Name: effect of hyaluronic acid 35 kda on an in vitro model of preterm small intestinal injury and healing using enteroid-derived monolayers
Uploaded: 2022-07-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers at JoVE.com

Этот контент является исключительной ответственностью авторов и не обязательно представляет официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения. HC поддерживается грантом P20GM134973 от Национальных институтов здравоохранения. KB поддерживается грантом Фонда детских больниц (CHF) и Фонда пресвитерианского здравоохранения (PHF). Услуги визуализации живых клеток, предоставляемые ядром функциональной геномики рака, были частично поддержаны грантом Национального института общих медицинских наук P20GM103639 и грантом Национального института рака P30CA225520 Национальных институтов здравоохранения, присужденным Онкологическому центру Стивенсона Университета Оклахомы.

Все процедуры для животных в этом исследовании были одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Центра медицинских наук Университета Оклахомы. После институционального одобрения после эвтаназии были получены образцы тонкой кишки плода от недоношенного ?...

<ol>
	<li>Lemons, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Very+low+birth+weight+outcomes+of+the+National+Institute+of+Child+Health+and+Human+Development+Neonatal+Research+Network,+January+1995+through+December+1996.">Very low birth weight outcomes of the National Institute of Child Health and Human Development Neonatal Research Network, January 1995 through December 1996.</a> Pediatrics. 107 (1), 1 (2001).</li><li>Burge, K., Vieira, F., Eckert, J., Chaaban, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+composition,+digestion,+and+absorption+differences+among+neonatal+feeding+strategies:+Potential+implications+for+intestinal+inflammation+in+preterm+infants.">Lipid composition, digestion, and absorption differences among neonatal feeding strategies: Potential implications for intestinal inflammation in preterm infants.</a> Nutrients. 13 (2), 550 (2021).</li><li>Duffy, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+mediating+bacterial+translocation+in+the+immature+intestine.">Interactions mediating bacterial translocation in the immature intestine.</a> The Journal of Nutrition. 130, 432-436 (2000).</li><li>Nanthakumar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+excessive+intestinal+inflammation+in+necrotizing+enterocolitis:+An+immature+innate+immune+response.">The mechanism of excessive intestinal inflammation in necrotizing enterocolitis: An immature innate immune response.</a> PLoS One. 6 (3), 17776 (2011).</li><li>Nanthakumar, N. N., Fusunyan, R. D., Sanderson, I., Walker, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+in+the+developing+human+intestine:+A+possible+pathophysiologic+contribution+to+necrotizing+enterocolitis.">Inflammation in the developing human intestine: A possible pathophysiologic contribution to necrotizing enterocolitis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 6043-6048 (2000).</li><li>He, Y., Lawlor, N. T., Newburg, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+milk+components+modulate+toll-like+receptor-mediated+inflammation.">Human milk components modulate toll-like receptor-mediated inflammation.</a> Advances in Nutrition. 7 (1), 102-111 (2016).</li><li>Walker, W. A., Iyengar, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+milk,+microbiota,+and+intestinal+immune+homeostasis.">Breast milk, microbiota, and intestinal immune homeostasis.</a> Pediatric Research. 77 (1-2), 220-228 (2015).</li><li>Westerbeek, E. A., vanden Berg, A., Lafeber, H. N., Fetter, W. P., van Elburg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+enteral+supplementation+of+a+prebiotic+mixture+of+non-human+milk+galacto-,+fructo-+and+acidic+oligosaccharides+on+intestinal+permeability+in+preterm+infants.">The effect of enteral supplementation of a prebiotic mixture of non-human milk galacto-, fructo- and acidic oligosaccharides on intestinal permeability in preterm infants.</a> British Journal of Nutrition. 105 (2), 268-274 (2011).</li><li>vanden Berg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+glutamine-enriched+enteral+nutrition+on+intestinal+permeability+in+very-low-birth-weight+infants:+A+randomized+controlled+trial.">The effect of glutamine-enriched enteral nutrition on intestinal permeability in very-low-birth-weight infants: A randomized controlled trial.</a> Journal of Parenteral and Enteral Nutrition. 30 (5), 408-414 (2006).</li><li>Foster, J. P., Seth, R., Cole, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+immunoglobulin+for+preventing+necrotizing+enterocolitis+in+preterm+and+low+birth+weight+neonates.">Oral immunoglobulin for preventing necrotizing enterocolitis in preterm and low birth weight neonates.</a> The Cochrane Database of Systematic Reviews. 4 (4), (2016).</li><li>Maffei, D., Schanler, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+milk+is+the+feeding+strategy+to+prevent+necrotizing+enterocolitis.">Human milk is the feeding strategy to prevent necrotizing enterocolitis.</a> Seminars in Perinatology. 41 (1), 36-40 (2017).</li><li>Patel, A. L., Kim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+milk+and+necrotizing+enterocolitis.">Human milk and necrotizing enterocolitis.</a> Seminars in Pediatric Surgery. 27 (1), 34-38 (2018).</li><li>Nolan, L. S., Parks, O. B., Good, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+immunomodulating+components+of+maternal+breast+milk+and+protection+against+necrotizing+enterocolitis.">A review of the immunomodulating components of maternal breast milk and protection against necrotizing enterocolitis.</a> Nutrients. 12 (1), 14 (2019).</li><li>Hill, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+milk+hyaluronan+enhances+innate+defense+of+the+intestinal+epithelium.">Human milk hyaluronan enhances innate defense of the intestinal epithelium.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (40), 29090-29104 (2013).</li><li>Burge, K., Bergner, E., Gunasekaran, A., Eckert, J., Chaaban, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+glycosaminoglycans+in+protection+from+neonatal+necrotizing+enterocolitis:+A+narrative+review.">The role of glycosaminoglycans in protection from neonatal necrotizing enterocolitis: A narrative review.</a> Nutrients. 12 (2), 546 (2020).</li><li>Chaaban, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acceleration+of+small+intestine+development+and+remodeling+of+the+microbiome+following+hyaluronan+35+kDa+treatment+in+neonatal+mice.">Acceleration of small intestine development and remodeling of the microbiome following hyaluronan 35 kDa treatment in neonatal mice.</a> Nutrients. 13 (6), 2030 (2021).</li><li>Gunasekaran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan+35+kDa+enhances+epithelial+barrier+function+and+protects+against+the+development+of+murine+necrotizing+enterocolitis.">Hyaluronan 35 kDa enhances epithelial barrier function and protects against the development of murine necrotizing enterocolitis.</a> Pediatric Research. 87 (7), 1177-1184 (2020).</li><li>Montenegro-Miranda, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+organoid+model+of+damage+and+repair+identifies+HNF4&#945;+as+a+critical+regulator+of+intestinal+epithelial+regeneration.">A novel organoid model of damage and repair identifies HNF4&#945; as a critical regulator of intestinal epithelial regeneration.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (2), 209-223 (2020).</li><li>Lee, C., Hong, S. N., Kim, E. R., Chang, D. K., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+regeneration+ability+of+Crohn's+disease+assessed+using+patient-derived+intestinal+organoids.">Epithelial regeneration ability of Crohn's disease assessed using patient-derived intestinal organoids.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 6013 (2021).</li><li>Gurung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+Zika+virus+(ZIKV)+infection+following+vaginal+inoculation+with+ZIKV-infected+semen+in+timed-pregnant+olive+baboons.">Maternal Zika virus (ZIKV) infection following vaginal inoculation with ZIKV-infected semen in timed-pregnant olive baboons.</a> Journal of Virology. 94 (11), 00058 (2020).</li><li>Suarez-Arnedo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+image+J+plugin+for+the+high+throughput+image+analysis+of+in+vitro+scratch+wound+healing+assays.">An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays.</a> PLoS One. 15 (7), 0232565 (2020).</li><li>Kobelt, D., Walther, W., Stein, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+cell+migration+monitoring+to+analyze+drug+synergism+in+the+scratch+assay+using+the+IncuCyte+system.">Real-time cell migration monitoring to analyze drug synergism in the scratch assay using the IncuCyte system.</a> Methods in Molecular Biology. 2294, 133-142 (2021).</li><li>de Jong, J. C. W., Ijssennagger, N., van Mil, S. W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+milk+nutrients+driving+intestinal+epithelial+layer+maturation+via+Wnt+and+Notch+signaling:+Implications+for+necrotizing+enterocolitis.">Breast milk nutrients driving intestinal epithelial layer maturation via Wnt and Notch signaling: Implications for necrotizing enterocolitis.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1867 (11), 166229 (2021).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietin+protects+epithelial+cells+from+excessive+autophagy+and+apoptosis+in+experimental+neonatal+necrotizing+enterocolitis.">Erythropoietin protects epithelial cells from excessive autophagy and apoptosis in experimental neonatal necrotizing enterocolitis.</a> PLoS One. 8 (7), 69620 (2013).</li><li>Kessler, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+role+of+35+kilodalton+hyaluronan+in+promoting+defense+of+the+intestinal+epithelium.">Multifunctional role of 35 kilodalton hyaluronan in promoting defense of the intestinal epithelium.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 66 (4), 273-287 (2018).</li><li>Fraser, J. R. E., Laurent, T. C., Laurent, U. B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan:+Its+nature,+distribution,+functions+and+turnover.">Hyaluronan: Its nature, distribution, functions and turnover.</a> Journal of Internal Medicine. 242 (1), 27-33 (1997).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan+35kDa+treatment+protects+mice+from+Citrobacter+rodentium+infection+and+induces+epithelial+tight+junction+protein+ZO-1+in+vivo.">Hyaluronan 35kDa treatment protects mice from Citrobacter rodentium infection and induces epithelial tight junction protein ZO-1 in vivo.</a> Matrix Biology. 62, 28-39 (2017).</li><li>Prehm, P., Schumacher, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+hyaluronan+export+from+human+fibroblasts+by+inhibitors+of+multidrug+resistance+transporters.">Inhibition of hyaluronan export from human fibroblasts by inhibitors of multidrug resistance transporters.</a> Biochemical Pharmacology. 68 (7), 1401-1410 (2004).</li><li>Stenson, W. F., Ciorba, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonmicrobial+activation+of+TLRs+controls+intestinal+growth,+wound+repair,+and+radioprotection.">Nonmicrobial activation of TLRs controls intestinal growth, wound repair, and radioprotection.</a> Frontiers in Immunology. 11 (3591), 617510 (2021).</li><li>Riehl, T. E., Ee, X., Stenson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronic+acid+regulates+normal+intestinal+and+colonic+growth+in+mice.">Hyaluronic acid regulates normal intestinal and colonic growth in mice.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 303 (3), 377-388 (2012).</li><li>Riehl, T. E., Santhanam, S., Foster, L., Ciorba, M., Stenson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44+and+TLR4+mediate+hyaluronic+acid+regulation+of+Lgr5++stem+cell+proliferation,+crypt+fission,+and+intestinal+growth+in+postnatal+and+adult+mice.">CD44 and TLR4 mediate hyaluronic acid regulation of Lgr5+ stem cell proliferation, crypt fission, and intestinal growth in postnatal and adult mice.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309 (11), 874-887 (2015).</li><li>Hill, D. R., Kessler, S. P., Rho, H. K., Cowman, M. K., de la Motte, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific-sized+hyaluronan+fragments+promote+expression+of+human+beta-defensin+2+in+intestinal+epithelium.">Specific-sized hyaluronan fragments promote expression of human beta-defensin 2 in intestinal epithelium.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (36), 30610-30624 (2012).</li><li>Fernando, E. H., Gordon, M. H., Beck, P. L., MacNaughton, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+intestinal+epithelial+wound+healing+through+protease-activated+receptor-2+activation+in+Caco2+cells.">Inhibition of intestinal epithelial wound healing through protease-activated receptor-2 activation in Caco2 cells.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 367 (2), 382-392 (2018).</li><li>Nyegaard, S., Christensen, B., Rasmussen, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+accurate+quantification+of+cell+migration+using+human+small+intestine+cells.">An optimized method for accurate quantification of cell migration using human small intestine cells.</a> Metabolic Engineering Communications. 3, 76-83 (2016).</li><li>Roodsant, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+2D+primary+organoid-derived+epithelial+monolayer+model+to+study+host-pathogen+interaction+in+the+small+intestine.">A human 2D primary organoid-derived epithelial monolayer model to study host-pathogen interaction in the small intestine.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 272 (2020).</li><li>Singh, A., Poling, H. M., Spence, J. R., Wells, J. M., Helmrath, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+organoids:+a+next-generation+tool+for+modeling+human+development.">Gastrointestinal organoids: a next-generation tool for modeling human development.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 319 (3), 375-381 (2020).</li><li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids+as+an+ex-vivo+model+of+host-pathogen+interactions+in+the+gastrointestinal+tract.">Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract.</a> Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1124-1134 (2014).</li><li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids+as+a+model+of+upper+small+intestinal+ion+transport+physiology+and+pathophysiology.">Human enteroids as a model of upper small intestinal ion transport physiology and pathophysiology.</a> Gastroenterology. 150 (3), 638-649 (2016).</li></ol>

Желудочно-кишечный тракт недоношенного ребенка находится под постоянным регенеративным давлением от повторного воздействия экологических оскорблений, связанных с дисбактериозом, воспалительными бактериальными метаболитами и токсинами и прерывистой гипоксией23,24</sup...

Некротизирующий энтероколит (НЭК) является одним из наиболее распространенных желудочно-кишечных чрезвычайных ситуаций у недоношенных детей1. Заболевание характеризуется сильным воспалением кишечника, которое может быстро ухудшиться до некроза кишечника, сепсиса и потенциально смерти. Хотя этиология неясна, данные свидетельствуют о том, что NEC является многофакторным и результатом сложного взаимодействия кормления, аномальной бактериальной колонизации и незрелого кишечного эпителия 2,3. Недоношенные дети имеют повышенную проницаемость кишечника, аномальную бактериальную колонизацию и низкую регенеративную способность энтероцитов 4,5, что увеличивает риск дисфункции кишечного барьера, бактериальной транслокации и развития NEC. Поэтому определение стратегий или вмешательств для ускорения созревания эпителия кишечника и содействия регенерации или заживлению кишечного эпителия имеет решающее значение для предотвращения этого смертельного заболевания.
Исследования показали, что грудное молоко (ГМ) защищает от НЭК у недоношенных детей 6,7,8,9,10,11. Исследования на людях и животных показали, что формула на основе крупного рогатого скота увеличивает проницаемость кишечника и напрямую токсична для эпителиальных клеток кишечника 2,12. Хотя они не полностью выяснены, данные свидетельствуют о том, что защитные эффекты HM опосредованы биологически активными компонентами, такими как лактоферрин, иммуноглобулин A (IgA) и олигосахариды HM13. HM также богат гиалуронаном (HA), уникальным несульфатированным гликозаминогликаном с повторяющейся D-глюкуроновой кислотой и N-ацетил-D-глюкозаминовыми дисахаридами14,15. Важно отметить, что мы показали, что пероральный прием 35 кДа ГК (HA35), имитирующий HM HA, ослабляет тяжесть повреждения кишечника, предотвращает бактериальную транслокацию и снижает смертность в мышиной NEC-подобной модели кишечного повреждения16,17.
Здесь дополнительно исследуется влияние HA35 на заживление и регенерацию кишечника in vitro. В настоящее время наиболее широко используемым анализом in vitro для ранирования и восстановления кишечника является анализ царапины на ране, выполняемый в монослоях клеток колоректального рака (CRC). Физиологическая значимость такой модели для кишечника недоношенных детей ограничена, поскольку восстановление ран CRC-клеток в значительной степени зависит от высокопролиферативной природы раковых клеток, а не от процессов восстановления, управляемых стволовыми клетками18. Чтобы преодолеть это ограничение, здесь описано создание 2D-модели энтероидной царапины раны, включая процедуру выделения и поддержания первичных энтероидов тонкой кишки, полученных из стволовых клеток, от недоношенных нечеловеческих приматов (NHP). Учитывая, что преждевременный НЭК чаще всего сообщается в дистальной тонкой кишке, использование первичных органоидов эпителиальных клеток в модели повреждения и восстановления кишечника обеспечивает более физиологически переводимую модель in vitro по сравнению с существующими моделями, использующими традиционные колоректальные монослои18,19.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-675-49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x21mm Dish, Nunclon Delta</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>172931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well, TC-Treated, Flat Bottom Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#181;M Reversible Cell Strainer</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>27215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Sterile Cell Strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin, Bovine (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium/Nutrient Ham&#39;s Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>36254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>100-0485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte S3 Live-Cell Analysis Instrument</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>4647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte Scratch Wound Analysis Software Module</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>9600-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>06010</td>
			<td>This is HOGMY, but without the Y-27632 or antibiotics. Also used as base for HOGM, but then only missing the antibiotics.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L3012-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>136101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate-Buffered Saline), 1X [-] Calcium, Magnesium, pH 7.4</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>This is broad-spectrum antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hyaluronate, Research Grade, HA20K</td>
			<td>Lifecore Biomedical</td>
			<td>HA20K-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20 Automated Cell Counter</td>
			<td>Company: Bio-Rad</td>
			<td>1450102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 1X, 0.25% Trypsin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT25053CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72302</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effect of hyaluronic acid 35 kda on an in vitro model of preterm small intestinal injury and healing using enteroid-derived monolayers

Анализы раны с царапинами in vitro обычно используются для изучения механизмов и характеристик заживления эпителия в различных типах тканей. Здесь мы описываем протокол для генерации двумерного (2D) монослоя из трехмерных (3D) энтероидов нечеловеческих приматов, полученных из кишечных крипт терминальной подвздошной кишки. Эти монослои, полученные из энтероидов, затем использовались в анализе in vitro для проверки способности гиалуроновой кислоты 35 кДа (HA35), имитации ГК грудного молока, способствовать миграции и пролиферации клеток вдоль края эпителиальной раны. После того, как монослои были выращены до слияния, их вручную царапали и обрабатывали HA35 (50 мкг/мл, 100 мкг/мл, 200 мкг/мл) или контрольным (PBS). Миграция и пролиферация клеток в щель были визуализированы с помощью микроскопа с передаваемым светом, оборудованного для визуализации живых клеток. Закрытие раны было количественно определено как процент заживления ран с помощью плагина Wound Healing Size Plugin в ImageJ. Площадь царапин и скорость миграции клеток и процент закрытия раны были измерены в течение 24 ч. HA35 in vitro ускоряет заживление ран в тонкокишечных энтероидных монослоях, вероятно, за счет комбинации пролиферации клеток на краю раны и миграции в раневую область. Эти методы потенциально могут быть использованы в качестве модели для изучения кишечной регенерации в недоношенном тонком кишечнике человека.

Влияние ГК на восстановление тканей и заживление ран в различных тканях и органах хорошо документировано; однако специфические эффекты ГК с молекулярной массой 35 кДа на заживление и регенерацию тонкой кишки плода или новорожденного в настоящее время неизвестны. Чтобы проверить спосо?...

Watch this Scientific Journal Video about Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers at JoVE.com

Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers

Этот протокол описывает метод установления и выполнения анализа раны царапин на двумерных (2D) монослоях, полученных из трехмерных (3D) энтероидов, выделенных из подвздошной кишки приматов нечеловеческих.

Влияние гиалуроновой кислоты 35 кДа на модель in vitro преждевременного повреждения тонкой кишки и заживления с использованием монослоев энтероидного происхождения

In vitro scratch wound assays are commonly used to investigate the mechanisms and characteristics of epithelial healing in a variety of tissue types. ...

Этот протокол расширяет очень распространенный анализ царапин, используемый для исследований регенерации, монослоями энтероидного происхождения, представляющими все основные типы клеток тонкой кишки. Этот метод позволяет в режиме реального времени визуализировать закрытие раны в преждевременной 2D энтероидной монослойной модели регенерации кишечника. Наша методика может быть применена для изучения кишечника недоношенных млекопитающих, который, как правило, плохо моделируется с использованием трансформированных линий клеток колоректального рака.Начните с размораживания 96 микролитров внеклеточного матрикса или гидрогеля BME на основе ECM в течение ночи на льду при температуре от двух до восьми градусов цельсия. Разбавить гидрогель на основе ECM и ледяной PBS без кальция или магния в соотношении один к 50. Покройте каждую скважину 24-луночной пластиной для культивирования тканей 200 микролитрами ледяного разбавленного гидрогеля на основе ECM и инкубируйте покрытую пластину в течение как минимум одного часа при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа.Затем аспирируют среду из 24-луночной культуральной пластины, содержащей 3D-энтероиды, предназначенные для монослоев, и заменяют ее 500 микролитрами реагента диссоциации клеток на лунку. Вручную разрушают купола гидрогеля на основе ECM путем пипетки вверх и вниз от восьми до 12 раз и переноса содержимого 12 скважин в 15-миллилитровую коническую трубку. Промыть 12 пустых лунок 250 микролитрами реагента диссоциации клеток, чтобы убедиться, что все энтероиды удалены, и перенесите содержимое в 15-миллилитровые конические трубки.Центрифугируйте конические трубки при 300 г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и выбросьте супернатант. Добавьте 10 миллилитров ледяного буфера DMEM/F-12 в конические трубки и суспендируйте энтероидные гранулы, перевернув трубки. Центрифугировать при 300 г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и удалить супернатант.Повторно суспендируйте клеточные гранулы в 12 миллилитрах 37 градусов Цельсия Трипсина-ЭДТА и поместите трубки в водяную баню с температурой 37 градусов Цельсия на 10 минут или до тех пор, пока клетки не появятся растворимыми. Добавьте три миллилитра промывочного буфера DMEM/F-12 в каждую трубку, чтобы разбавить трипсин-ЭДТА. Перемешать, перевернув трубки и поместить на лед.Фильтруйте диссоциированные энтероиды через 37-микрометровый сетчатый клеточный сетчатый фильтр. Соберите содержимое в чистые 15-миллилитровые конические трубки и центрифугируйте трубки по 300 г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Удалите супернатант из конических трубок и повторно суспендируйте гранулы клеток шестью миллилитрами HOMGY.Затем удалите пластину с гидрогелевым покрытием на основе ECM из инкубатора и аспирируйте любой избыток раствора гидрогеля на основе ECM, не царапая поверхность с покрытием или полностью высушивая пластину. Добавьте 500 микролитров комбинированной 12-миллилитров клеточной суспензии HOMGY в каждую лунку 24-луночной пластины, покрытой гидрогелем на основе ECM. Закрутите пластину с крышкой, чтобы обеспечить равномерное распределение ячеек внутри скважин.Инкубируйте пластину при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа, обменивая среды HOMGY каждые два дня, пока монослои не достигнут слияния более 90%. Как только монослои достигнут слияния более 90%, аспирируйте среду, чтобы удалить любые клетки, не способные прикрепиться. Обработайте клетки 500 микролитрами HA35 или PBS, растворенными в HOMGY в течение 24 часов.После этого удалите носитель, не нарушая поверхность монослоя. Используя 200-микролитровый наконечник пипетки, сделайте линейную царапину по всему диаметру поверхности монослоя в каждом колодце, стараясь не дать монослоям высохнуть. Вымойте поцарапанные монослои один раз 500 микролитрами 1X PBS и добавьте 500 микролитров HA35 или PBS, растворенных в HOMGY.Перенесите пластину на прибор для анализа живых клеток в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Под значком Расписание в программном обеспечении для анализа живых клеток щелкните значок Launch Add New Vessel Wizard (Мастер добавления нового судна). Выберите «Сканировать по расписанию», затем нажмите «Далее».Выберите «Создать» в разделе «Создать судно» и нажмите «Далее», затем выберите «Вся скважина» в разделе «Тип сканирования» и нажмите «Далее». Выберите Фаза для каналов изображения и 4x для цели. Выберите производителя пластины и каталожный номер из предоставленного списка и нажмите кнопку Далее.Выберите местоположение пустого сосуда, а затем требуемый шаблон сканирования. Введите имя пластины в поле Имя, затем выберите плюс, чтобы создать макет пластины. Выберите маленький плюс, чтобы создать имя процедуры.Введите краткое имя и нажмите кнопку ОК. Выделите пластинчатые колодцы, соответствующие этой обработке, и нанесите большой плюс, чтобы обозначить колодцы с этой обработкой. Введите концентрацию соединения и нажмите кнопку ОК. Когда пластина будет готова, нажмите кнопку ОК, Далее. Выберите Отложить анализ до позднего времени, а затем Создать новое расписание со сканированием с интервалом в четыре часа.Прекратите сканирование в один день, ноль часов. Убедитесь, что сводка верна, а затем добавьте в расписание. В программном обеспечении для анализа живых клеток выберите Вид в верхней части экрана.В меню Название судна перейдите к завершенному 24-часовому сканированию и дважды щелкните название судна. Выберите Значок Экспортировать изображения и фильмы слева, а затем параметр Как отображается. Выделите интересующие вас колодцы, а затем выберите точки интереса по времени и Серию изображений в том виде, в котором они отображаются.Убедитесь, что тип последовательности и сканы верны. Выберите требуемое расположение целевой папки. Выберите JPEG в раскрывающемся меню, а затем Экспорт.Откройте программное обеспечение ImageJ и загрузите изображение анализа царапины. Выберите Изображение, затем введите 8-бит, чтобы изменить изображение с 24-битного RGB. Выберите Плагины, Макросы, Установить, Wound_healing_size плагин, чтобы установить Плагин Размера Заживления Ран.После этого установите радиус окна дисперсии равным 20, пороговое значение 100, процент насыщенных пикселей 0,001. Да, для параметра Установить глобальное масштабирование, а затем нажмите кнопку ОК. Убедитесь, что очерченная область является областью раны, и повторите для дополнительных царапин. Наконец, рассчитайте процент заживления раны в области царапин мигрирующих или пролиферирующих клеток в течение 24 часов, используя уравнение, показанное на экране.Здесь T0 — это область в нулевое время, а TC — это область в ноль часов, четыре часа, 12 часов или 24 часа. На этих изображениях показаны энтероидная генерация и процедура заживления ран энтероидного происхождения. Культура трехмерных, нечеловеческих кишечных энтероидов приматов используется для диссоциации на двумерные монослои.Монослои выращивали до более чем 90% слияния в 24-луночной пластине, а затем обрабатывали HA35 или PBS в течение 24 часов. Затем монослои были поцарапаны наконечником пипетки P200. Здесь показаны репрезентативные изображения HA35 в контрольных методах лечения энтероидных монослоев нечеловеческих приматов.Изображения были получены через ноль часов, четыре часа, 12 часов и 24 часа после выполнения царапины наконечником пипетки P200. Здесь показано влияние HA35 на ранозаживляющие андоидные монослои. Изменение заживления ран с течением времени в энтероидных монослоях зависит от концентрации лечения HA35.HA35 значительно увеличивал заживление ран через четыре часа и 12 часов при 100 микрограммах на миллилитр и 200 микрограммах на миллилитр по сравнению с контролем, но показатели заживления сошлись среди методов лечения на 24 часа. Одна из самых важных вещей, которые следует помнить при этой процедуре, заключается в том, что кишечные энтероидные монослои недолговечны. Таким образом, как только они на 90% объединены, исследователи должны стремиться использовать их быстро.Этот метод стал нашей моделью для преждевременной кишечной регенерации in vitro, особенно если мы заинтересованы в более механической, а не воспалительной травме.

Research

JoVE Journal

Medicine

Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers

A Contusive Model of Unilateral Cervical Spinal Cord Injury Using the Infinite Horizon Impactor

Contusive модели Односторонние шейки Травма спинного мозга с помощью бесконечного Ударный Horizon

While the majority of human spinal cord injuries occur in the cervical spinal cord, the vast majority of laboratory research employs animal models of ...

Murine Model of Wound Healing

Мышиной модели заживления ран

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

An Alkali-burn Injury Model of Corneal Neovascularization in the Mouse

Щелочно-сжечь травмы Модель неоваскуляризации роговицы у мышей

Under normal conditions, the cornea is avascular, and this transparency is essential for maintaining good visual acuity. Neovascularization (NV) of the ...

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Мышиный Эндоскопия для<em&gt; В Vivo</em&gt; Мультимодальные изображений канцерогенеза и оценки кишечной заживления ран и воспаления

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions ...

Development of an Algorithm to Perform a Comprehensive Study of Autonomic Dysreflexia in Animals with High Spinal Cord Injury Using a Telemetry Device

Разработка алгоритма Выполнение комплексного изучения Автономного дисрефлексия у животных с высоким повреждением спинного мозга Использование телеметрического устройства

Spinal cord injury (SCI) is a debilitating neurological condition characterized by somatic and autonomic dysfunctions. In particular, SCI above the ...

Murine Model of Intestinal Ischemia-reperfusion Injury

Мышиной модели кишечная ишемия-реперфузии

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, ...

Open Tracheostomy Gastric Acid Aspiration Murine Model of Acute Lung Injury Results in Maximal Acute Nonlethal Lung Injury

Открыть Трахеостомия Желудочный кислота Аспирация мышиной модели острого повреждения легких Результаты в Максимальный Острый несмертельного повреждения легких

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

Улучшен метод для создания в Vitro гематоэнцефалического барьера модель, основанная на эндотелиальных клеток свиного мозга

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

В естественных условиях Оценка развития каллуса перелом кости Исцеление у мышей с использованием МРТ совместимое устройство остеосинтеза для мыши бедренной

Endochondral fracture healing is a complex process involving the development of fibrous, cartilaginous, and osseous tissue in the fracture callus. The ...