מכן יצא.פתח את תוכנת ImageJ והעלה את תמונת בדיקת פצע השריטה. בחר/י ״תמונה״ ולאחר מכן הקלד/י 8 סיביות כדי לשנות את התמונה מ-RGB של 24 סיביות. בחר תוספים, פקודות מאקרו, התקן Wound_healing_size תוסף כדי להתקין את התוסף בגודל ריפוי פצעים.לאחר מכן, הגדר את רדיוס חלון השונות ל- 20, ערך הסף ל- 100, אחוז הפיקסלים הרוויים ל- 0.001. כן עבור הגדר קנה מידה גלובלי ולאחר מכן לחץ על אישור. יש לוודא שהאזור המסומן הוא אזור הפצע ולחזור על הפעולה לשריטות נוספות. לבסוף, חשב את אחוז הריפוי של פצעי אזור הגירוד של תאים נודדים או מתרבים במשך 24 שעות באמצעות המשוואה המוצגת על המסך.כאן, T0 הוא האזור בזמן אפס שעות, ו- TC הוא האזור בשעות אפס, ארבע שעות, 12 שעות, או 24 שעות. יצירת אנטרואיד והליך בדיקת ריפוי פצעים חד-שכבתי שמקורו באנטרואיד מוצגים בתמונות אלה. תרבות של אנטרואידים תלת-ממדיים, שאינם אנושיים, משמשת להתנתקות למונולרים דו-ממדיים.מונו-שכבות גודלו למפגש של יותר מ-90% בצלחת של 24 בארות ולאחר מכן טופלו ב-HA35 או PBS במשך 24 שעות. לאחר מכן נשרטו מונוליירים עם קצה פיפטה P200. מוצגות כאן התמונות המייצגות של HA35 בטיפולי בקרה של מונולרים אנטרואידים של פרימטים לא אנושיים.התמונות התקבלו בשעות אפס, ארבע שעות, 12 שעות ו-24 שעות לאחר ביצוע שריטה עם קצה פיפטה P200. ההשפעה של HA35 על ריפוי פצעים ומונולרים של זיהוי פצעים מוצגת כאן. השינוי בריפוי פצעים לאורך זמן במונו-שכבות אנטרואידיות תלוי בריכוז הטיפול ב-HA35.HA35 העלה משמעותית את ריפוי הפצעים לאחר ארבע שעות ו-12 שעות ב-100 מיקרוגרם למיליליטר ו-200 מיקרוגרם למיליליטר בהשוואה לקבוצת הביקורת, אך שיעורי הריפוי התכנסו בין הטיפולים ב-24 שעות. אחד הדברים החשובים ביותר שיש לזכור עם הליך זה הוא כי monolayers אנטרואיד מעיים הם קצרי מועד. לכן, ברגע שהם מתבלבלים ב-90%, החוקרים צריכים לחפש להשתמש בהם במהירות.טכניקה זו הפכה למודל שלנו להתחדשות מעיים מוקדמת במבחנה, במיוחד אם אנו מעוניינים בפגיעה מכנית יותר מאשר דלקתית.

Research

JoVE Journal

Medicine

Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers

A Contusive Model of Unilateral Cervical Spinal Cord Injury Using the Infinite Horizon Impactor

דגם Contusive של פגיעה בחוט השדרה באמצעות צוואר הרחם חד צדדית Impactor אופק אינסופי

While the majority of human spinal cord injuries occur in the cervical spinal cord, the vast majority of laboratory research employs animal models of ...

Murine Model of Wound Healing

מודל עכברי של ריפוי פצע

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

An Alkali-burn Injury Model of Corneal Neovascularization in the Mouse

פגיעה דגם אלקלי לשרוף של הקרנית neovascularization בעכבר

Under normal conditions, the cornea is avascular, and this transparency is essential for maintaining good visual acuity. Neovascularization (NV) of the ...

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

העכברי אנדוסקופיה ל<em&gt; בVivo</em&gt; ריפוי Multimodal הדמיה של היווצרות הסרטן וההערכה של מעיים פצע ודלקת

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions ...

Development of an Algorithm to Perform a Comprehensive Study of Autonomic Dysreflexia in Animals with High Spinal Cord Injury Using a Telemetry Device

פיתוח אלגוריתם לבצע מחקר מקיף על האוטונומית דיסרפלקסיה ב בעלי חיים עם פגיעה בחוט השדרה גבוהה שימוש בהתקן טלמטריה

Spinal cord injury (SCI) is a debilitating neurological condition characterized by somatic and autonomic dysfunctions. In particular, SCI above the ...

Murine Model of Intestinal Ischemia-reperfusion Injury

דגם Murine של פגיעת המעיים איסכמיה reperfusion

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, ...

Open Tracheostomy Gastric Acid Aspiration Murine Model of Acute Lung Injury Results in Maximal Acute Nonlethal Lung Injury

להרחיב הנשמת קיבת חומצה שאיפת Murine הדגם של פגיעה החריפה ריאות תוצאות ב מקסימלי חריפה קטלנית פגיעת ריאות

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

שיפור שיטה להקמת במבחנה מחסום הדם - מוח מודל המבוסס על תאי אנדותל המוח חזירי

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

אין ויוו הערכה של שבר פיתוח קסם במהלך עצם הריפוי בעכברים שימוש בהתקן התואם ל- MRI Osteosynthesis את העכבר אתי

Endochondral fracture healing is a complex process involving the development of fibrous, cartilaginous, and osseous tissue in the fracture callus. The ...