Name: effect of hyaluronic acid 35 kda on an in vitro model of preterm small intestinal injury and healing using enteroid-derived monolayers
Uploaded: 2022-07-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers at JoVE.com

Dette innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til National Institutes of Health. HC støttes av tilskudd P20GM134973 fra National Institutes of Health. KB støttes av et Children's Hospital Foundation (CHF) og Presbyterian Health Foundation (PHF) stipend. Live-cell imaging tjenester levert av Cancer Functional Genomics kjernen ble støttet delvis av National Institute of General Medical Sciences Grant P20GM103639 og National Cancer Institute Grant P30CA225520 av National Institutes of Health, tildelt University of Oklahoma Health Sciences Center Stephenson Cancer Center.

Alle dyreprosedyrer i denne studien ble godkjent av University of Oklahoma Health Sciences Center Institutional Animal Care and Use Committee. Etter institusjonell godkjenning ble fosterets tynntarmsprøver fra en for tidlig ikke-menneskelig primat (NHP, 90% svangerskap, olivenbavian, Papio anubis) oppnådd etter eutanasi for en egen studie (protokoll # 101523-16-039-I) 20.
1. Etablering av premature ikke-humane primater 3D intestinal enteroider<...

<ol>
	<li>Lemons, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Very+low+birth+weight+outcomes+of+the+National+Institute+of+Child+Health+and+Human+Development+Neonatal+Research+Network,+January+1995+through+December+1996.">Very low birth weight outcomes of the National Institute of Child Health and Human Development Neonatal Research Network, January 1995 through December 1996.</a> Pediatrics. 107 (1), 1 (2001).</li><li>Burge, K., Vieira, F., Eckert, J., Chaaban, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+composition,+digestion,+and+absorption+differences+among+neonatal+feeding+strategies:+Potential+implications+for+intestinal+inflammation+in+preterm+infants.">Lipid composition, digestion, and absorption differences among neonatal feeding strategies: Potential implications for intestinal inflammation in preterm infants.</a> Nutrients. 13 (2), 550 (2021).</li><li>Duffy, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+mediating+bacterial+translocation+in+the+immature+intestine.">Interactions mediating bacterial translocation in the immature intestine.</a> The Journal of Nutrition. 130, 432-436 (2000).</li><li>Nanthakumar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+excessive+intestinal+inflammation+in+necrotizing+enterocolitis:+An+immature+innate+immune+response.">The mechanism of excessive intestinal inflammation in necrotizing enterocolitis: An immature innate immune response.</a> PLoS One. 6 (3), 17776 (2011).</li><li>Nanthakumar, N. N., Fusunyan, R. D., Sanderson, I., Walker, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+in+the+developing+human+intestine:+A+possible+pathophysiologic+contribution+to+necrotizing+enterocolitis.">Inflammation in the developing human intestine: A possible pathophysiologic contribution to necrotizing enterocolitis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 6043-6048 (2000).</li><li>He, Y., Lawlor, N. T., Newburg, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+milk+components+modulate+toll-like+receptor-mediated+inflammation.">Human milk components modulate toll-like receptor-mediated inflammation.</a> Advances in Nutrition. 7 (1), 102-111 (2016).</li><li>Walker, W. A., Iyengar, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+milk,+microbiota,+and+intestinal+immune+homeostasis.">Breast milk, microbiota, and intestinal immune homeostasis.</a> Pediatric Research. 77 (1-2), 220-228 (2015).</li><li>Westerbeek, E. A., vanden Berg, A., Lafeber, H. N., Fetter, W. P., van Elburg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+enteral+supplementation+of+a+prebiotic+mixture+of+non-human+milk+galacto-,+fructo-+and+acidic+oligosaccharides+on+intestinal+permeability+in+preterm+infants.">The effect of enteral supplementation of a prebiotic mixture of non-human milk galacto-, fructo- and acidic oligosaccharides on intestinal permeability in preterm infants.</a> British Journal of Nutrition. 105 (2), 268-274 (2011).</li><li>vanden Berg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+glutamine-enriched+enteral+nutrition+on+intestinal+permeability+in+very-low-birth-weight+infants:+A+randomized+controlled+trial.">The effect of glutamine-enriched enteral nutrition on intestinal permeability in very-low-birth-weight infants: A randomized controlled trial.</a> Journal of Parenteral and Enteral Nutrition. 30 (5), 408-414 (2006).</li><li>Foster, J. P., Seth, R., Cole, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+immunoglobulin+for+preventing+necrotizing+enterocolitis+in+preterm+and+low+birth+weight+neonates.">Oral immunoglobulin for preventing necrotizing enterocolitis in preterm and low birth weight neonates.</a> The Cochrane Database of Systematic Reviews. 4 (4), (2016).</li><li>Maffei, D., Schanler, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+milk+is+the+feeding+strategy+to+prevent+necrotizing+enterocolitis.">Human milk is the feeding strategy to prevent necrotizing enterocolitis.</a> Seminars in Perinatology. 41 (1), 36-40 (2017).</li><li>Patel, A. L., Kim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+milk+and+necrotizing+enterocolitis.">Human milk and necrotizing enterocolitis.</a> Seminars in Pediatric Surgery. 27 (1), 34-38 (2018).</li><li>Nolan, L. S., Parks, O. B., Good, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+immunomodulating+components+of+maternal+breast+milk+and+protection+against+necrotizing+enterocolitis.">A review of the immunomodulating components of maternal breast milk and protection against necrotizing enterocolitis.</a> Nutrients. 12 (1), 14 (2019).</li><li>Hill, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+milk+hyaluronan+enhances+innate+defense+of+the+intestinal+epithelium.">Human milk hyaluronan enhances innate defense of the intestinal epithelium.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (40), 29090-29104 (2013).</li><li>Burge, K., Bergner, E., Gunasekaran, A., Eckert, J., Chaaban, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+glycosaminoglycans+in+protection+from+neonatal+necrotizing+enterocolitis:+A+narrative+review.">The role of glycosaminoglycans in protection from neonatal necrotizing enterocolitis: A narrative review.</a> Nutrients. 12 (2), 546 (2020).</li><li>Chaaban, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acceleration+of+small+intestine+development+and+remodeling+of+the+microbiome+following+hyaluronan+35+kDa+treatment+in+neonatal+mice.">Acceleration of small intestine development and remodeling of the microbiome following hyaluronan 35 kDa treatment in neonatal mice.</a> Nutrients. 13 (6), 2030 (2021).</li><li>Gunasekaran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan+35+kDa+enhances+epithelial+barrier+function+and+protects+against+the+development+of+murine+necrotizing+enterocolitis.">Hyaluronan 35 kDa enhances epithelial barrier function and protects against the development of murine necrotizing enterocolitis.</a> Pediatric Research. 87 (7), 1177-1184 (2020).</li><li>Montenegro-Miranda, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+organoid+model+of+damage+and+repair+identifies+HNF4&#945;+as+a+critical+regulator+of+intestinal+epithelial+regeneration.">A novel organoid model of damage and repair identifies HNF4&#945; as a critical regulator of intestinal epithelial regeneration.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (2), 209-223 (2020).</li><li>Lee, C., Hong, S. N., Kim, E. R., Chang, D. K., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+regeneration+ability+of+Crohn's+disease+assessed+using+patient-derived+intestinal+organoids.">Epithelial regeneration ability of Crohn's disease assessed using patient-derived intestinal organoids.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 6013 (2021).</li><li>Gurung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+Zika+virus+(ZIKV)+infection+following+vaginal+inoculation+with+ZIKV-infected+semen+in+timed-pregnant+olive+baboons.">Maternal Zika virus (ZIKV) infection following vaginal inoculation with ZIKV-infected semen in timed-pregnant olive baboons.</a> Journal of Virology. 94 (11), 00058 (2020).</li><li>Suarez-Arnedo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+image+J+plugin+for+the+high+throughput+image+analysis+of+in+vitro+scratch+wound+healing+assays.">An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays.</a> PLoS One. 15 (7), 0232565 (2020).</li><li>Kobelt, D., Walther, W., Stein, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+cell+migration+monitoring+to+analyze+drug+synergism+in+the+scratch+assay+using+the+IncuCyte+system.">Real-time cell migration monitoring to analyze drug synergism in the scratch assay using the IncuCyte system.</a> Methods in Molecular Biology. 2294, 133-142 (2021).</li><li>de Jong, J. C. W., Ijssennagger, N., van Mil, S. W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+milk+nutrients+driving+intestinal+epithelial+layer+maturation+via+Wnt+and+Notch+signaling:+Implications+for+necrotizing+enterocolitis.">Breast milk nutrients driving intestinal epithelial layer maturation via Wnt and Notch signaling: Implications for necrotizing enterocolitis.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1867 (11), 166229 (2021).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietin+protects+epithelial+cells+from+excessive+autophagy+and+apoptosis+in+experimental+neonatal+necrotizing+enterocolitis.">Erythropoietin protects epithelial cells from excessive autophagy and apoptosis in experimental neonatal necrotizing enterocolitis.</a> PLoS One. 8 (7), 69620 (2013).</li><li>Kessler, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+role+of+35+kilodalton+hyaluronan+in+promoting+defense+of+the+intestinal+epithelium.">Multifunctional role of 35 kilodalton hyaluronan in promoting defense of the intestinal epithelium.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 66 (4), 273-287 (2018).</li><li>Fraser, J. R. E., Laurent, T. C., Laurent, U. B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan:+Its+nature,+distribution,+functions+and+turnover.">Hyaluronan: Its nature, distribution, functions and turnover.</a> Journal of Internal Medicine. 242 (1), 27-33 (1997).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan+35kDa+treatment+protects+mice+from+Citrobacter+rodentium+infection+and+induces+epithelial+tight+junction+protein+ZO-1+in+vivo.">Hyaluronan 35kDa treatment protects mice from Citrobacter rodentium infection and induces epithelial tight junction protein ZO-1 in vivo.</a> Matrix Biology. 62, 28-39 (2017).</li><li>Prehm, P., Schumacher, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+hyaluronan+export+from+human+fibroblasts+by+inhibitors+of+multidrug+resistance+transporters.">Inhibition of hyaluronan export from human fibroblasts by inhibitors of multidrug resistance transporters.</a> Biochemical Pharmacology. 68 (7), 1401-1410 (2004).</li><li>Stenson, W. F., Ciorba, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonmicrobial+activation+of+TLRs+controls+intestinal+growth,+wound+repair,+and+radioprotection.">Nonmicrobial activation of TLRs controls intestinal growth, wound repair, and radioprotection.</a> Frontiers in Immunology. 11 (3591), 617510 (2021).</li><li>Riehl, T. E., Ee, X., Stenson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronic+acid+regulates+normal+intestinal+and+colonic+growth+in+mice.">Hyaluronic acid regulates normal intestinal and colonic growth in mice.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 303 (3), 377-388 (2012).</li><li>Riehl, T. E., Santhanam, S., Foster, L., Ciorba, M., Stenson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44+and+TLR4+mediate+hyaluronic+acid+regulation+of+Lgr5++stem+cell+proliferation,+crypt+fission,+and+intestinal+growth+in+postnatal+and+adult+mice.">CD44 and TLR4 mediate hyaluronic acid regulation of Lgr5+ stem cell proliferation, crypt fission, and intestinal growth in postnatal and adult mice.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309 (11), 874-887 (2015).</li><li>Hill, D. R., Kessler, S. P., Rho, H. K., Cowman, M. K., de la Motte, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific-sized+hyaluronan+fragments+promote+expression+of+human+beta-defensin+2+in+intestinal+epithelium.">Specific-sized hyaluronan fragments promote expression of human beta-defensin 2 in intestinal epithelium.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (36), 30610-30624 (2012).</li><li>Fernando, E. H., Gordon, M. H., Beck, P. L., MacNaughton, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+intestinal+epithelial+wound+healing+through+protease-activated+receptor-2+activation+in+Caco2+cells.">Inhibition of intestinal epithelial wound healing through protease-activated receptor-2 activation in Caco2 cells.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 367 (2), 382-392 (2018).</li><li>Nyegaard, S., Christensen, B., Rasmussen, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+accurate+quantification+of+cell+migration+using+human+small+intestine+cells.">An optimized method for accurate quantification of cell migration using human small intestine cells.</a> Metabolic Engineering Communications. 3, 76-83 (2016).</li><li>Roodsant, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+2D+primary+organoid-derived+epithelial+monolayer+model+to+study+host-pathogen+interaction+in+the+small+intestine.">A human 2D primary organoid-derived epithelial monolayer model to study host-pathogen interaction in the small intestine.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 272 (2020).</li><li>Singh, A., Poling, H. M., Spence, J. R., Wells, J. M., Helmrath, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+organoids:+a+next-generation+tool+for+modeling+human+development.">Gastrointestinal organoids: a next-generation tool for modeling human development.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 319 (3), 375-381 (2020).</li><li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids+as+an+ex-vivo+model+of+host-pathogen+interactions+in+the+gastrointestinal+tract.">Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract.</a> Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1124-1134 (2014).</li><li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids+as+a+model+of+upper+small+intestinal+ion+transport+physiology+and+pathophysiology.">Human enteroids as a model of upper small intestinal ion transport physiology and pathophysiology.</a> Gastroenterology. 150 (3), 638-649 (2016).</li></ol>

Mage-tarmkanalen til et for tidlig spedbarn er under kontinuerlig regenerativt press fra gjentatte eksponeringer for miljømessige fornærmelser forbundet med dysbiose, inflammatoriske bakterielle metabolitter og toksiner, og intermitterende hypoksi23,24. Dessverre er tarmepitelet til det premature spedbarnet ikke i stand til raskt å etablere funksjonell integritet23, noe som resulterer i barrieredysfunksjon, økt intestinal permeabilitet...

Nekrotiserende enterokolitt (NEC) er en av de vanligste gastrointestinale nødsituasjonene hos premature spedbarn1. Sykdommen er preget av alvorlig tarmbetennelse som raskt kan forverres til tarmnekrose, sepsis og potensielt død. Selv om etiologien er uklar, tyder bevis på at NEC er multifaktoriell og resultatet av en kompleks interaksjon av fôring, unormal bakteriell kolonisering og et umodent tarmepitel 2,3. Premature spedbarn har økt intestinal permeabilitet, unormal bakteriell kolonisering og lav enterocytt regenerativ kapasitet4,5, noe som øker risikoen for tarmbarrieredysfunksjon, bakteriell translokasjon og NEC-utvikling. Derfor er identifisering av strategier eller inngrep for å akselerere tarmepitelmodning og fremme regenerering eller helbredelse av tarmepitelet avgjørende for å forhindre denne dødelige sykdommen.
Studier har vist at morsmelk (HM) er beskyttende mot NEC hos premature spedbarn 6,7,8,9,10,11. Både menneskelige og dyreforsøk har vist at storfebasert formel øker tarmpermeabiliteten og er direkte giftig for tarmepitelceller 2,12. Selv om det ikke er fullstendig belyst, tyder bevis på at de beskyttende effektene av HM er mediert gjennom bioaktive komponenter som laktoferrin, immunoglobulin A (IgA) og HM oligosakkarider13. HM er også rik på hyaluronan (HA), et unikt ikke-sulfatert glykosaminoglykan med repeterende D-glukuronsyre og N-acetyl-D-glukosamindisakkarider14,15. Det er viktig at vi har vist at oral 35 kDa HA (HA35), en HM HA-etterligning, demper alvorlighetsgraden av tarmskade, forhindrer bakteriell translokasjon og reduserer dødeligheten i en murine NEC-lignende tarmskademodell16,17. 
Her undersøkes effekten av HA35 på tarmheling og regenerering in vitro videre. For tiden er den mest brukte in vitro-analysen for tarmsår og reparasjon en ripesåranalyse utført i kolorektal kreft (CRC) cellemonolag. Den fysiologiske relevansen av en slik modell for premature spedbarns tarm er begrenset, da sårreparasjon av CRC-celler er avhengig av den svært proliferative naturen til kreftceller i stedet for stamcelledrevne reparasjonsprosesser18. For å overvinne denne begrensningen er etableringen av en 2D enteroid ripesårmodell, inkludert prosedyren for å isolere og vedlikeholde primære stamcelleavledede tynntarm-enteroider fra premature ikke-menneskelige primater (NHP), beskrevet her. Gitt for tidlig NEC er oftest rapportert i distal tynntarm, gir bruk av primære epitelcelleorganoider i en modell for tarmskade og reparasjon en mer fysiologisk oversettbar in vitro-modell sammenlignet med eksisterende modeller som benytter tradisjonelle kolorektale monolag18,19.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-675-49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x21mm Dish, Nunclon Delta</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>172931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well, TC-Treated, Flat Bottom Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#181;M Reversible Cell Strainer</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>27215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Sterile Cell Strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin, Bovine (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium/Nutrient Ham&#39;s Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>36254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>100-0485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte S3 Live-Cell Analysis Instrument</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>4647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte Scratch Wound Analysis Software Module</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>9600-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>06010</td>
			<td>This is HOGMY, but without the Y-27632 or antibiotics. Also used as base for HOGM, but then only missing the antibiotics.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L3012-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>136101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate-Buffered Saline), 1X [-] Calcium, Magnesium, pH 7.4</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>This is broad-spectrum antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hyaluronate, Research Grade, HA20K</td>
			<td>Lifecore Biomedical</td>
			<td>HA20K-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20 Automated Cell Counter</td>
			<td>Company: Bio-Rad</td>
			<td>1450102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 1X, 0.25% Trypsin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT25053CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72302</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effect of hyaluronic acid 35 kda on an in vitro model of preterm small intestinal injury and healing using enteroid-derived monolayers

In vitro scratch såranalyser brukes ofte til å undersøke mekanismene og egenskapene til epitelheling i en rekke vevstyper. Her beskriver vi en protokoll for å generere et todimensjonalt (2D) monolag fra tredimensjonale (3D) ikke-humane primat-enteroider avledet fra tarmkrypter i terminal ileum. Disse enteroid-avledede monolagene ble deretter brukt i en in vitro ripesåranalyse for å teste evnen til hyaluronan 35 kDa (HA35), en human melk HA-etterligning, for å fremme cellemigrasjon og spredning langs epitelsårkanten. Etter at monolagene ble dyrket til sammenløp, ble de manuelt riper og behandlet med HA35 (50 μg / ml, 100 μg / ml, 200 μg / ml) eller kontroll (PBS). Cellemigrasjon og spredning i gapet ble avbildet ved hjelp av et overført lysmikroskop utstyrt for levende celleavbildning. Sårlukking ble kvantifisert som prosent sårheling ved hjelp av Wound Healing Size Plugin i ImageJ. Ripeområdet og hastigheten på cellemigrasjon og prosentandelen av sårlukking ble målt over 24 timer. HA35 in vitro akseler sårheling i små intestinale enteroide monolag, sannsynligvis gjennom en kombinasjon av celleproliferasjon ved sårkanten og migrasjon til sårområdet. Disse metodene kan potensielt brukes som en modell for å utforske intestinal regenerering i for tidlig menneskelig tynntarm.

Effektene av HA på vevsreparasjon og sårheling i ulike vev og organer er godt dokumentert; Imidlertid er de spesifikke effektene av HA med en molekylvekt på 35 kDa på føtal eller neonatal tilheling og regenerering av tynntarm ukjent. For å teste HA35s evne til å fremme sårheling i en modell av føtal eller neonatal tynntarm, genererte vi 3D-intestinale enteroider fra NHP-ilealvev og dissosierte dette vevet ytterligere i enkeltceller for å lage 2D enteroid-avledede monolag (figur 1A<...

Watch this Scientific Journal Video about Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers at JoVE.com

Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers

Denne protokollen beskriver en metode for å etablere og utføre en ripesåranalyse på todimensjonale (2D) monolag avledet fra tredimensjonale (3D) enteroider isolert fra ikke-human primat ileum.

Effekt av hyaluronsyre 35 kDa på en in vitro-modell av for tidlig tarmskade og tilheling ved bruk av enteroidavledede monolag

In vitro scratch wound assays are commonly used to investigate the mechanisms and characteristics of epithelial healing in a variety of tissue types. ...

Denne protokollen utvider den svært vanlige ripesåranalysen som brukes til regenereringsstudier med enteroid-avledede monolag som representerer alle hovedcelletyper i tynntarmen. Denne teknikken muliggjør sanntidsvisualisering av sårlukking i en for tidlig 2D enteroid monolagsmodell for intestinal regenerering. Vår teknikk kan brukes til studiet av for tidlig pattedyrs tarm, som vanligvis er dårlig modellert ved hjelp av transformerte kolorektale kreftcellelinjer.Begynn med å tine 96 mikroliter ekstracellulær matriks, eller ECM-basert hydrogel BME, over natten på is ved to til åtte grader Celsius. Fortynn den ECM-baserte hydrogelen og iskald PBS uten kalsium eller magnesium i et forhold på en til 50. Belegg hver brønn av en 24-brønns vevskulturplate med 200 mikroliter iskald fortynnet ECM-basert hydrogel og inkuber den belagte platen i minst en time ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid.Deretter aspirerer du mediet fra 24-brønnskulturplaten som inneholder 3D-enteroider bestemt for monolag og erstatter det med 500 mikroliter celledissosiasjonsreagens per brønn. Manuelt forstyrre ECM-baserte hydrogel kupler ved pipettering opp og ned åtte til 12 ganger og overføre innholdet i 12 brønner til en 15-milliliter konisk rør. Vask de 12 tomme brønnene med 250 mikroliter celledissosiasjonsreagens for å sikre at alle enteroider er fjernet og overfør innholdet til 15 milliliter koniske rør.Sentrifuge de koniske rørene ved 300g i fem minutter ved fire grader Celsius og kast supernatanten. Tilsett 10 ml iskald DMEM / F-12 vaskebuffer til de koniske rørene og suspender enteroidpellets ved å invertere rørene. Sentrifuge ved 300g i fem minutter ved fire grader Celsius og fjern supernatanten.Resuspend cellepellets i 12 milliliter 37 grader Celsius Trypsin-EDTA og legg rørene i et 37 grader Celsius vannbad i 10 minutter eller til cellene virker løselige. Tilsett tre milliliter DMEM / F-12 vaskebuffer til hvert rør for å fortynne Trypsin-EDTA. Bland ved å snu rørene og legg på is.Filtrer de dissosierte enteroider gjennom en 37 mikrometer mesh celle sil. Samle innholdet i rene 15 milliliter koniske rør og sentrifuger rørene ved 300g i fem minutter ved fire grader Celsius. Fjern supernatanten fra de koniske rørene og resuspender cellepellets med seks ml HOMGY.Fjern deretter den ECM-baserte hydrogelbelagte platen fra inkubatoren og aspirer overflødig ECM-basert hydrogelløsning uten å skrape den belagte overflaten eller tørke platen helt. Tilsett 500 mikroliter av den kombinerte 12 milliliter HOMGY cellesuspensjonen i hver brønn i 24-brønnsplaten belagt med ECM-basert hydrogel. Virvle platen med lokket på for å sikre en jevn fordeling av celler i brønnene.Inkuber platen ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid, og utveksle HOMGY-medier annenhver dag til monolagene når mer enn 90% sammenløp. Når monolagene når mer enn 90% sammenløp, aspirerer media for å fjerne celler som ikke klarer å feste seg. Behandle cellene med 500 mikroliter HA35 eller PBS oppløst i HOMGY i 24 timer.Deretter fjerner du mediet uten å forstyrre overflaten av monolaget. Bruk en pipettespiss på 200 mikroliter til å lage en lineær ripe over monolagets fulle overflatediameter i hver brønn, og vær forsiktig så du ikke lar monolagene tørke. Vask de ripete monolagene en gang med 500 mikroliter 1X PBS og tilsett 500 mikroliter HA35 eller PBS oppløst i HOMGY.Overfør platen til levende celleanalyseinstrument innen en 37 grader Celsius og 5% karbondioksidinkubator. Under Tidsplan-ikonet i programvaren for live celleanalyse klikker du på ikonet Start veiviser for å legge til nytt fartøy. Velg Skann etter planen, og klikk deretter på Neste.Velg Ny under Opprett fartøy og klikk på Neste, velg deretter Hele brønnen under Skannetype og klikk Neste. Velg Fase for bildekanaler og 4x for målet. Velg plateprodusenten og katalognummeret fra den angitte listen, og klikk på Neste.Velg en tom fartøyplassering etterfulgt av ønsket skannemønster. Skriv inn platenavn i Navn, og velg deretter pluss for å opprette et plateoppsett. Velg lite pluss for å opprette et behandlingsnavn.Skriv inn kortnavn og deretter OK. Fremhev platebrønnene som tilsvarer den behandlingen og treff stort pluss for å betegne brønner med den behandlingen. Skriv inn sammensatt konsentrasjon og klikk OK. Når platen er fullført, velger du OK, Neste. Velg Utsett analyse til senere etterfulgt av Opprett ny tidsplan med skanninger med intervaller på fire timer.Stopp skanning på en dag, null timer. Kontroller at sammendraget er riktig, og legg deretter til i tidsplanen. I programvare for live celleanalyse velger du Vis øverst på skjermen.Fra Fartøynavn-menyen navigerer du til den fullførte 24-timers skanningen og dobbeltklikker på fartøynavnet. Velg Eksporter bilder og filmer ikonet til venstre etterfulgt av Som vist alternativ. Uthev brønnene av interesse, og velg deretter interessepunkter og Bildeserier som vises.Kontroller at sekvenstypen og skanningene er riktige. Velg ønsket målmappeplassering. Velg JPEG fra rullegardinmenyen og deretter Eksporter.Åpne ImageJ-programvaren og last opp bildet av skrapesåranalysen. Velg Bilde, og skriv deretter inn 8-biters for å endre bildet fra 24-biters RGB. Velg Plugins, Macros, Install Wound_healing_size plugin for å installere Wound Healing Size Plugin.Deretter setter du variansvinduets radius til 20, terskelverdi til 100, prosentandel av mettede piksler til 0,001. Ja for Sett skala globalt, og klikk deretter på OK. Kontroller at det skisserte området er sårområdet og gjenta for ytterligere riper. Til slutt beregner du prosentandelen av sårhelingen i skrapeområdet av migrerende eller prolifererende celler over 24 timer ved hjelp av ligningen som vises på skjermen.Her er T0 området på tid null timer, og TC er området på null timer, fire timer, 12 timer eller 24 timer. Enteroidgenerering og enteroid-avledet monolags sårhelingsanalyseprosedyre er vist på disse bildene. En kultur av tredimensjonale, ikke-menneskelige primat-intestinale enteroider brukes til å dissosiere til todimensjonale monolag.Monolag ble dyrket til mer enn 90% sammenløp i en 24-brønns plate og deretter behandlet med HA35 eller PBS i 24 timer. Monolag ble deretter riper med en P200 pipettespiss. Vist her er de representative bildene av HA35 i kontrollbehandlinger av ikke-menneskelige primat enteroide monolag.Bilder ble tatt på null timer, fire timer, 12 timer og 24 timer etter å ha utført en ripe med en P200 pipettespiss. Effekten av HA35 på sårheling og oide monolag er vist her. Endringen i sårtilheling over tid i enteroide monolag er avhengig av behandlingskonsentrasjonen av HA35.HA35 økte sårhelingen signifikant etter fire timer og 12 timer ved 100 mikrogram per milliliter og 200 mikrogram per milliliter sammenlignet med kontroll, men helbredelsesratene konvergerte mellom behandlinger med 24 timer. En av de viktigste tingene å huske med denne prosedyren er at intestinale enteroid monolag er kortvarige. Så, når de er 90% confluid, bør etterforskerne se etter å bruke dem raskt.Denne teknikken har blitt vår go-to-modell for tidlig intestinal regenerering in vitro, spesielt hvis vi er interessert i mer mekanisk snarere enn inflammatorisk skade.

Research

JoVE Journal

Medicine

Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers

A Contusive Model of Unilateral Cervical Spinal Cord Injury Using the Infinite Horizon Impactor

En Contusive Modell av Unilateral Cervical ryggmargsskade Bruke Infinite Horizon impactor

While the majority of human spinal cord injuries occur in the cervical spinal cord, the vast majority of laboratory research employs animal models of ...

Murine Model of Wound Healing

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

An Alkali-burn Injury Model of Corneal Neovascularization in the Mouse

En Alkali-brenner Injury Modell av Corneal neovaskulariseringen i mus

Under normal conditions, the cornea is avascular, and this transparency is essential for maintaining good visual acuity. Neovascularization (NV) of the ...

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Murine Endoskopi for<em&gt; In Vivo</em&gt; Multimodal Imaging av Carcinogenesis og vurdering av Intestinal sårheling og Betennelse

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions ...

Development of an Algorithm to Perform a Comprehensive Study of Autonomic Dysreflexia in Animals with High Spinal Cord Injury Using a Telemetry Device

Utvikling av en algoritme for å utføre en omfattende studie av Autonom dysrefleksi i dyr med høy ryggmargsskade Ved hjelp av en Telemetri Device

Spinal cord injury (SCI) is a debilitating neurological condition characterized by somatic and autonomic dysfunctions. In particular, SCI above the ...

Murine Model of Intestinal Ischemia-reperfusion Injury

Murine modell av intestinal iskemi-reperfusjon Injury

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, ...

Open Tracheostomy Gastric Acid Aspiration Murine Model of Acute Lung Injury Results in Maximal Acute Nonlethal Lung Injury

Åpne trakeostomi magesyre aspire Murine modell av akutt lungeskade Resultater i Maximal Akutt-dødelige lungeskade

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

Forbedret metoden for etablering av en In Vitro blod - hjerne barrieren modell basert på svin hjernen endotelceller

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

I Vivo Evaluering av brudd Callus utvikling i bein Healing i mus bruker en MRI-kompatibel Osteosynthesis enhet for musen Femur

Endochondral fracture healing is a complex process involving the development of fibrous, cartilaginous, and osseous tissue in the fracture callus. The ...