Name: effect of hyaluronic acid 35 kda on an in vitro model of preterm small intestinal injury and healing using enteroid-derived monolayers
Uploaded: 2022-07-28T13:00:00
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Todos los procedimientos con animales en este estudio fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Oklahoma. Después de la aprobación institucional, se obtuvieron muestras fetales de conveniencia del intestino delgado de un primate no humano prematuro (NHP, 90% gestación, babuino oliva, Papio anubis) después de la eutanasia para un estudio separado (Protocolo # 101523-16-039-I)20.
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	<li>Lemons, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Very+low+birth+weight+outcomes+of+the+National+Institute+of+Child+Health+and+Human+Development+Neonatal+Research+Network,+January+1995+through+December+1996.">Very low birth weight outcomes of the National Institute of Child Health and Human Development Neonatal Research Network, January 1995 through December 1996.</a> Pediatrics. 107 (1), 1 (2001).</li><li>Burge, K., Vieira, F., Eckert, J., Chaaban, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+composition,+digestion,+and+absorption+differences+among+neonatal+feeding+strategies:+Potential+implications+for+intestinal+inflammation+in+preterm+infants.">Lipid composition, digestion, and absorption differences among neonatal feeding strategies: Potential implications for intestinal inflammation in preterm infants.</a> Nutrients. 13 (2), 550 (2021).</li><li>Duffy, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+mediating+bacterial+translocation+in+the+immature+intestine.">Interactions mediating bacterial translocation in the immature intestine.</a> The Journal of Nutrition. 130, 432-436 (2000).</li><li>Nanthakumar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+excessive+intestinal+inflammation+in+necrotizing+enterocolitis:+An+immature+innate+immune+response.">The mechanism of excessive intestinal inflammation in necrotizing enterocolitis: An immature innate immune response.</a> PLoS One. 6 (3), 17776 (2011).</li><li>Nanthakumar, N. N., Fusunyan, R. D., Sanderson, I., Walker, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+in+the+developing+human+intestine:+A+possible+pathophysiologic+contribution+to+necrotizing+enterocolitis.">Inflammation in the developing human intestine: A possible pathophysiologic contribution to necrotizing enterocolitis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 6043-6048 (2000).</li><li>He, Y., Lawlor, N. T., Newburg, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+milk+components+modulate+toll-like+receptor-mediated+inflammation.">Human milk components modulate toll-like receptor-mediated inflammation.</a> Advances in Nutrition. 7 (1), 102-111 (2016).</li><li>Walker, W. A., Iyengar, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+milk,+microbiota,+and+intestinal+immune+homeostasis.">Breast milk, microbiota, and intestinal immune homeostasis.</a> Pediatric Research. 77 (1-2), 220-228 (2015).</li><li>Westerbeek, E. A., vanden Berg, A., Lafeber, H. N., Fetter, W. P., van Elburg, R. 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P., Seth, R., Cole, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+immunoglobulin+for+preventing+necrotizing+enterocolitis+in+preterm+and+low+birth+weight+neonates.">Oral immunoglobulin for preventing necrotizing enterocolitis in preterm and low birth weight neonates.</a> The Cochrane Database of Systematic Reviews. 4 (4), (2016).</li><li>Maffei, D., Schanler, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+milk+is+the+feeding+strategy+to+prevent+necrotizing+enterocolitis.">Human milk is the feeding strategy to prevent necrotizing enterocolitis.</a> Seminars in Perinatology. 41 (1), 36-40 (2017).</li><li>Patel, A. L., Kim, J. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+milk+hyaluronan+enhances+innate+defense+of+the+intestinal+epithelium.">Human milk hyaluronan enhances innate defense of the intestinal epithelium.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (40), 29090-29104 (2013).</li><li>Burge, K., Bergner, E., Gunasekaran, A., Eckert, J., Chaaban, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+glycosaminoglycans+in+protection+from+neonatal+necrotizing+enterocolitis:+A+narrative+review.">The role of glycosaminoglycans in protection from neonatal necrotizing enterocolitis: A narrative review.</a> Nutrients. 12 (2), 546 (2020).</li><li>Chaaban, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acceleration+of+small+intestine+development+and+remodeling+of+the+microbiome+following+hyaluronan+35+kDa+treatment+in+neonatal+mice.">Acceleration of small intestine development and remodeling of the microbiome following hyaluronan 35 kDa treatment in neonatal mice.</a> Nutrients. 13 (6), 2030 (2021).</li><li>Gunasekaran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan+35+kDa+enhances+epithelial+barrier+function+and+protects+against+the+development+of+murine+necrotizing+enterocolitis.">Hyaluronan 35 kDa enhances epithelial barrier function and protects against the development of murine necrotizing enterocolitis.</a> Pediatric Research. 87 (7), 1177-1184 (2020).</li><li>Montenegro-Miranda, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+organoid+model+of+damage+and+repair+identifies+HNF4&#945;+as+a+critical+regulator+of+intestinal+epithelial+regeneration.">A novel organoid model of damage and repair identifies HNF4&#945; as a critical regulator of intestinal epithelial regeneration.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (2), 209-223 (2020).</li><li>Lee, C., Hong, S. N., Kim, E. R., Chang, D. K., Kim, Y. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+role+of+35+kilodalton+hyaluronan+in+promoting+defense+of+the+intestinal+epithelium.">Multifunctional role of 35 kilodalton hyaluronan in promoting defense of the intestinal epithelium.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 66 (4), 273-287 (2018).</li><li>Fraser, J. R. E., Laurent, T. C., Laurent, U. B. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+accurate+quantification+of+cell+migration+using+human+small+intestine+cells.">An optimized method for accurate quantification of cell migration using human small intestine cells.</a> Metabolic Engineering Communications. 3, 76-83 (2016).</li><li>Roodsant, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+2D+primary+organoid-derived+epithelial+monolayer+model+to+study+host-pathogen+interaction+in+the+small+intestine.">A human 2D primary organoid-derived epithelial monolayer model to study host-pathogen interaction in the small intestine.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 272 (2020).</li><li>Singh, A., Poling, H. M., Spence, J. R., Wells, J. M., Helmrath, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+organoids:+a+next-generation+tool+for+modeling+human+development.">Gastrointestinal organoids: a next-generation tool for modeling human development.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 319 (3), 375-381 (2020).</li><li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids+as+an+ex-vivo+model+of+host-pathogen+interactions+in+the+gastrointestinal+tract.">Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract.</a> Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1124-1134 (2014).</li><li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids+as+a+model+of+upper+small+intestinal+ion+transport+physiology+and+pathophysiology.">Human enteroids as a model of upper small intestinal ion transport physiology and pathophysiology.</a> Gastroenterology. 150 (3), 638-649 (2016).</li></ol>

El tracto gastrointestinal de un recién nacido prematuro está bajo presión regenerativa continua por exposiciones repetidas a insultos ambientales asociados con disbiosis, metabolitos y toxinas bacterianas inflamatorias, e hipoxia intermitente23,24. Desafortunadamente, el epitelio intestinal del recién nacido prematuro es incapaz de establecer rápidamente la integridad funcional23, lo que resulta en disfunción de barrera, aumento de ...

La enterocolitis necrosante (ECN) es una de las urgencias gastrointestinales más frecuentes en lactantes prematuros1. La enfermedad se caracteriza por una inflamación intestinal severa que puede deteriorarse rápidamente a necrosis intestinal, sepsis y potencialmente la muerte. Aunque la etiología no está clara, la evidencia sugiere que la ECN es multifactorial y el resultado de una compleja interacción de alimentación, colonización bacteriana anormal y epitelio intestinal inmaduro 2,3. Los lactantes prematuros tienen mayor permeabilidad intestinal, colonización bacteriana anormal y baja capacidad regenerativa de enterocitos4,5, lo que aumenta el riesgo de disfunción de la barrera intestinal, translocación bacteriana y desarrollo de NEC. Por lo tanto, identificar estrategias o intervenciones para acelerar la maduración epitelial intestinal y promover la regeneración o curación del epitelio intestinal es fundamental para prevenir esta enfermedad mortal.
Los estudios han demostrado que la leche materna (HM) protege contra la ECN en lactantes prematuros 6,7,8,9,10,11. Tanto los estudios en humanos como en animales han demostrado que la fórmula de base bovina aumenta la permeabilidad intestinal y es directamente tóxica para las células epitelialesintestinales 2,12. Aunque no está completamente dilucidado, la evidencia sugiere que los efectos protectores de HM están mediados por componentes bioactivos como lactoferrina, inmunoglobulina A (IgA) y oligosacáridos HM13. HM también es rico en hialuronano (HA), un glicosaminoglicano no sulfatado único con ácido D-glucurónico repetitivo y N-acetil-D-glucosamina disacáridos14,15. Es importante destacar que hemos demostrado que el HA oral de 35 kDa (HA35), un imitador de HM HA, atenúa la gravedad de la lesión intestinal, previene la translocación bacteriana y disminuye la mortalidad en un modelo murino de lesión intestinal similar a NEC16,17. 
Aquí, los efectos de HA35 en la curación intestinal y la regeneración in vitro se investigan más a fondo. Actualmente, el ensayo in vitro más utilizado para heridas intestinales y reparación es un ensayo de herida por rasguño realizado en monocapas de células de cáncer colorrectal (CCR). La relevancia fisiológica de tal modelo para el intestino del lactante prematuro es limitada, ya que la reparación de heridas de las células del CCR depende en gran medida de la naturaleza altamente proliferativa de las células cancerosas en lugar de los procesos de reparación impulsados por células madre18. Para superar esta limitación, aquí se describe el establecimiento de un modelo de herida por rasguño enteroide 2D, incluido el procedimiento de aislamiento y mantenimiento de enteroides intestinales delgados derivados de células madre primarias de primates prematuros no humanos (NHP). Dado que la ECN prematura se informa con mayor frecuencia en el intestino delgado distal, el uso de organoides de células epiteliales primarias en un modelo de daño y reparación intestinal proporciona un modelo in vitro más fisiológicamente traducible en comparación con los modelos existentes que utilizan monocapas colorrectales tradicionales18,19.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-675-49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x21mm Dish, Nunclon Delta</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>172931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well, TC-Treated, Flat Bottom Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#181;M Reversible Cell Strainer</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>27215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Sterile Cell Strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin, Bovine (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium/Nutrient Ham&#39;s Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>36254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>100-0485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte S3 Live-Cell Analysis Instrument</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>4647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte Scratch Wound Analysis Software Module</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>9600-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>06010</td>
			<td>This is HOGMY, but without the Y-27632 or antibiotics. Also used as base for HOGM, but then only missing the antibiotics.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L3012-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>136101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate-Buffered Saline), 1X [-] Calcium, Magnesium, pH 7.4</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>This is broad-spectrum antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hyaluronate, Research Grade, HA20K</td>
			<td>Lifecore Biomedical</td>
			<td>HA20K-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20 Automated Cell Counter</td>
			<td>Company: Bio-Rad</td>
			<td>1450102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 1X, 0.25% Trypsin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT25053CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72302</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effect of hyaluronic acid 35 kda on an in vitro model of preterm small intestinal injury and healing using enteroid-derived monolayers

Los ensayos de heridas por rasguño in vitro se utilizan comúnmente para investigar los mecanismos y características de la curación epitelial en una variedad de tipos de tejidos. Aquí, describimos un protocolo para generar una monocapa bidimensional (2D) a partir de enteroides de primates no humanos tridimensionales (3D) derivados de criptas intestinales del íleon terminal. Estas monocapas derivadas de enteroides se utilizaron en un ensayo in vitro de herida por rasguño para probar la capacidad del hialuronano 35 kDa (HA35), un imitador de HA de la leche humana, para promover la migración y proliferación celular a lo largo del borde de la herida epitelial. Después de que las monocapas se cultivaron hasta la confluencia, se rayaron manualmente y se trataron con HA35 (50 μg / ml, 100 μg / ml, 200 μg / ml) o control (PBS). La migración celular y la proliferación en la brecha se obtuvieron imágenes utilizando un microscopio de luz transmitida equipado para imágenes de células vivas. El cierre de la herida se cuantificó como porcentaje de cicatrización de heridas utilizando el complemento Wound Healing Size en ImageJ. El área de rasguño y la tasa de migración celular y el porcentaje de cierre de la herida se midieron durante 24 h. HA35 in vitro acelera la cicatrización de heridas en monocapas enteroides del intestino delgado, probablemente a través de una combinación de proliferación celular en el borde de la herida y migración al área de la herida. Estos métodos pueden usarse potencialmente como modelo para explorar la regeneración intestinal en el intestino delgado humano prematuro.

Los efectos de la AH en la reparación de tejidos y la cicatrización de heridas en diversos tejidos y órganos están bien documentados; sin embargo, actualmente se desconocen los efectos específicos del AH con un peso molecular de 35 kDa sobre la cicatrización y regeneración fetal o neonatal del intestino delgado. Para probar la capacidad de HA35 para promover la cicatrización de heridas en un modelo del intestino delgado fetal o neonatal, generamos enteroides intestinales 3D a partir de tejido ileal NHP y disociam...

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Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers

Este protocolo describe un método para establecer y realizar un ensayo de herida por rasguño en monocapas bidimensionales (2D) derivadas de enteroides tridimensionales (3D) aislados del íleon de primates no humanos.

Efecto del ácido hialurónico 35 kDa en un modelo in vitro de lesión prematura del intestino delgado y curación utilizando monocapas derivadas de enteroides

In vitro scratch wound assays are commonly used to investigate the mechanisms and characteristics of epithelial healing in a variety of tissue types. ...

Este protocolo amplía el ensayo muy común de herida por rasguño utilizado para estudios de regeneración con monocapas derivadas de enteroides que representan todos los tipos principales de células del intestino delgado. Esta técnica permite la visualización en tiempo real del cierre de la herida en un modelo monocapa enteroide 2D prematuro de regeneración intestinal. Nuestra técnica se puede aplicar al estudio del intestino prematuro de mamíferos, que generalmente está mal modelado utilizando líneas celulares de cáncer colorrectal transformadas.Comience descongelando 96 microlitros de matriz extracelular, o BME de hidrogel basado en ECM, durante la noche en hielo a dos a ocho grados centígrados. Diluir el hidrogel a base de ECM y el PBS helado sin calcio ni magnesio en una proporción de uno a 50. Cubra cada pocillo de una placa de cultivo de tejido de 24 pocillos con 200 microlitros de hidrogel diluido a base de ECM helado e incube la placa recubierta durante un mínimo de una hora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.Luego aspire los medios de la placa de cultivo de 24 pocillos que contiene los enteroides 3D destinados a monocapas y reemplácelos con 500 microlitros de reactivo de disociación celular por pocillo. Interrumpa manualmente las cúpulas de hidrogel basadas en ECM pipeteando hacia arriba y hacia abajo de ocho a 12 veces y transfiriendo el contenido de 12 pocillos a un tubo cónico de 15 mililitros. Lave los 12 pocillos vacíos con 250 microlitros de reactivo de disociación celular para asegurarse de que se hayan eliminado todos los enteroides y transfiera el contenido a tubos cónicos de 15 mililitros.Centrifugar los tubos cónicos a 300 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y desechar el sobrenadante. Agregue 10 mililitros de tampón de lavado DMEM / F-12 helado a los tubos cónicos y suspenda los gránulos enteroides invirtiendo los tubos. Centrifugar a 300 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y retirar el sobrenadante.Resuspenda los gránulos celulares en 12 mililitros de tripsina-EDTA a 37 grados centígrados y coloque los tubos en un baño de agua de 37 grados centígrados durante 10 minutos o hasta que las células parezcan solubles. Agregue tres mililitros de tampón de lavado DMEM / F-12 a cada tubo para diluir la tripsina-EDTA. Mezclar invirtiendo los tubos y colocar sobre hielo.Filtre los enteroides disociados a través de un filtro de células de malla de 37 micrómetros. Recoja el contenido en tubos cónicos limpios de 15 mililitros y centrifugue los tubos a 300 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Retire el sobrenadante de los tubos cónicos y vuelva a suspender los gránulos celulares con seis mililitros de HOMGY.A continuación, retire la placa recubierta de hidrogel a base de ECM de la incubadora y aspire cualquier exceso de solución de hidrogel a base de ECM sin rayar la superficie recubierta ni secar completamente la placa. Agregue 500 microlitros de la suspensión combinada de células HOMGY de 12 mililitros en cada pocillo de la placa de 24 pocillos recubierta con hidrogel a base de ECM. Agite la placa con la tapa puesta para asegurar una distribución uniforme de las células dentro de los pocillos.Incubar la placa a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono, intercambiando medios HOMGY cada dos días hasta que las monocapas alcancen más del 90% de confluencia. Una vez que las monocapas alcancen más del 90% de confluencia, aspire el medio para eliminar cualquier célula que no se adhiera. Tratar las células con 500 microlitros de HA35 o PBS disueltos en HOMGY durante 24 horas.Después de eso, retire el medio sin interrumpir la superficie de la monocapa. Usando una punta de pipeta de 200 microlitros, haga un rasguño lineal en todo el diámetro de la superficie de la monocapa en cada pocillo, teniendo cuidado de no dejar que las monocapas se sequen. Lave las monocapas rayadas una vez con 500 microlitros de 1X PBS y agregue 500 microlitros de HA35 o PBS disueltos en HOMGY.Transfiera la placa al instrumento de análisis de células vivas dentro de una incubadora de 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. En el icono Schedule (Programado) en el software de análisis de células activas, haga clic en el icono Launch Add New Vessel Wizard (Iniciar agregar nuevo recipiente). Seleccione Escanear según lo programado, luego haga clic en Siguiente.Seleccione Nuevo en Crear recipiente y haga clic en Siguiente, luego seleccione Todo bien en Tipo de escaneo y haga clic en Siguiente. Elija Fase para los canales de imagen y 4x para el objetivo. Seleccione el fabricante de la placa y el número de catálogo de la lista proporcionada y haga clic en Siguiente.Seleccione una ubicación de recipiente vacía seguida del patrón de escaneo deseado. Introduzca el nombre de la placa en Nombre y, a continuación, seleccione más para crear un diseño de placa. Seleccione pequeño signo más para crear un nombre de tratamiento.Escriba el nombre corto y, a continuación, OK. Resalte los pocillos de placa correspondientes a ese tratamiento y golpee grande más para designar pozos con ese tratamiento. Introduzca la concentración compuesta y haga clic en Aceptar. Cuando la placa esté completa, seleccione Aceptar, Siguiente. Seleccione Aplazar el análisis hasta más tarde, seguido de Crear nueva programación con escaneos a intervalos de cuatro horas.Deje de escanear en un día, cero horas. Asegúrese de que el resumen sea correcto y, a continuación, agréguelo a la programación. En el software de análisis de células vivas, seleccione Ver en la parte superior de la pantalla.En el menú Nombre del buque, desplácese hasta el análisis de 24 horas completado y haga doble clic en el nombre del buque. Seleccione el icono Exportar imágenes y películas a la izquierda seguido de la opción Como se muestra. Resalte los pozos de interés y, a continuación, seleccione los puntos de tiempo de interés y la serie de imágenes tal como se muestran.Asegúrese de que el tipo de secuencia y los escaneos sean correctos. Seleccione la ubicación de la carpeta de destino deseada. Elija JPEG en el menú desplegable y luego Exportar.Abra el software ImageJ y cargue la imagen del ensayo de la herida por arañazo. Seleccione Imagen y, a continuación, escriba 8 bits para cambiar la imagen de RGB de 24 bits. Seleccione Plugins, Macros, Install, Wound_healing_size plugin para instalar el plugin Wound Healing Size.Después de eso, establezca el radio de la ventana de varianza en 20, el valor del umbral en 100, el porcentaje de píxeles saturados en 0.001. Sí para Establecer escala global y luego haga clic en Aceptar. Verifique que el área delineada sea el área de la herida y repita para rasguños adicionales. Finalmente, calcule el porcentaje de curación de heridas en el área de rasguño de las células migratorias o proliferantes durante 24 horas utilizando la ecuación que se muestra en la pantalla.Aquí, T0 es el área en horas cero y TC es el área en cero horas, cuatro horas, 12 horas o 24 horas. La generación de enteroides y el procedimiento de ensayo de cicatrización de heridas monocapa derivado de enteroides se muestran en estas imágenes. Se utiliza un cultivo de enteroides intestinales de primates tridimensionales no humanos para disociarse en monocapas bidimensionales.Las monocapas se cultivaron a más del 90% de confluencia en una placa de 24 pocillos y luego se trataron con HA35 o PBS durante 24 horas. Las monocapas se rayaron con una punta de pipeta P200. Aquí se muestran las imágenes representativas de HA35 en tratamientos de control de monocapas enteroides de primates no humanos.Las imágenes se obtuvieron a las cero horas, cuatro horas, 12 horas y 24 horas después de realizar un rasguño con una punta de pipeta P200. El efecto de HA35 en las monocapas andoides de cicatrización de heridas se muestra aquí. El cambio en la cicatrización de heridas a lo largo del tiempo en monocapas enteroides depende de la concentración del tratamiento con HA35.HA35 aumentó significativamente la cicatrización de heridas después de cuatro horas y 12 horas a 100 microgramos por mililitro y 200 microgramos por mililitro en comparación con el control, pero las tasas de curación convergieron entre los tratamientos en 24 horas. Una de las cosas más importantes para recordar con este procedimiento es que las monocapas enteroides intestinales son de corta duración. Por lo tanto, una vez que son 90% confluidos, los investigadores deben buscar usarlos rápidamente.Esta técnica se ha convertido en nuestro modelo de referencia para la regeneración intestinal prematura in vitro, especialmente si estamos interesados en una lesión más mecánica que inflamatoria.

Research

JoVE Journal

Medicine

Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers

A Contusive Model of Unilateral Cervical Spinal Cord Injury Using the Infinite Horizon Impactor

Un modelo de la contundente unilateral Lesión Medular Cervical Uso del Impactador Infinite Horizon

While the majority of human spinal cord injuries occur in the cervical spinal cord, the vast majority of laboratory research employs animal models of ...

Investigación

Medicina

Murine Model of Wound Healing

Modelo murino de Curación de Heridas

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

An Alkali-burn Injury Model of Corneal Neovascularization in the Mouse

Una Lesión álcalis quemar modelo de neovascularización corneal en el ratón

Under normal conditions, the cornea is avascular, and this transparency is essential for maintaining good visual acuity. Neovascularization (NV) of the ...

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Murino Endoscopia para<em&gt; En Vivo</em&gt; Healing Multimodal Imaging de Carcinogénesis y Evaluación de la herida y la inflamación intestinal

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions ...

Development of an Algorithm to Perform a Comprehensive Study of Autonomic Dysreflexia in Animals with High Spinal Cord Injury Using a Telemetry Device

Desarrollo de un algoritmo de realizar un estudio exhaustivo de Disreflexia Autónoma en animales con lesión medular alta El uso de un dispositivo de telemetría

Spinal cord injury (SCI) is a debilitating neurological condition characterized by somatic and autonomic dysfunctions. In particular, SCI above the ...

Murine Model of Intestinal Ischemia-reperfusion Injury

Modelo murino de isquemia-reperfusión intestinal Lesiones

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, ...

Open Tracheostomy Gastric Acid Aspiration Murine Model of Acute Lung Injury Results in Maximal Acute Nonlethal Lung Injury

La traqueostomía abierta ácido gástrico aspiración modelo murino de lesión pulmonar aguda Resultados en máxima no letal aguda lesión pulmonar

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

Mejor método para el establecimiento de un In Vitro Barrera Blood - Brain modelo basado en las células endoteliales de cerebro porcino

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

En Vivo Evaluación del desarrollo del callo de fractura durante la cicatrización ósea en ratones usando un dispositivo de osteosíntesis de MRI-compatible para el fémur de ratón

Endochondral fracture healing is a complex process involving the development of fibrous, cartilaginous, and osseous tissue in the fracture callus. The ...