Name: effect of hyaluronic acid 35 kda on an in vitro model of preterm small intestinal injury and healing using enteroid-derived monolayers
Uploaded: 2022-07-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers at JoVE.com

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Todos os procedimentos em animais neste estudo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Centro de Ciências da Saúde da Universidade de Oklahoma. Após aprovação institucional, amostras de conveniência fetal do intestino delgado de um primata não humano prematuro (PNH, gestação de 90%, babuíno-oliva, Papio anubis) foram obtidas após eutanásia para um estudo separado (Protocolo nº 101523-16-039-I)20.
1. Estabele...

<ol>
	<li>Lemons, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Very+low+birth+weight+outcomes+of+the+National+Institute+of+Child+Health+and+Human+Development+Neonatal+Research+Network,+January+1995+through+December+1996.">Very low birth weight outcomes of the National Institute of Child Health and Human Development Neonatal Research Network, January 1995 through December 1996.</a> Pediatrics. 107 (1), 1 (2001).</li><li>Burge, K., Vieira, F., Eckert, J., Chaaban, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+composition,+digestion,+and+absorption+differences+among+neonatal+feeding+strategies:+Potential+implications+for+intestinal+inflammation+in+preterm+infants.">Lipid composition, digestion, and absorption differences among neonatal feeding strategies: Potential implications for intestinal inflammation in preterm infants.</a> Nutrients. 13 (2), 550 (2021).</li><li>Duffy, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+mediating+bacterial+translocation+in+the+immature+intestine.">Interactions mediating bacterial translocation in the immature intestine.</a> The Journal of Nutrition. 130, 432-436 (2000).</li><li>Nanthakumar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+excessive+intestinal+inflammation+in+necrotizing+enterocolitis:+An+immature+innate+immune+response.">The mechanism of excessive intestinal inflammation in necrotizing enterocolitis: An immature innate immune response.</a> PLoS One. 6 (3), 17776 (2011).</li><li>Nanthakumar, N. N., Fusunyan, R. D., Sanderson, I., Walker, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+in+the+developing+human+intestine:+A+possible+pathophysiologic+contribution+to+necrotizing+enterocolitis.">Inflammation in the developing human intestine: A possible pathophysiologic contribution to necrotizing enterocolitis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 6043-6048 (2000).</li><li>He, Y., Lawlor, N. T., Newburg, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+milk+components+modulate+toll-like+receptor-mediated+inflammation.">Human milk components modulate toll-like receptor-mediated inflammation.</a> Advances in Nutrition. 7 (1), 102-111 (2016).</li><li>Walker, W. A., Iyengar, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+milk,+microbiota,+and+intestinal+immune+homeostasis.">Breast milk, microbiota, and intestinal immune homeostasis.</a> Pediatric Research. 77 (1-2), 220-228 (2015).</li><li>Westerbeek, E. A., vanden Berg, A., Lafeber, H. N., Fetter, W. P., van Elburg, R. 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P., Seth, R., Cole, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+immunoglobulin+for+preventing+necrotizing+enterocolitis+in+preterm+and+low+birth+weight+neonates.">Oral immunoglobulin for preventing necrotizing enterocolitis in preterm and low birth weight neonates.</a> The Cochrane Database of Systematic Reviews. 4 (4), (2016).</li><li>Maffei, D., Schanler, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+milk+is+the+feeding+strategy+to+prevent+necrotizing+enterocolitis.">Human milk is the feeding strategy to prevent necrotizing enterocolitis.</a> Seminars in Perinatology. 41 (1), 36-40 (2017).</li><li>Patel, A. L., Kim, J. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+milk+hyaluronan+enhances+innate+defense+of+the+intestinal+epithelium.">Human milk hyaluronan enhances innate defense of the intestinal epithelium.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (40), 29090-29104 (2013).</li><li>Burge, K., Bergner, E., Gunasekaran, A., Eckert, J., Chaaban, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+glycosaminoglycans+in+protection+from+neonatal+necrotizing+enterocolitis:+A+narrative+review.">The role of glycosaminoglycans in protection from neonatal necrotizing enterocolitis: A narrative review.</a> Nutrients. 12 (2), 546 (2020).</li><li>Chaaban, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acceleration+of+small+intestine+development+and+remodeling+of+the+microbiome+following+hyaluronan+35+kDa+treatment+in+neonatal+mice.">Acceleration of small intestine development and remodeling of the microbiome following hyaluronan 35 kDa treatment in neonatal mice.</a> Nutrients. 13 (6), 2030 (2021).</li><li>Gunasekaran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan+35+kDa+enhances+epithelial+barrier+function+and+protects+against+the+development+of+murine+necrotizing+enterocolitis.">Hyaluronan 35 kDa enhances epithelial barrier function and protects against the development of murine necrotizing enterocolitis.</a> Pediatric Research. 87 (7), 1177-1184 (2020).</li><li>Montenegro-Miranda, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+organoid+model+of+damage+and+repair+identifies+HNF4&#945;+as+a+critical+regulator+of+intestinal+epithelial+regeneration.">A novel organoid model of damage and repair identifies HNF4&#945; as a critical regulator of intestinal epithelial regeneration.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (2), 209-223 (2020).</li><li>Lee, C., Hong, S. N., Kim, E. R., Chang, D. K., Kim, Y. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+role+of+35+kilodalton+hyaluronan+in+promoting+defense+of+the+intestinal+epithelium.">Multifunctional role of 35 kilodalton hyaluronan in promoting defense of the intestinal epithelium.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 66 (4), 273-287 (2018).</li><li>Fraser, J. R. E., Laurent, T. C., Laurent, U. B. 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F., Ciorba, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonmicrobial+activation+of+TLRs+controls+intestinal+growth,+wound+repair,+and+radioprotection.">Nonmicrobial activation of TLRs controls intestinal growth, wound repair, and radioprotection.</a> Frontiers in Immunology. 11 (3591), 617510 (2021).</li><li>Riehl, T. E., Ee, X., Stenson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronic+acid+regulates+normal+intestinal+and+colonic+growth+in+mice.">Hyaluronic acid regulates normal intestinal and colonic growth in mice.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 303 (3), 377-388 (2012).</li><li>Riehl, T. E., Santhanam, S., Foster, L., Ciorba, M., Stenson, W. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+intestinal+epithelial+wound+healing+through+protease-activated+receptor-2+activation+in+Caco2+cells.">Inhibition of intestinal epithelial wound healing through protease-activated receptor-2 activation in Caco2 cells.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 367 (2), 382-392 (2018).</li><li>Nyegaard, S., Christensen, B., Rasmussen, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+accurate+quantification+of+cell+migration+using+human+small+intestine+cells.">An optimized method for accurate quantification of cell migration using human small intestine cells.</a> Metabolic Engineering Communications. 3, 76-83 (2016).</li><li>Roodsant, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+2D+primary+organoid-derived+epithelial+monolayer+model+to+study+host-pathogen+interaction+in+the+small+intestine.">A human 2D primary organoid-derived epithelial monolayer model to study host-pathogen interaction in the small intestine.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 272 (2020).</li><li>Singh, A., Poling, H. M., Spence, J. R., Wells, J. M., Helmrath, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+organoids:+a+next-generation+tool+for+modeling+human+development.">Gastrointestinal organoids: a next-generation tool for modeling human development.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 319 (3), 375-381 (2020).</li><li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids+as+an+ex-vivo+model+of+host-pathogen+interactions+in+the+gastrointestinal+tract.">Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract.</a> Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1124-1134 (2014).</li><li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids+as+a+model+of+upper+small+intestinal+ion+transport+physiology+and+pathophysiology.">Human enteroids as a model of upper small intestinal ion transport physiology and pathophysiology.</a> Gastroenterology. 150 (3), 638-649 (2016).</li></ol>

O trato gastrointestinal de um prematuro está sob pressão regenerativa contínua de exposições repetidas a insultos ambientais associados à disbiose, metabólitos e toxinas bacterianas inflamatórias e hipóxia intermitente23,24. Infelizmente, o epitélio intestinal do prematuro é incapaz de estabelecer rapidamente a integridade funcional23, resultando em disfunção de barreira, aumento da permeabilidade intestinal e, em casos grave...

A enterocolite necrosante (NEC) é uma das emergências gastrointestinais mais comuns em prematuros1. A doença é caracterizada por inflamação intestinal grave que pode se deteriorar rapidamente para necrose intestinal, sepse e potencialmente morte. Embora a etiologia não seja clara, as evidências sugerem que a NEC é multifatorial e o resultado de uma complexa interação de alimentação, colonização bacteriana anormal e epitélio intestinal imaturo 2,3. Prematuros apresentam aumento da permeabilidade intestinal, colonização bacteriana anormal e baixa capacidade regenerativa de enterócitos4,5, aumentando o risco de disfunção da barreira intestinal, translocação bacteriana e desenvolvimento de NEC. Portanto, identificar estratégias ou intervenções para acelerar a maturação epitelial intestinal e promover a regeneração ou cicatrização do epitélio intestinal é fundamental na prevenção dessa doença mortal.
Estudos têm demonstrado que o leite humano (HM) é protetor contra a NEC em prematuros 6,7,8,9,10,11. Estudos em humanos e animais mostraram que a fórmula à base de bovinos aumenta a permeabilidade intestinal e é diretamente tóxica para as células epiteliais intestinais 2,12. Embora não totalmente elucidada, as evidências sugerem que os efeitos protetores da HM são mediados por componentes bioativos, como lactoferrina, imunoglobulina A (IgA) e oligossacarídeos HM13. O HM também é rico em hialuronano (AH), um glicosaminoglicano exclusivamente não sulfatado com repetição de ácido D-glucurônico e dissacarídeos N-acetil-D-glucosamina14,15. É importante ressaltar que mostramos que o 35 kDa HA oral (HA35), um HM HA mímica, atenua a gravidade da lesão intestinal, previne a translocação bacteriana e diminui a mortalidade em um modelo de lesão intestinal murina semelhante ao NEC16,17. 
Aqui, os efeitos do HA35 na cicatrização e regeneração intestinal in vitro são investigados mais adiante. Atualmente, o ensaio in vitro mais utilizado para feridas intestinais e reparo é um ensaio de arranhão realizado em monocamadas celulares de câncer colorretal (CCR). A relevância fisiológica de tal modelo para o intestino infantil prematuro é limitada, uma vez que o reparo de feridas de células CRC depende fortemente da natureza altamente proliferativa das células cancerígenas, em vez de processos de reparo orientados por células-tronco18. Para superar essa limitação, o estabelecimento de um modelo de arranhão enteróide 2D, incluindo o procedimento de isolamento e manutenção de enteroides intestinais delgados derivados de células-tronco primárias de primatas não humanos (PNH) prematuros, é descrito aqui. Dado que a NEC pré-termo é mais frequentemente relatada no intestino delgado distal, o uso de organoides primários de células epiteliais em um modelo de dano e reparo intestinal fornece um modelo in vitro mais fisiologicamente traduzível em comparação com os modelos existentes que utilizam monocamadas colorretais tradicionais18,19.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-675-49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x21mm Dish, Nunclon Delta</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>172931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well, TC-Treated, Flat Bottom Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#181;M Reversible Cell Strainer</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>27215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Sterile Cell Strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin, Bovine (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium/Nutrient Ham&#39;s Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>36254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>100-0485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte S3 Live-Cell Analysis Instrument</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>4647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte Scratch Wound Analysis Software Module</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>9600-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>06010</td>
			<td>This is HOGMY, but without the Y-27632 or antibiotics. Also used as base for HOGM, but then only missing the antibiotics.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L3012-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>136101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate-Buffered Saline), 1X [-] Calcium, Magnesium, pH 7.4</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>This is broad-spectrum antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hyaluronate, Research Grade, HA20K</td>
			<td>Lifecore Biomedical</td>
			<td>HA20K-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20 Automated Cell Counter</td>
			<td>Company: Bio-Rad</td>
			<td>1450102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 1X, 0.25% Trypsin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT25053CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72302</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effect of hyaluronic acid 35 kda on an in vitro model of preterm small intestinal injury and healing using enteroid-derived monolayers

Ensaios de feridas de arranhões in vitro são comumente usados para investigar os mecanismos e características da cicatrização epitelial em uma variedade de tipos de tecidos. Aqui, descrevemos um protocolo para gerar uma monocamada bidimensional (2D) a partir de enteroides de primatas não humanos tridimensionais (3D) derivados de criptas intestinais do íleo terminal. Essas monocamadas derivadas de enteroides foram então utilizadas em um ensaio de arranhão in vitro para testar a capacidade do hialuronano 35 kDa (HA35), um HA de leite humano, para promover a migração e proliferação celular ao longo da borda da ferida epitelial. Após o cultivo das monocamadas até a confluência, elas foram raspadas manualmente e tratadas com HA35 (50 μg/mL, 100 μg/mL, 200 μg/mL) ou controle (PBS). A migração celular e a proliferação para a lacuna foram fotografadas usando um microscópio de luz transmitida equipado para imagens de células vivas. O fechamento da ferida foi quantificado como porcentagem de cicatrização de feridas usando o Wound Healing Size Plugin no ImageJ. A área de arranhão e a taxa de migração celular e a porcentagem de fechamento da ferida foram medidas ao longo de 24 h. O HA35 in vitro acelera a cicatrização de feridas em monocamadas enteroides do intestino delgado, provavelmente através de uma combinação de proliferação celular na borda da ferida e migração para a área da ferida. Esses métodos podem potencialmente ser usados como um modelo para explorar a regeneração intestinal no intestino delgado humano prematuro.

Os efeitos do AH no reparo tecidual e cicatrização de feridas em vários tecidos e órgãos estão bem documentados; no entanto, os efeitos específicos do AH com um peso molecular de 35 kDa na cicatrização e regeneração do intestino delgado fetal ou neonatal são atualmente desconhecidos. Para testar a capacidade do HA35 de promover a cicatrização de feridas em um modelo do intestino delgado fetal ou neonatal, geramos enteroides intestinais 3D a partir do tecido ileal NHP e dissociamos ainda mais esse tecido em ...

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Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers

Este protocolo descreve um método para estabelecer e executar um ensaio de arranhão em monocamadas bidimensionais (2D) derivadas de enteróides tridimensionais (3D) isolados de íleo de primatas não humanos.

Efeito do ácido hialurônico 35 kDa em um modelo in vitro de lesão e cicatrização do intestino delgado prematuro usando monocamadas derivadas de enteróides

In vitro scratch wound assays are commonly used to investigate the mechanisms and characteristics of epithelial healing in a variety of tissue types. ...

Este protocolo estende o ensaio de ferida de arranhão muito comum usado para estudos de regeneração com monocamadas derivadas de enteróides representando todos os principais tipos de células do intestino delgado. Esta técnica permite a visualização em tempo real do fechamento da ferida em um modelo de monocamada enteróide 2D pré-termo de regeneração intestinal. Nossa técnica pode ser aplicada ao estudo do intestino de mamíferos prematuros, que normalmente é mal modelado usando linhas celulares de câncer colorretal transformadas.Comece descongelando 96 microlitros de matriz extracelular, ou hidrogel BME à base de ECM, durante a noite no gelo a dois a oito graus Celsius. Diluir o hidrogel à base de ECM e o PBS gelado sem cálcio ou magnésio numa proporção de um para 50. Revestir cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços com 200 microlitros de hidrogel à base de ECM diluído a frio e incubar a placa revestida por um mínimo de uma hora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.Em seguida, aspirar o meio da placa de cultura de 24 poços contendo os enteróides 3D destinados a monocamadas e substituí-lo por 500 microlitros de reagente de dissociação celular por poço. Interrompa manualmente as cúpulas de hidrogel à base de ECM pipetando para cima e para baixo de oito a 12 vezes e transferindo o conteúdo de 12 poços para um tubo cônico de 15 mililitros. Lave os 12 poços vazios com 250 microlitros de reagente de dissociação celular para garantir que todos os enteróides tenham sido removidos e transfira o conteúdo para tubos cônicos de 15 mililitros.Centrifugar os tubos cônicos a 300g por cinco minutos a quatro graus Celsius e descartar o sobrenadante. Adicione 10 mililitros de tampão de lavagem DMEM/F-12 gelado aos tubos cônicos e suspenda os pellets enteróides invertendo os tubos. Centrifugar a 300g durante cinco minutos a quatro graus Celsius e remover o sobrenadante.Ressuscite os pellets de células em 12 mililitros de 37 graus Celsius Tripsina-EDTA e coloque os tubos em banho-maria de 37 graus Celsius por 10 minutos ou até que as células pareçam solúveis. Adicione três mililitros de tampão de lavagem DMEM/F-12 a cada tubo para diluir a tripsina-EDTA. Misture invertendo os tubos e coloque no gelo.Filtre os enteróides dissociados através de um filtro de células de malha de 37 micrômetros. Recolha o conteúdo em tubos cónicos limpos de 15 mililitros e centrifugar os tubos a 300g durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Remova o sobrenadante dos tubos cônicos e ressuspenda os pellets celulares com seis mililitros de HOMGY.Em seguida, remova a placa revestida de hidrogel à base de ECM da incubadora e aspirar qualquer solução de hidrogel à base de ECM em excesso sem arranhar a superfície revestida ou secar completamente a placa. Adicione 500 microlitros da suspensão combinada de células HOMGY de 12 mililitros em cada poço da placa de 24 poços revestida com hidrogel à base de ECM. Gire a placa com a tampa para garantir uma distribuição uniforme das células dentro dos poços.Incubar a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, trocando o meio HOMGY a cada dois dias até que as monocamadas atinjam uma confluência superior a 90%. Uma vez que as monocamadas atinjam mais de 90% de confluência, aspirar o meio para remover quaisquer células que não se liguem. Trate as células com 500 microlitros de HA35 ou PBS dissolvidos em HOMGY por 24 horas.Depois disso, remova a mídia sem interromper a superfície da monocamada. Usando uma ponta de pipeta de 200 microlitros, faça um arranhão linear em todo o diâmetro da superfície da monocamada em cada poço, tomando cuidado para não deixar as monocamadas secarem. Lave as monocamadas riscadas uma vez com 500 microlitros de 1X PBS e adicione 500 microlitros de HA35 ou PBS dissolvidos em HOMGY.Transfira a placa para o instrumento de análise de células vivas dentro de uma incubadora de 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No ícone Agendar no software de análise de células ativas, clique no ícone Iniciar Assistente para Adicionar Nova Embarcação. Selecione Fazer varredura no cronograma e clique em Avançar.Selecione Novo em Criar vaso e clique em Avançar, selecione Poço inteiro em Tipo de varredura e clique em Avançar. Escolha Fase para canais de imagem e 4x para o objetivo. Selecione o fabricante da placa e o número de catálogo na lista fornecida e clique em Avançar.Selecione um local de recipiente vazio seguido pelo padrão de varredura desejado. Insira o nome da placa em Nome e selecione mais para criar um layout de placa. Selecione pequeno mais para criar um nome de tratamento.Digite o nome abreviado e, em seguida, OK. Destaque os poços de placa correspondentes a esse tratamento e acerte grande vantagem para designar poços com esse tratamento. Insira a concentração composta e clique em OK. Quando a placa estiver concluída, selecione OK, Avançar. Selecione Adiar análise para mais tarde, seguido de Criar nova agenda com varreduras em intervalos de quatro horas.Pare a varredura em um dia, zero horas. Verifique se o resumo está correto e, em seguida, adicione à programação. No software de análise de células ao vivo, selecione Exibir na parte superior da tela.No menu Nome da embarcação, navegue até a verificação concluída de 24 horas e clique duas vezes no nome da embarcação. Selecione o ícone Exportar imagens e filmes à esquerda, seguido pela opção Como exibido. Realce os poços de interesse e, em seguida, selecione os pontos de interesse de tempo e a Série de Imagens como Exibidos.Verifique se o tipo de sequência e as varreduras estão corretos. Selecione o local da pasta de destino desejada. Escolha JPEG no menu suspenso e, em seguida, Exportar.Abra o software ImageJ e carregue a imagem do ensaio de arranhões. Selecione Imagem e digite 8 bits para alterar a imagem de RGB de 24 bits. Selecione Plugins, Macros, Install, Wound_healing_size plugin para instalar o Wound Healing Size Plugin.Depois disso, defina o raio da janela de variância como 20, o valor limite como 100, a porcentagem de pixels saturados como 0,001. Sim para Definir escala global e, em seguida, clique em OK. Verifique se a área delineada é a área da ferida e repita para riscos adicionais. Finalmente, calcule a porcentagem da cicatrização de feridas na área de arranhões de células migratórias ou proliferantes ao longo de 24 horas usando a equação mostrada na tela.Aqui, T0 é a área no tempo zero horas, e TC é a área em zero horas, quatro horas, 12 horas ou 24 horas. A geração enteróide e o procedimento de ensaio de cicatrização de feridas monocamada derivado de enteroides são mostrados nestas imagens. Uma cultura de enteroides intestinais tridimensionais de primatas não humanos é usada para dissociar em monocamadas bidimensionais.As monocamadas foram cultivadas a uma confluência superior a 90% em uma placa de 24 poços e, em seguida, tratadas com HA35 ou PBS por 24 horas. As monocamadas foram então riscadas com uma ponta de pipeta P200. Aqui são mostradas as imagens representativas do HA35 em tratamentos de controle de monocamadas enteroides de primatas não humanos.As imagens foram obtidas às zero horas, quatro horas, 12 horas e 24 horas após a realização de um arranhão com ponta de pipeta P200. O efeito do HA35 nas monocamadas andoides de cicatrização de feridas é mostrado aqui. A mudança na cicatrização de feridas ao longo do tempo em monocamadas enteróides depende da concentração de tratamento com HA35.O HA35 aumentou significativamente a cicatrização de feridas após quatro horas e 12 horas a 100 microgramas por mililitro e 200 microgramas por mililitro quando comparado ao controle, mas as taxas de cicatrização convergiram entre os tratamentos em 24 horas. Uma das coisas mais importantes a lembrar com este procedimento é que as monocamadas enteróides intestinais são de curta duração. Então, uma vez que eles são 90% confluidos, os investigadores devem procurar usá-los rapidamente.Esta técnica tornou-se o nosso modelo para a regeneração intestinal prematura in vitro, especialmente se estivermos interessados em mais lesões mecânicas do que inflamatórias.

Research

JoVE Journal

Medicine

Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers

A Contusive Model of Unilateral Cervical Spinal Cord Injury Using the Infinite Horizon Impactor

Um Modelo contundente de lesão da medula espinhal cervical unilateral Usando o Impactor horizonte infinito

While the majority of human spinal cord injuries occur in the cervical spinal cord, the vast majority of laboratory research employs animal models of ...

Medicina

Murine Model of Wound Healing

Modelo Murino de Cicatrização

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

An Alkali-burn Injury Model of Corneal Neovascularization in the Mouse

Um ferimento Modelo Alkali queima de córnea neovascularização no Rato

Under normal conditions, the cornea is avascular, and this transparency is essential for maintaining good visual acuity. Neovascularization (NV) of the ...

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Murino Endoscopia para<em&gt; In Vivo</em&gt; Cura Multimodal imagem de Carcinogênese e Avaliação de Intestinal ferida e inflamação

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions ...

Development of an Algorithm to Perform a Comprehensive Study of Autonomic Dysreflexia in Animals with High Spinal Cord Injury Using a Telemetry Device

Desenvolvimento de um algoritmo para realizar um estudo abrangente de Disreflexia Autonômica em animais com alta Spinal Cord Injury Usando um dispositivo de telemetria

Spinal cord injury (SCI) is a debilitating neurological condition characterized by somatic and autonomic dysfunctions. In particular, SCI above the ...

Murine Model of Intestinal Ischemia-reperfusion Injury

Modelo murino de isquemia-reperfusão

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, ...

Open Tracheostomy Gastric Acid Aspiration Murine Model of Acute Lung Injury Results in Maximal Acute Nonlethal Lung Injury

Abrir traqueostomia ácido gástrico aspiração Modelo murino de lesão pulmonar aguda Resultados em Maximal aguda não-letal Lung Injury

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

Melhor método para o estabelecimento de uma In Vitro barreira hemato - encefálica modelo baseado em células endoteliais do cérebro de suínos

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

Na Vivo Avaliação do desenvolvimento de calo de fratura durante a consolidação óssea em ratos usando um dispositivo de osteossíntese compatível com MRI para o fêmur de Mouse

Endochondral fracture healing is a complex process involving the development of fibrous, cartilaginous, and osseous tissue in the fracture callus. The ...