Name: effect of hyaluronic acid 35 kda on an in vitro model of preterm small intestinal injury and healing using enteroid-derived monolayers
Uploaded: 2022-07-28T13:00:00
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Tutte le procedure animali in questo studio sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali del Centro di scienze della salute dell'Università dell'Oklahoma. A seguito dell'approvazione istituzionale, campioni fetali di convenienza dell'intestino tenue da un primate non umano pretermine (NHP, gestazione al 90%, babbuino olivastro, Papio anubis) sono stati ottenuti dopo l'eutanasia per uno studio separato (Protocollo # 101523-16-039-I) 20.
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	<li>Lemons, J. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+mediating+bacterial+translocation+in+the+immature+intestine.">Interactions mediating bacterial translocation in the immature intestine.</a> The Journal of Nutrition. 130, 432-436 (2000).</li><li>Nanthakumar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+excessive+intestinal+inflammation+in+necrotizing+enterocolitis:+An+immature+innate+immune+response.">The mechanism of excessive intestinal inflammation in necrotizing enterocolitis: An immature innate immune response.</a> PLoS One. 6 (3), 17776 (2011).</li><li>Nanthakumar, N. N., Fusunyan, R. D., Sanderson, I., Walker, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+in+the+developing+human+intestine:+A+possible+pathophysiologic+contribution+to+necrotizing+enterocolitis.">Inflammation in the developing human intestine: A possible pathophysiologic contribution to necrotizing enterocolitis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 6043-6048 (2000).</li><li>He, Y., Lawlor, N. T., Newburg, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+milk+components+modulate+toll-like+receptor-mediated+inflammation.">Human milk components modulate toll-like receptor-mediated inflammation.</a> Advances in Nutrition. 7 (1), 102-111 (2016).</li><li>Walker, W. A., Iyengar, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+milk,+microbiota,+and+intestinal+immune+homeostasis.">Breast milk, microbiota, and intestinal immune homeostasis.</a> Pediatric Research. 77 (1-2), 220-228 (2015).</li><li>Westerbeek, E. A., vanden Berg, A., Lafeber, H. N., Fetter, W. P., van Elburg, R. 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P., Seth, R., Cole, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+immunoglobulin+for+preventing+necrotizing+enterocolitis+in+preterm+and+low+birth+weight+neonates.">Oral immunoglobulin for preventing necrotizing enterocolitis in preterm and low birth weight neonates.</a> The Cochrane Database of Systematic Reviews. 4 (4), (2016).</li><li>Maffei, D., Schanler, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+milk+is+the+feeding+strategy+to+prevent+necrotizing+enterocolitis.">Human milk is the feeding strategy to prevent necrotizing enterocolitis.</a> Seminars in Perinatology. 41 (1), 36-40 (2017).</li><li>Patel, A. L., Kim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+milk+and+necrotizing+enterocolitis.">Human milk and necrotizing enterocolitis.</a> Seminars in Pediatric Surgery. 27 (1), 34-38 (2018).</li><li>Nolan, L. S., Parks, O. B., Good, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+immunomodulating+components+of+maternal+breast+milk+and+protection+against+necrotizing+enterocolitis.">A review of the immunomodulating components of maternal breast milk and protection against necrotizing enterocolitis.</a> Nutrients. 12 (1), 14 (2019).</li><li>Hill, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+milk+hyaluronan+enhances+innate+defense+of+the+intestinal+epithelium.">Human milk hyaluronan enhances innate defense of the intestinal epithelium.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (40), 29090-29104 (2013).</li><li>Burge, K., Bergner, E., Gunasekaran, A., Eckert, J., Chaaban, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+glycosaminoglycans+in+protection+from+neonatal+necrotizing+enterocolitis:+A+narrative+review.">The role of glycosaminoglycans in protection from neonatal necrotizing enterocolitis: A narrative review.</a> Nutrients. 12 (2), 546 (2020).</li><li>Chaaban, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acceleration+of+small+intestine+development+and+remodeling+of+the+microbiome+following+hyaluronan+35+kDa+treatment+in+neonatal+mice.">Acceleration of small intestine development and remodeling of the microbiome following hyaluronan 35 kDa treatment in neonatal mice.</a> Nutrients. 13 (6), 2030 (2021).</li><li>Gunasekaran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan+35+kDa+enhances+epithelial+barrier+function+and+protects+against+the+development+of+murine+necrotizing+enterocolitis.">Hyaluronan 35 kDa enhances epithelial barrier function and protects against the development of murine necrotizing enterocolitis.</a> Pediatric Research. 87 (7), 1177-1184 (2020).</li><li>Montenegro-Miranda, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+organoid+model+of+damage+and+repair+identifies+HNF4&#945;+as+a+critical+regulator+of+intestinal+epithelial+regeneration.">A novel organoid model of damage and repair identifies HNF4&#945; as a critical regulator of intestinal epithelial regeneration.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (2), 209-223 (2020).</li><li>Lee, C., Hong, S. N., Kim, E. R., Chang, D. K., Kim, Y. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+role+of+35+kilodalton+hyaluronan+in+promoting+defense+of+the+intestinal+epithelium.">Multifunctional role of 35 kilodalton hyaluronan in promoting defense of the intestinal epithelium.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 66 (4), 273-287 (2018).</li><li>Fraser, J. R. E., Laurent, T. C., Laurent, U. B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan:+Its+nature,+distribution,+functions+and+turnover.">Hyaluronan: Its nature, distribution, functions and turnover.</a> Journal of Internal Medicine. 242 (1), 27-33 (1997).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan+35kDa+treatment+protects+mice+from+Citrobacter+rodentium+infection+and+induces+epithelial+tight+junction+protein+ZO-1+in+vivo.">Hyaluronan 35kDa treatment protects mice from Citrobacter rodentium infection and induces epithelial tight junction protein ZO-1 in vivo.</a> Matrix Biology. 62, 28-39 (2017).</li><li>Prehm, P., Schumacher, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+hyaluronan+export+from+human+fibroblasts+by+inhibitors+of+multidrug+resistance+transporters.">Inhibition of hyaluronan export from human fibroblasts by inhibitors of multidrug resistance transporters.</a> Biochemical Pharmacology. 68 (7), 1401-1410 (2004).</li><li>Stenson, W. F., Ciorba, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonmicrobial+activation+of+TLRs+controls+intestinal+growth,+wound+repair,+and+radioprotection.">Nonmicrobial activation of TLRs controls intestinal growth, wound repair, and radioprotection.</a> Frontiers in Immunology. 11 (3591), 617510 (2021).</li><li>Riehl, T. E., Ee, X., Stenson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronic+acid+regulates+normal+intestinal+and+colonic+growth+in+mice.">Hyaluronic acid regulates normal intestinal and colonic growth in mice.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 303 (3), 377-388 (2012).</li><li>Riehl, T. E., Santhanam, S., Foster, L., Ciorba, M., Stenson, W. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+accurate+quantification+of+cell+migration+using+human+small+intestine+cells.">An optimized method for accurate quantification of cell migration using human small intestine cells.</a> Metabolic Engineering Communications. 3, 76-83 (2016).</li><li>Roodsant, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+2D+primary+organoid-derived+epithelial+monolayer+model+to+study+host-pathogen+interaction+in+the+small+intestine.">A human 2D primary organoid-derived epithelial monolayer model to study host-pathogen interaction in the small intestine.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 272 (2020).</li><li>Singh, A., Poling, H. M., Spence, J. R., Wells, J. M., Helmrath, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+organoids:+a+next-generation+tool+for+modeling+human+development.">Gastrointestinal organoids: a next-generation tool for modeling human development.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 319 (3), 375-381 (2020).</li><li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids+as+an+ex-vivo+model+of+host-pathogen+interactions+in+the+gastrointestinal+tract.">Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract.</a> Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1124-1134 (2014).</li><li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids+as+a+model+of+upper+small+intestinal+ion+transport+physiology+and+pathophysiology.">Human enteroids as a model of upper small intestinal ion transport physiology and pathophysiology.</a> Gastroenterology. 150 (3), 638-649 (2016).</li></ol>

Il tratto gastrointestinale di un neonato pretermine è sottoposto a continua pressione rigenerativa da ripetute esposizioni a insulti ambientali associati a disbiosi, metaboliti batterici infiammatori e tossine e ipossia intermittente23,24. Sfortunatamente, l'epitelio intestinale del neonato pretermine non è in grado di stabilire rapidamente l'integrità funzionale23, con conseguente disfunzione della barriera, aumento della permeabilit?...

L'enterocolite necrotizzante (NEC) è una delle emergenze gastrointestinali più comuni nei neonati pretermine1. La malattia è caratterizzata da una grave infiammazione intestinale che può rapidamente deteriorarsi in necrosi intestinale, sepsi e potenzialmente morte. Sebbene l'eziologia non sia chiara, l'evidenza suggerisce che la NEC è multifattoriale ed è il risultato di una complessa interazione di alimentazione, colonizzazione batterica anormale e epitelio intestinale immaturo 2,3. I neonati pretermine hanno aumentato la permeabilità intestinale, la colonizzazione batterica anormale e una bassa capacità rigenerativa degli enterociti4,5, aumentando il rischio di disfunzione della barriera intestinale, traslocazione batterica e sviluppo di NEC. Pertanto, identificare strategie o interventi per accelerare la maturazione epiteliale intestinale e promuovere la rigenerazione o la guarigione dell'epitelio intestinale è fondamentale per prevenire questa malattia mortale.
Gli studi hanno dimostrato che il latte umano (HM) è protettivo contro NEC nei neonati pretermine 6,7,8,9,10,11. Studi sia sull'uomo che sugli animali hanno dimostrato che la formula a base bovina aumenta la permeabilità intestinale ed è direttamente tossica per le cellule epiteliali intestinali 2,12. Sebbene non completamente chiarito, l'evidenza suggerisce che gli effetti protettivi dell'HM sono mediati attraverso componenti bioattivi come la lattoferrina, l'immunoglobulina A (IgA) e gli oligosaccaridi HM13. HM è anche ricco di acido ialuronico (HA), un glicosaminoglicano unicamente non solfato con acido D-glucuronico ripetuto e disaccaridi N-acetil-D-glucosamina14,15. È importante sottolineare che abbiamo dimostrato che 35 kDa HA orale (HA35), una imitazione HM HA, attenua la gravità del danno intestinale, previene la traslocazione batterica e diminuisce la mortalità in un modello murino di danno intestinale simile a NEC16,17. 
Qui, gli effetti di HA35 sulla guarigione intestinale e sulla rigenerazione in vitro sono ulteriormente studiati. Attualmente, il test in vitro più utilizzato per le ferite e la riparazione intestinale è un test di ferita da graffio eseguito in monostrati di cellule di cancro del colon-retto (CRC). La rilevanza fisiologica di un tale modello per l'intestino infantile pretermine è limitata, poiché la riparazione delle ferite delle cellule CRC dipende fortemente dalla natura altamente proliferativa delle cellule tumorali piuttosto che dai processi di riparazione guidati dalle cellule staminali18. Per superare questa limitazione, qui viene descritta la creazione di un modello 2D di ferita da graffio enteroide, compresa la procedura di isolamento e mantenimento di enteroidi intestinali piccoli intestinali derivati da cellule staminali primarie da primati non umani pretermine (NHP). Dato che la NEC pretermine è più spesso riportata nell'intestino tenue distale, l'uso di organoidi di cellule epiteliali primarie in un modello di danno intestinale e riparazione fornisce un modello in vitro più fisiologicamente traducibile rispetto ai modelli esistenti che utilizzano monostrati colorettali tradizionali18,19.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-675-49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x21mm Dish, Nunclon Delta</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>172931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well, TC-Treated, Flat Bottom Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#181;M Reversible Cell Strainer</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>27215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Sterile Cell Strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin, Bovine (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium/Nutrient Ham&#39;s Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>36254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>100-0485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte S3 Live-Cell Analysis Instrument</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>4647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte Scratch Wound Analysis Software Module</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>9600-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>06010</td>
			<td>This is HOGMY, but without the Y-27632 or antibiotics. Also used as base for HOGM, but then only missing the antibiotics.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L3012-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>136101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate-Buffered Saline), 1X [-] Calcium, Magnesium, pH 7.4</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>This is broad-spectrum antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hyaluronate, Research Grade, HA20K</td>
			<td>Lifecore Biomedical</td>
			<td>HA20K-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20 Automated Cell Counter</td>
			<td>Company: Bio-Rad</td>
			<td>1450102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 1X, 0.25% Trypsin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT25053CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72302</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effect of hyaluronic acid 35 kda on an in vitro model of preterm small intestinal injury and healing using enteroid-derived monolayers

I saggi in vitro delle ferite da graffio sono comunemente usati per studiare i meccanismi e le caratteristiche della guarigione epiteliale in una varietà di tipi di tessuto. Qui, descriviamo un protocollo per generare un monostrato bidimensionale (2D) da enteroidi primati non umani tridimensionali (3D) derivati da cripte intestinali dell'ileo terminale. Questi monostrati derivati da enteroidi sono stati poi utilizzati in un test in vitro per testare la capacità dell'acido ialuronico 35 kDa (HA35), un imitatore di HA del latte umano, di promuovere la migrazione e la proliferazione cellulare lungo il bordo della ferita epiteliale. Dopo che i monostrati sono cresciuti fino alla confluenza, sono stati graffiati manualmente e trattati con HA35 (50 μg / mL, 100 μg / mL, 200 μg / mL) o controllo (PBS). La migrazione cellulare e la proliferazione nel gap sono state riprese utilizzando un microscopio a luce trasmessa attrezzato per l'imaging di cellule vive. La chiusura della ferita è stata quantificata come percentuale di guarigione delle ferite utilizzando il plug-in Wound Healing Size in ImageJ. L'area del graffio e il tasso di migrazione cellulare e la percentuale di chiusura della ferita sono stati misurati nell'arco di 24 ore. HA35 in vitro accelera la guarigione delle ferite nei piccoli monostrati enteroidi intestinali, probabilmente attraverso una combinazione di proliferazione cellulare sul bordo della ferita e migrazione verso l'area della ferita. Questi metodi possono potenzialmente essere utilizzati come modello per esplorare la rigenerazione intestinale nell'intestino tenue umano pretermine.

Gli effetti dell'HA sulla riparazione dei tessuti e sulla guarigione delle ferite in vari tessuti e organi sono ben documentati; tuttavia, gli effetti specifici dell'HA con un peso molecolare di 35 kDa sulla guarigione e rigenerazione dell'intestino tenue fetale o neonatale sono attualmente sconosciuti. Per testare la capacità di HA35 di promuovere la guarigione delle ferite in un modello dell'intestino tenue fetale o neonatale, abbiamo generato enteroidi intestinali 3D dal tessuto ileale NHP e ulteriormente dissociato ...

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Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers

Questo protocollo descrive un metodo per stabilire ed eseguire un test di ferita da graffio su monostrati bidimensionali (2D) derivati da enteroidi tridimensionali (3D) isolati da ileo di primati non umani.

Effetto dell'acido ialuronico 35 kDa su un modello in vitro di danno intestinale pretermine e guarigione mediante monostrati di derivazione enteroide

In vitro scratch wound assays are commonly used to investigate the mechanisms and characteristics of epithelial healing in a variety of tissue types. ...

Questo protocollo estende il test molto comune della ferita da graffio utilizzato per gli studi di rigenerazione con monostrati derivati da enteroidi che rappresentano tutti i principali tipi di cellule dell'intestino tenue. Questa tecnica consente la visualizzazione in tempo reale della chiusura della ferita in un modello monostrato enteroide pretermine 2D di rigenerazione intestinale. La nostra tecnica può essere applicata allo studio dell'intestino dei mammiferi pretermine, che è tipicamente scarsamente modellato utilizzando linee cellulari di cancro colorettale trasformate.Inizia scongelando 96 microlitri di matrice extracellulare, o BME idrogel a base di ECM, durante la notte sul ghiaccio da due a otto gradi Celsius. Diluire l'idrogel a base di ECM e il PBS ghiacciato senza calcio o magnesio in un rapporto di uno a 50. Rivestire ogni pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti con 200 microlitri di idrogel diluito a base di ECM ghiacciato e incubare la piastra rivestita per un minimo di un'ora a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.Quindi aspirare il mezzo dalla piastra di coltura a 24 pozzetti contenente gli enteroidi 3D destinati ai monostrati e sostituirlo con 500 microlitri di reagente di dissociazione cellulare per pozzetto. Interrompere manualmente le cupole di idrogel basate su ECM pipettando su e giù da otto a 12 volte e trasferendo il contenuto di 12 pozzetti su un tubo conico da 15 millilitri. Lavare i 12 pozzetti vuoti con 250 microlitri di reagente di dissociazione cellulare per assicurarsi che tutti gli enteroidi siano stati rimossi e trasferire il contenuto in tubi conici da 15 millilitri.Centrifugare i tubi conici a 300g per cinque minuti a quattro gradi Celsius ed eliminare il surnatante. Aggiungere 10 millilitri di tampone di lavaggio DMEM / F-12 ghiacciato ai tubi conici e sospendere i pellet enteroidi invertendo i tubi. Centrifugare a 300g per cinque minuti a quattro gradi Celsius e rimuovere il surnatante.Risospendere i pellet cellulari in 12 millilitri di tripsina-EDTA a 37 gradi Celsius e posizionare i tubi in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 10 minuti o fino a quando le cellule appaiono solubili. Aggiungere tre millilitri di tampone di lavaggio DMEM / F-12 a ciascun tubo per diluire Trypsin-EDTA. Mescolare capovolgendo i tubi e metterli sul ghiaccio.Filtrare gli enteroidi dissociati attraverso un filtro cellulare a maglie di 37 micrometri. Raccogliere il contenuto in tubi conici puliti da 15 millilitri e centrifugare i tubi a 300 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere il surnatante dai tubi conici e risospendere i pellet cellulari con sei millilitri di HOMGY.Quindi, rimuovere la piastra rivestita in idrogel a base di ECM dall'incubatore e aspirare qualsiasi soluzione di idrogel a base di ECM in eccesso senza graffiare la superficie rivestita o asciugare completamente la piastra. Aggiungere 500 microlitri della sospensione combinata di celle HOMGY da 12 millilitri in ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti rivestita con idrogel a base di ECM. Ruotare la piastra con il coperchio per garantire una distribuzione uniforme delle celle all'interno dei pozzetti.Incubare la piastra a 37 gradi Celsius e 5% anidride carbonica, scambiando i mezzi HOMGY ogni due giorni fino a quando i monostrati raggiungono una confluenza superiore al 90%. Una volta che i monostrati raggiungono una confluenza superiore al 90%, aspirare il supporto per rimuovere eventuali celle che non riescono ad attaccarsi. Trattare le cellule con 500 microlitri di HA35 o PBS sciolti in HOMGY per 24 ore.Successivamente, rimuovere il supporto senza interrompere la superficie del monostrato. Utilizzando una punta per pipetta da 200 microlitri, effettuare un graffio lineare su tutto il diametro superficiale del monostrato in ciascun pozzetto, facendo attenzione a non lasciare asciugare i monostrati. Lavare i monostrati graffiati una volta con 500 microlitri di 1X PBS e aggiungere 500 microlitri di HA35 o PBS sciolti in HOMGY.Trasferire la piastra allo strumento di analisi delle cellule vive all'interno di un incubatore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Sotto l'icona Schedule nel software di analisi delle celle live, fare clic sull'icona Launch Add New Vessel Wizard. Selezionare Scan on Schedule (Scansione in base alla pianificazione), quindi fare clic su Avanti.Selezionare Nuovo in Crea nave e fare clic su Avanti, quindi selezionare Pozzo intero in Tipo di scansione e fare clic su Avanti. Scegliete Fase per i canali immagine e 4x per l'obiettivo. Selezionare il produttore della targhetta e il numero di catalogo dall'elenco fornito e fare clic su Avanti.Selezionare una posizione vuota del recipiente seguita dal modello di scansione desiderato. Inserisci il nome della targa in Nome, quindi seleziona più per creare un layout di targa. Selezionare piccolo più per creare un nome di trattamento.Immettere il nome breve e quindi OK. Evidenziare i pozzetti a piastre corrispondenti a quel trattamento e colpire il grande plus per designare i pozzi con quel trattamento. Immettere la concentrazione del composto e fare clic su OK. Al termine della piastra, selezionare OK, Avanti (Next). Selezionare Posticipa analisi fino a un secondo momento, quindi Crea nuova pianificazione con scansioni a intervalli di quattro ore.Interrompere la scansione a un giorno, zero ore. Assicurarsi che il riepilogo sia corretto e quindi aggiungere alla pianificazione. Nel software di analisi delle cellule live, selezionare Visualizza nella parte superiore dello schermo.Dal menu Nome nave, passare alla scansione completata di 24 ore e fare doppio clic sul nome dell'imbarcazione. Seleziona l'icona Esporta immagini e filmati a sinistra seguita dall'opzione Come visualizzato. Evidenziare i pozzi di interesse, quindi selezionare i punti temporali di interesse e la serie di immagini visualizzate.Assicurarsi che il tipo di sequenza e le scansioni siano corretti. Selezionare il percorso della cartella di destinazione desiderato. Scegli JPEG dal menu a discesa, quindi Esporta.Apri il software ImageJ e carica l'immagine del saggio della ferita da graffio. Selezionare Immagine, quindi digitare 8 bit per modificare l'immagine da RGB a 24 bit. Selezionare Plugin, Macros, Install, Wound_healing_size plugin per installare il plugin Wound Healing Size.Successivamente, imposta il raggio della finestra di varianza su 20, il valore di soglia su 100, la percentuale di pixel saturi su 0,001. Sì per Imposta scala globale e quindi fare clic su OK. Verificare che l'area delineata sia l'area della ferita e ripetere l'operazione per ulteriori graffi. Infine, calcola la percentuale di guarigione della ferita dell'area del graffio delle cellule in migrazione o proliferazione nell'arco di 24 ore utilizzando l'equazione mostrata sullo schermo.Qui, T0 è l'area al tempo zero ore e TC è l'area a zero ore, quattro ore, 12 ore o 24 ore. La generazione di enteroidi e la procedura di analisi della guarigione delle ferite monostrato derivata da enteroidi sono mostrate in queste immagini. Una coltura di enteroidi intestinali tridimensionali e non umani dei primati viene utilizzata per dissociarsi in monostrati bidimensionali.I monostrati sono stati coltivati a una confluenza superiore al 90% in una piastra a 24 pozzetti e quindi trattati con HA35 o PBS per 24 ore. I monostrati sono stati quindi graffiati con una punta per pipetta P200. Di seguito sono mostrate le immagini rappresentative di HA35 nei trattamenti di controllo di monostrati enteroidi di primati non umani.Le immagini sono state ottenute a zero ore, quattro ore, 12 ore e 24 ore dopo aver eseguito un graffio con una punta di pipetta P200. L'effetto di HA35 sui monostrati andoidi di guarigione delle ferite è mostrato qui. Il cambiamento nella guarigione delle ferite nel tempo nei monostrati enteroidi dipende dalla concentrazione del trattamento HA35.HA35 ha aumentato significativamente la guarigione delle ferite dopo quattro ore e 12 ore a 100 microgrammi per millilitro e 200 microgrammi per millilitro rispetto al controllo, ma i tassi di guarigione convergevano tra i trattamenti di 24 ore. Una delle cose più importanti da ricordare con questa procedura è che i monostrati enteroidi intestinali sono di breve durata. Quindi, una volta che sono al 90% confluidi, gli investigatori dovrebbero cercare di usarli rapidamente.Questa tecnica è diventata il nostro modello di riferimento per la rigenerazione intestinale pretermine in vitro, soprattutto se siamo interessati a lesioni più meccaniche piuttosto che infiammatorie.

Research

JoVE Journal

Medicine

Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers

A Contusive Model of Unilateral Cervical Spinal Cord Injury Using the Infinite Horizon Impactor

Un modello contusivo unilaterale di lesioni del midollo spinale cervicale Uso della Impactor Infinite Horizon

While the majority of human spinal cord injuries occur in the cervical spinal cord, the vast majority of laboratory research employs animal models of ...

Ricerca

Medicina

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Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

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Murino Endoscopia per<em&gt; In Vivo</em&gt; Guarigione Imaging Multimodale di Cancerogenesi e valutazione della ferita intestinale e infiammazione

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions ...

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Sviluppo di un algoritmo di effettuare uno studio globale di autonomica disreflessia in animali con alta ferita del midollo spinale Uso di un dispositivo di telemetria

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