Name: effect of hyaluronic acid 35 kda on an in vitro model of preterm small intestinal injury and healing using enteroid-derived monolayers
Uploaded: 2022-07-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers at JoVE.com

この内容は著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。HCは、国立衛生研究所からの助成金P20GM134973によってサポートされています。KBは、小児病院財団(CHF)と長老派健康財団(PHF)の助成金によってサポートされています。Cancer Functional Genomicsコアが提供する生細胞イメージングサービスは、オクラホマ大学健康科学センタースティーブンソンがんセンターに授与された国立総合医学研究所の助成金P20GM103639および国立がん研究所の助成金P30CA225520によって部分的にサポートされました。

この研究のすべての動物の手順は、オクラホマ大学健康科学センターの施設動物管理および使用委員会によって承認されました。施設の承認に続いて、早産の非ヒト霊長類(NHP、妊娠90%、オリーブヒヒ、 パピオアヌビス)からの胎児小腸便宜サンプルが、別の研究のために安楽死後に取得されました(プロトコル#101523-16-039-I)20。
1. 早産非ヒト霊...

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	<li>Lemons, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Very+low+birth+weight+outcomes+of+the+National+Institute+of+Child+Health+and+Human+Development+Neonatal+Research+Network,+January+1995+through+December+1996.">Very low birth weight outcomes of the National Institute of Child Health and Human Development Neonatal Research Network, January 1995 through December 1996.</a> Pediatrics. 107 (1), 1 (2001).</li><li>Burge, K., Vieira, F., Eckert, J., Chaaban, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+composition,+digestion,+and+absorption+differences+among+neonatal+feeding+strategies:+Potential+implications+for+intestinal+inflammation+in+preterm+infants.">Lipid composition, digestion, and absorption differences among neonatal feeding strategies: Potential implications for intestinal inflammation in preterm infants.</a> Nutrients. 13 (2), 550 (2021).</li><li>Duffy, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+mediating+bacterial+translocation+in+the+immature+intestine.">Interactions mediating bacterial translocation in the immature intestine.</a> The Journal of Nutrition. 130, 432-436 (2000).</li><li>Nanthakumar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+excessive+intestinal+inflammation+in+necrotizing+enterocolitis:+An+immature+innate+immune+response.">The mechanism of excessive intestinal inflammation in necrotizing enterocolitis: An immature innate immune response.</a> PLoS One. 6 (3), 17776 (2011).</li><li>Nanthakumar, N. N., Fusunyan, R. D., Sanderson, I., Walker, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+in+the+developing+human+intestine:+A+possible+pathophysiologic+contribution+to+necrotizing+enterocolitis.">Inflammation in the developing human intestine: A possible pathophysiologic contribution to necrotizing enterocolitis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 6043-6048 (2000).</li><li>He, Y., Lawlor, N. T., Newburg, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+milk+components+modulate+toll-like+receptor-mediated+inflammation.">Human milk components modulate toll-like receptor-mediated inflammation.</a> Advances in Nutrition. 7 (1), 102-111 (2016).</li><li>Walker, W. A., Iyengar, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+milk,+microbiota,+and+intestinal+immune+homeostasis.">Breast milk, microbiota, and intestinal immune homeostasis.</a> Pediatric Research. 77 (1-2), 220-228 (2015).</li><li>Westerbeek, E. A., vanden Berg, A., Lafeber, H. N., Fetter, W. P., van Elburg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+enteral+supplementation+of+a+prebiotic+mixture+of+non-human+milk+galacto-,+fructo-+and+acidic+oligosaccharides+on+intestinal+permeability+in+preterm+infants.">The effect of enteral supplementation of a prebiotic mixture of non-human milk galacto-, fructo- and acidic oligosaccharides on intestinal permeability in preterm infants.</a> British Journal of Nutrition. 105 (2), 268-274 (2011).</li><li>vanden Berg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+glutamine-enriched+enteral+nutrition+on+intestinal+permeability+in+very-low-birth-weight+infants:+A+randomized+controlled+trial.">The effect of glutamine-enriched enteral nutrition on intestinal permeability in very-low-birth-weight infants: A randomized controlled trial.</a> Journal of Parenteral and Enteral Nutrition. 30 (5), 408-414 (2006).</li><li>Foster, J. P., Seth, R., Cole, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+immunoglobulin+for+preventing+necrotizing+enterocolitis+in+preterm+and+low+birth+weight+neonates.">Oral immunoglobulin for preventing necrotizing enterocolitis in preterm and low birth weight neonates.</a> The Cochrane Database of Systematic Reviews. 4 (4), (2016).</li><li>Maffei, D., Schanler, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+milk+is+the+feeding+strategy+to+prevent+necrotizing+enterocolitis.">Human milk is the feeding strategy to prevent necrotizing enterocolitis.</a> Seminars in Perinatology. 41 (1), 36-40 (2017).</li><li>Patel, A. L., Kim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+milk+and+necrotizing+enterocolitis.">Human milk and necrotizing enterocolitis.</a> Seminars in Pediatric Surgery. 27 (1), 34-38 (2018).</li><li>Nolan, L. S., Parks, O. B., Good, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+immunomodulating+components+of+maternal+breast+milk+and+protection+against+necrotizing+enterocolitis.">A review of the immunomodulating components of maternal breast milk and protection against necrotizing enterocolitis.</a> Nutrients. 12 (1), 14 (2019).</li><li>Hill, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+milk+hyaluronan+enhances+innate+defense+of+the+intestinal+epithelium.">Human milk hyaluronan enhances innate defense of the intestinal epithelium.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (40), 29090-29104 (2013).</li><li>Burge, K., Bergner, E., Gunasekaran, A., Eckert, J., Chaaban, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+glycosaminoglycans+in+protection+from+neonatal+necrotizing+enterocolitis:+A+narrative+review.">The role of glycosaminoglycans in protection from neonatal necrotizing enterocolitis: A narrative review.</a> Nutrients. 12 (2), 546 (2020).</li><li>Chaaban, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acceleration+of+small+intestine+development+and+remodeling+of+the+microbiome+following+hyaluronan+35+kDa+treatment+in+neonatal+mice.">Acceleration of small intestine development and remodeling of the microbiome following hyaluronan 35 kDa treatment in neonatal mice.</a> Nutrients. 13 (6), 2030 (2021).</li><li>Gunasekaran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan+35+kDa+enhances+epithelial+barrier+function+and+protects+against+the+development+of+murine+necrotizing+enterocolitis.">Hyaluronan 35 kDa enhances epithelial barrier function and protects against the development of murine necrotizing enterocolitis.</a> Pediatric Research. 87 (7), 1177-1184 (2020).</li><li>Montenegro-Miranda, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+organoid+model+of+damage+and+repair+identifies+HNF4&#945;+as+a+critical+regulator+of+intestinal+epithelial+regeneration.">A novel organoid model of damage and repair identifies HNF4&#945; as a critical regulator of intestinal epithelial regeneration.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (2), 209-223 (2020).</li><li>Lee, C., Hong, S. N., Kim, E. R., Chang, D. K., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+regeneration+ability+of+Crohn's+disease+assessed+using+patient-derived+intestinal+organoids.">Epithelial regeneration ability of Crohn's disease assessed using patient-derived intestinal organoids.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 6013 (2021).</li><li>Gurung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+Zika+virus+(ZIKV)+infection+following+vaginal+inoculation+with+ZIKV-infected+semen+in+timed-pregnant+olive+baboons.">Maternal Zika virus (ZIKV) infection following vaginal inoculation with ZIKV-infected semen in timed-pregnant olive baboons.</a> Journal of Virology. 94 (11), 00058 (2020).</li><li>Suarez-Arnedo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+image+J+plugin+for+the+high+throughput+image+analysis+of+in+vitro+scratch+wound+healing+assays.">An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays.</a> PLoS One. 15 (7), 0232565 (2020).</li><li>Kobelt, D., Walther, W., Stein, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+cell+migration+monitoring+to+analyze+drug+synergism+in+the+scratch+assay+using+the+IncuCyte+system.">Real-time cell migration monitoring to analyze drug synergism in the scratch assay using the IncuCyte system.</a> Methods in Molecular Biology. 2294, 133-142 (2021).</li><li>de Jong, J. C. W., Ijssennagger, N., van Mil, S. W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+milk+nutrients+driving+intestinal+epithelial+layer+maturation+via+Wnt+and+Notch+signaling:+Implications+for+necrotizing+enterocolitis.">Breast milk nutrients driving intestinal epithelial layer maturation via Wnt and Notch signaling: Implications for necrotizing enterocolitis.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1867 (11), 166229 (2021).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietin+protects+epithelial+cells+from+excessive+autophagy+and+apoptosis+in+experimental+neonatal+necrotizing+enterocolitis.">Erythropoietin protects epithelial cells from excessive autophagy and apoptosis in experimental neonatal necrotizing enterocolitis.</a> PLoS One. 8 (7), 69620 (2013).</li><li>Kessler, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+role+of+35+kilodalton+hyaluronan+in+promoting+defense+of+the+intestinal+epithelium.">Multifunctional role of 35 kilodalton hyaluronan in promoting defense of the intestinal epithelium.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 66 (4), 273-287 (2018).</li><li>Fraser, J. R. E., Laurent, T. C., Laurent, U. B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan:+Its+nature,+distribution,+functions+and+turnover.">Hyaluronan: Its nature, distribution, functions and turnover.</a> Journal of Internal Medicine. 242 (1), 27-33 (1997).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan+35kDa+treatment+protects+mice+from+Citrobacter+rodentium+infection+and+induces+epithelial+tight+junction+protein+ZO-1+in+vivo.">Hyaluronan 35kDa treatment protects mice from Citrobacter rodentium infection and induces epithelial tight junction protein ZO-1 in vivo.</a> Matrix Biology. 62, 28-39 (2017).</li><li>Prehm, P., Schumacher, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+hyaluronan+export+from+human+fibroblasts+by+inhibitors+of+multidrug+resistance+transporters.">Inhibition of hyaluronan export from human fibroblasts by inhibitors of multidrug resistance transporters.</a> Biochemical Pharmacology. 68 (7), 1401-1410 (2004).</li><li>Stenson, W. F., Ciorba, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonmicrobial+activation+of+TLRs+controls+intestinal+growth,+wound+repair,+and+radioprotection.">Nonmicrobial activation of TLRs controls intestinal growth, wound repair, and radioprotection.</a> Frontiers in Immunology. 11 (3591), 617510 (2021).</li><li>Riehl, T. E., Ee, X., Stenson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronic+acid+regulates+normal+intestinal+and+colonic+growth+in+mice.">Hyaluronic acid regulates normal intestinal and colonic growth in mice.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 303 (3), 377-388 (2012).</li><li>Riehl, T. E., Santhanam, S., Foster, L., Ciorba, M., Stenson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44+and+TLR4+mediate+hyaluronic+acid+regulation+of+Lgr5++stem+cell+proliferation,+crypt+fission,+and+intestinal+growth+in+postnatal+and+adult+mice.">CD44 and TLR4 mediate hyaluronic acid regulation of Lgr5+ stem cell proliferation, crypt fission, and intestinal growth in postnatal and adult mice.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309 (11), 874-887 (2015).</li><li>Hill, D. R., Kessler, S. P., Rho, H. K., Cowman, M. K., de la Motte, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific-sized+hyaluronan+fragments+promote+expression+of+human+beta-defensin+2+in+intestinal+epithelium.">Specific-sized hyaluronan fragments promote expression of human beta-defensin 2 in intestinal epithelium.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (36), 30610-30624 (2012).</li><li>Fernando, E. H., Gordon, M. H., Beck, P. L., MacNaughton, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+intestinal+epithelial+wound+healing+through+protease-activated+receptor-2+activation+in+Caco2+cells.">Inhibition of intestinal epithelial wound healing through protease-activated receptor-2 activation in Caco2 cells.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 367 (2), 382-392 (2018).</li><li>Nyegaard, S., Christensen, B., Rasmussen, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+accurate+quantification+of+cell+migration+using+human+small+intestine+cells.">An optimized method for accurate quantification of cell migration using human small intestine cells.</a> Metabolic Engineering Communications. 3, 76-83 (2016).</li><li>Roodsant, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+2D+primary+organoid-derived+epithelial+monolayer+model+to+study+host-pathogen+interaction+in+the+small+intestine.">A human 2D primary organoid-derived epithelial monolayer model to study host-pathogen interaction in the small intestine.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 272 (2020).</li><li>Singh, A., Poling, H. M., Spence, J. R., Wells, J. M., Helmrath, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+organoids:+a+next-generation+tool+for+modeling+human+development.">Gastrointestinal organoids: a next-generation tool for modeling human development.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 319 (3), 375-381 (2020).</li><li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids+as+an+ex-vivo+model+of+host-pathogen+interactions+in+the+gastrointestinal+tract.">Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract.</a> Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1124-1134 (2014).</li><li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids+as+a+model+of+upper+small+intestinal+ion+transport+physiology+and+pathophysiology.">Human enteroids as a model of upper small intestinal ion transport physiology and pathophysiology.</a> Gastroenterology. 150 (3), 638-649 (2016).</li></ol>

早産児の胃腸管は、嚥下障害、炎症性細菌代謝物および毒素、および断続的低酸素症に関連する環境侮辱への繰り返し曝露による継続的な再生圧力下にあります23,24。残念ながら、早産児の腸上皮は機能的完全性を迅速に確立することができず23、バリア機能障害、腸透過性の増加、そして重症の場合、横行する腸の炎症とNECの発?...

壊死性腸炎(NEC)は、早産児の最も一般的な胃腸緊急事態の1つです1。この疾患は、腸壊死、敗血症、および潜在的に死に至る可能性のある重度の腸の炎症を特徴としています。病因は不明ですが、証拠はNECが多因子性であり、摂食、異常な細菌コロニー形成、および未熟な腸上皮の複雑な相互作用の結果であることを示唆しています2,3。早産児は、腸透過性の増加、異常な細菌コロニー形成、および低い腸細胞再生能力4,5を有し、腸管バリア機能障害、細菌転座、およびNEC発症のリスクを高めます。したがって、腸上皮の成熟を促進し、腸上皮の再生または治癒を促進するための戦略または介入を特定することは、この致命的な病気を予防する上で重要です。
研究によると、母乳(HM)は早産児のNECに対して保護的であることが示されています6、7、8、9、10、11。ヒトと動物の両方の研究は、ウシベースの処方が腸透過性を増加させ、腸上皮細胞に直接毒性があることを示しました2,12。完全には解明されていませんが、HMの保護効果は、ラクトフェリン、免疫グロブリンA(IgA)、HMオリゴ糖などの生理活性成分を介して媒介されることを示唆する証拠があります13。HMはまた、D-グルクロン酸とN-アセチル-D-グルコサミン二糖を繰り返す独特の非硫酸化グリコサミノグリカンであるヒアルロナン(HA)も豊富です14,15。重要なことに、マウスNEC様腸損傷モデルにおいて、HM HA模倣体である経口35 kDaHA(HA35)が腸損傷の重症度を減弱させ、細菌の転座を防ぎ、死亡率を低下させることを示した16,17。
ここでは、in vitroでの腸の治癒と再生に対するHA35の効果をさらに調査します。現在、腸の創傷および修復のために最も広く使用されているin vitroアッセイは、結腸直腸癌(CRC)細胞単層において行われる引っかき傷アッセイである。CRC細胞の創傷修復は、幹細胞駆動の修復プロセスではなく、癌細胞の高度に増殖する性質に大きく依存しているため、早産児腸に対するそのようなモデルの生理学的関連性は限られています18。この制限を克服するために、早産の非ヒト霊長類(NHP)から初代幹細胞由来の小腸エンテロイドを単離および維持する手順を含む、2D腸介スクラッチ創傷モデルの確立をここで説明する。早産NECが遠位小腸で最も頻繁に報告されていることを考えると、腸の損傷と修復のモデルにおける初代上皮細胞オルガノイドの使用は、従来の結腸直腸単分子膜を利用する既存のモデルと比較して、より生理学的に翻訳可能なin vitroモデルを提供します18,19。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-675-49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x21mm Dish, Nunclon Delta</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>172931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well, TC-Treated, Flat Bottom Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#181;M Reversible Cell Strainer</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>27215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Sterile Cell Strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin, Bovine (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium/Nutrient Ham&#39;s Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>36254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>100-0485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte S3 Live-Cell Analysis Instrument</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>4647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte Scratch Wound Analysis Software Module</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>9600-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>06010</td>
			<td>This is HOGMY, but without the Y-27632 or antibiotics. Also used as base for HOGM, but then only missing the antibiotics.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L3012-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>136101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate-Buffered Saline), 1X [-] Calcium, Magnesium, pH 7.4</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>This is broad-spectrum antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hyaluronate, Research Grade, HA20K</td>
			<td>Lifecore Biomedical</td>
			<td>HA20K-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20 Automated Cell Counter</td>
			<td>Company: Bio-Rad</td>
			<td>1450102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 1X, 0.25% Trypsin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT25053CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72302</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effect of hyaluronic acid 35 kda on an in vitro model of preterm small intestinal injury and healing using enteroid-derived monolayers

in vitro 引っ掻き傷創傷アッセイは、さまざまな組織タイプにおける上皮治癒のメカニズムと特性を調査するために一般的に使用されます。ここでは、回腸末端の腸管陰窩に由来する3次元(3D)非ヒト霊長類エンテロイドから2次元(2D)単層を生成するプロトコルを記載する。次に、これらのエンテロイド由来の単分子膜を in vitro スクラッチ創傷アッセイで利用して、母乳HA模倣体であるヒアルロナン35 kDa(HA35)が上皮創傷縁に沿った細胞移動と増殖を促進する能力をテストしました。単層をコンフルエントに成長させた後、手動で引っ掻き、HA35(50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL)またはコントロール(PBS)で処理しました。ギャップへの細胞移動および増殖は、生細胞イメージング用に装備された透過光顕微鏡を用いてイメージングした。創傷閉鎖は、ImageJの創傷治癒サイズプラグインを使用して創傷治癒率として定量化された。スクラッチ領域および細胞移動速度および創傷閉鎖の割合を24時間にわたって測定した。 in vitro でのHA35は、おそらく創傷端での細胞増殖および創傷領域への移動の組み合わせを通じて、小腸腸単層の創傷治癒を促進する。これらの方法は、早産のヒト小腸における腸管再生を探索するためのモデルとして潜在的に使用することができる。

さまざまな組織や臓器の組織修復と創傷治癒に対するHAの影響は十分に文書化されています。ただし、胎児または新生児の小腸の治癒と再生に対する分子量35 kDaのHAの具体的な影響は現在不明です。.胎児または新生児の小腸のモデルでHA35が創傷治癒を促進する能力をテストするために、NHP回腸組織から3D腸管エンテロイドを生成し、さらにこの組織を単一細胞に解離させて2Dエンテロイド由来...

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Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers

このプロトコルは、非ヒト霊長類回腸から単離された3次元(3D)エンテロイドに由来する2次元(2D)単層上で引っかき傷アッセイを確立して実行する方法を記載する。

エンテロイド由来単分子膜を用いた早産小腸障害および治癒の in vitro モデルに対するヒアルロン酸35 kDaの効果

In vitro scratch wound assays are commonly used to investigate the mechanisms and characteristics of epithelial healing in a variety of tissue types. ...

このプロトコルは、小腸のすべての主要な細胞型を表すエンテロイド由来単層を用いた再生研究に使用される非常に一般的な引っかき傷アッセイを拡張します。この技術により、腸管再生の早産2D腸管単層モデルにおける創傷閉鎖のリアルタイム視覚化が可能になります。私たちの技術は、形質転換された結腸直腸癌細胞株を使用したモデリングが不十分な早産哺乳類の腸の研究に適用できます。まず、96マイクロリットルの細胞外マトリックスまたはECMベースのヒドロゲルBMEを、摂氏2〜8度の氷上で一晩解凍します。ECMベースのヒドロゲルとカルシウムまたはマグネシウムを含まない氷冷PBSを1対50の比率で希釈します。24ウェル組織培養プレートの各ウェルに200マイクロリットルの氷冷希釈ECMベースのヒドロゲルをコーティングし、コーティングプレートを摂氏37度および5%の二酸化炭素で最低1時間インキュベートします。次に、単層用の3Dエンテロイドを含む24ウェル培養プレートから培地を吸引し、ウェルあたり500マイクロリットルの細胞解離試薬と交換します。ECMベースのヒドロゲルドームを手動で破壊するには、8〜12回ピペッティングし、12ウェルの内容物を15ミリリットルのコニカルチューブに移します。12個の空のウェルを250マイクロリットルの細胞解離試薬で洗浄し、すべてのエンテロイドが除去されたことを確認し、内容物を15ミリリットルの円錐形チューブに移します。コニカルチューブを300gで摂氏4度で5分間遠心分離し、上清を廃棄します。10ミリリットルの氷冷DMEM/F-12洗浄バッファーを円錐形チューブに加え、チューブを反転させて腸内ペレットを懸濁します。300gで4°Cで5分間遠心分離し、上清を除去する。細胞ペレットを12ミリリットルの摂氏37度のトリプシン-EDTAに再懸濁し、チューブを摂氏37度の水浴に10分間、または細胞が可溶になるまで置きます。3ミリリットルのDMEM/F-12洗浄バッファーを各チューブに加え、トリプシン-EDTAを希釈します。チューブを反転させて混合し、氷の上に置きます。解離したエンテロイドを37マイクロメートルのメッシュセルストレーナーでろ過します。内容物をきれいな15ミリリットルの円錐形のチューブに集め、300gで摂氏4度で5分間遠心分離します。コニカルチューブから上清を取り除き、細胞ペレットを6ミリリットルのHOMGYで再懸濁します。次に、ECMベースのヒドロゲルコーティングプレートをインキュベーターから取り出し、コーティングされた表面を傷つけたり、プレートを完全に乾燥させたりすることなく、余分なECMベースのヒドロゲル溶液を吸引します。合わせた12ミリリットルのHOMGY細胞懸濁液を、ECMベースのヒドロゲルでコーティングした24ウェルプレートの各ウェルに500マイクロリットル加えます。蓋をした状態でプレートを回転させて、ウェル内の細胞が均一に分布するようにします。プレートを摂氏37度と5%の二酸化炭素でインキュベートし、単層が90%コンフルエンシーを超えるまで2日ごとにHOMGY培地を交換します。単層が90%コンフルエンシーを超えたら、培地を吸引して、付着していない細胞を取り除きます。HOMGYに溶解した500マイクロリットルのHA35またはPBSで細胞を24時間処理します。その後、単層の表面を乱さずにメディアを取り外します。200マイクロリットルのピペットチップを使用して、単層が乾かないように注意しながら、各ウェルの単層の全面直径全体に直線的な傷を付けます。傷のある単分子膜を500マイクロリットルの1X PBSで1回洗浄し、HOMGYに溶解した500マイクロリットルのHA35またはPBSを加えます。プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%のインキュベーター内の生細胞分析装置に移します。ライブセル解析ソフトウェアのスケジュールアイコンの下で、新しい船舶の追加ウィザードの起動アイコンをクリックします。[スケジュールに従ってスキャン]を選択し、[次へ]をクリックします。[容器の作成]で[新規]を選択し、[次へ]をクリックしてから、[スキャンタイプ]で[ウェル全体]を選択して、[次へ]をクリックします。画像チャンネルにはフェーズを選択し、対物レンズには4xを選択します。表示されたリストからプレートの製造元とカタログ番号を選択し、[次へ]をクリックします。空の容器位置を選択し、その後に目的のスキャンパターンを選択します。[名前] にプレート名を入力し、プラス を選択してプレート レイアウトを作成します。小さいプラス記号を選択して、処理名を作成します。短い名前を入力し、[OK] を入力します。その処理に対応するプレートウェルを強調表示し、大きなプラスを押して、その処理のあるウェルを指定します。化合物濃度を入力し、[OK]をクリックします。プレートが完了したら、[OK]、[次へ] の順に選択します。[分析を後で延期する] を選択し、[4 時間間隔でスキャンして新しいスケジュールを作成する] を選択します。1 日、0 時間でスキャンを停止します。概要が正しいことを確認し、スケジュールに追加します。ライブセル解析ソフトウェアで、画面上部の[表示]を選択します。[船舶名]メニューから、完了した24時間のスキャンに移動し、船舶名をダブルクリックします。左側の[画像とムービーのエクスポート]アイコンを選択してから、[表示時]オプションを選択します。関心のあるウェルをハイライト表示し、[対象タイム ポイント] と [表示される一連のイメージ] を選択します。シーケンスタイプとスキャンが正しいことを確認します。目的のターゲットフォルダの場所を選択します。ドロップダウンメニューから[JPEG]を選択し、[エクスポート]を選択します。ImageJソフトウェアを開き、引っかき傷アッセイ画像をアップロードします。「イメージ」を選択し、「8-bit」と入力して、イメージを 24 ビット RGB から変更します。プラグイン、マクロ、インストール、Wound_healing_sizeプラグインを選択して、創傷治癒サイズプラグインをインストールします。その後、分散ウィンドウの半径を20、しきい値を100、飽和ピクセルの割合を0.001に設定します。[スケールをグローバルに設定] で [はい] を選択し、[OK] をクリックします。輪郭が線で囲まれた領域であることを確認し、追加の引っかき傷についても繰り返します。最後に、画面上に示される式を用いて、24時間にわたる遊走または増殖細胞の創傷治癒の引っ掻き領域の割合を計算する。ここで、T0は時刻0時の面積であり、TCは0時間、4時間、12時間、または24時間の面積である。腸内生成およびエンテロイド由来単層創傷治癒アッセイ手順がこれらの画像に示されている。三次元の非ヒト霊長類腸管エンテロイドの培養物は、2次元単層に解離するために使用されます。単層を24ウェルプレートで90%を超えるコンフルエントまで成長させた後、HA35またはPBSで24時間処理しました。次に、単層をP200ピペットチップで引っ掻きました。ここに示されているのは、非ヒト霊長類腸質単層の対照治療におけるHA35の代表的な画像です。画像は、P200ピペットチップでスクラッチを行ってから0時間、4時間、12時間、および24時間後に取得されました。創傷治癒および様体単層に対するHA35の効果をここに示す。腸質単層における経時的な創傷治癒の変化は、HA35治療濃度に依存する。HA35は、対照と比較して、1ミリリットルあたり100マイクログラムおよび1ミリリットルあたり200マイクログラムで、4時間および12時間後の創傷治癒を有意に増加させたが、治癒率は24時間までに治療間で収束した。この手順で覚えておくべき最も重要なことの1つは、腸腸単層は短命であるということです。したがって、それらが90%コンフルイドになったら、調査員はそれらを迅速に使用することを検討する必要があります。この技術は、特に炎症性損傷ではなく機械的損傷に関心がある場合、in vitroでの早産腸再生の頼りになるモデルになっています。

Research

JoVE Journal

Medicine

Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers

A Contusive Model of Unilateral Cervical Spinal Cord Injury Using the Infinite Horizon Impactor

無限の地平線インパクターを用いた片側頚髄損傷の打撲のモデル

While the majority of human spinal cord injuries occur in the cervical spinal cord, the vast majority of laboratory research employs animal models of ...

Murine Model of Wound Healing

創傷治癒のマウスモデル

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

An Alkali-burn Injury Model of Corneal Neovascularization in the Mouse

マウス角膜血管新生のアルカリ熱傷損傷モデル

Under normal conditions, the cornea is avascular, and this transparency is essential for maintaining good visual acuity. Neovascularization (NV) of the ...

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

マウス内視鏡検査のため<em&gt;インビボ</em&gt;発がんと腸の評価のマルチモーダルイメージング創傷治癒および炎症

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions ...

Development of an Algorithm to Perform a Comprehensive Study of Autonomic Dysreflexia in Animals with High Spinal Cord Injury Using a Telemetry Device

遠隔測定装置を使用した高脊髄損傷で動物に自律神経反射異常の総合的研究を行うためにアルゴリズムの開発

Spinal cord injury (SCI) is a debilitating neurological condition characterized by somatic and autonomic dysfunctions. In particular, SCI above the ...

Murine Model of Intestinal Ischemia-reperfusion Injury

腸管虚血 - 再灌流傷害のマウスモデル

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, ...

Open Tracheostomy Gastric Acid Aspiration Murine Model of Acute Lung Injury Results in Maximal Acute Nonlethal Lung Injury

最大急性非致死肺損傷における急性肺損傷の結果のオープン気管切開胃酸吸引マウスモデル

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

体外血液脳関門ブタ脳血管内皮細胞に基づくモデルの確立のための改良法

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

生体内で破壊カルス開発マウス大腿骨の骨、MRI 対応のデバイスを用いたマウスの骨治癒過程の評価

Endochondral fracture healing is a complex process involving the development of fibrous, cartilaginous, and osseous tissue in the fracture callus. The ...