Name: effect of hyaluronic acid 35 kda on an in vitro model of preterm small intestinal injury and healing using enteroid-derived monolayers
Uploaded: 2022-07-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers at JoVE.com

Detta innehåll är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella åsikterna från National Institutes of Health. HC stöds av bidrag P20GM134973 från National Institutes of Health. KB stöds av ett bidrag från Children's Hospital Foundation (CHF) och Presbyterian Health Foundation (PHF). Live-cell imaging tjänster som tillhandahålls av Cancer Functional Genomics-kärnan stöddes delvis av National Institute of General Medical Sciences Grant P20GM103639 och National Cancer Institute Grant P30CA225520 från National Institutes of Health, tilldelad University of Oklahoma Health Sciences Center Stephenson Cancer Center.

Alla djurförsök i denna studie godkändes av University of Oklahoma Health Sciences Center Institutional Animal Care and Use Committee. Efter institutionellt godkännande erhölls fostertunntarmsprover från en prematur icke-mänsklig primat (NHP, 90% dräktighet, olivbabian, Papio anubis) efter eutanasi för en separat studie (protokoll #101523-16-039-I)20.
1. Etablering av prematura icke-mänskliga primat 3D-intestinala enteroider
<ol><li...

<ol>
	<li>Lemons, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Very+low+birth+weight+outcomes+of+the+National+Institute+of+Child+Health+and+Human+Development+Neonatal+Research+Network,+January+1995+through+December+1996.">Very low birth weight outcomes of the National Institute of Child Health and Human Development Neonatal Research Network, January 1995 through December 1996.</a> Pediatrics. 107 (1), 1 (2001).</li><li>Burge, K., Vieira, F., Eckert, J., Chaaban, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+composition,+digestion,+and+absorption+differences+among+neonatal+feeding+strategies:+Potential+implications+for+intestinal+inflammation+in+preterm+infants.">Lipid composition, digestion, and absorption differences among neonatal feeding strategies: Potential implications for intestinal inflammation in preterm infants.</a> Nutrients. 13 (2), 550 (2021).</li><li>Duffy, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+mediating+bacterial+translocation+in+the+immature+intestine.">Interactions mediating bacterial translocation in the immature intestine.</a> The Journal of Nutrition. 130, 432-436 (2000).</li><li>Nanthakumar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+excessive+intestinal+inflammation+in+necrotizing+enterocolitis:+An+immature+innate+immune+response.">The mechanism of excessive intestinal inflammation in necrotizing enterocolitis: An immature innate immune response.</a> PLoS One. 6 (3), 17776 (2011).</li><li>Nanthakumar, N. N., Fusunyan, R. D., Sanderson, I., Walker, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+in+the+developing+human+intestine:+A+possible+pathophysiologic+contribution+to+necrotizing+enterocolitis.">Inflammation in the developing human intestine: A possible pathophysiologic contribution to necrotizing enterocolitis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 6043-6048 (2000).</li><li>He, Y., Lawlor, N. T., Newburg, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+milk+components+modulate+toll-like+receptor-mediated+inflammation.">Human milk components modulate toll-like receptor-mediated inflammation.</a> Advances in Nutrition. 7 (1), 102-111 (2016).</li><li>Walker, W. A., Iyengar, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+milk,+microbiota,+and+intestinal+immune+homeostasis.">Breast milk, microbiota, and intestinal immune homeostasis.</a> Pediatric Research. 77 (1-2), 220-228 (2015).</li><li>Westerbeek, E. A., vanden Berg, A., Lafeber, H. N., Fetter, W. P., van Elburg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+enteral+supplementation+of+a+prebiotic+mixture+of+non-human+milk+galacto-,+fructo-+and+acidic+oligosaccharides+on+intestinal+permeability+in+preterm+infants.">The effect of enteral supplementation of a prebiotic mixture of non-human milk galacto-, fructo- and acidic oligosaccharides on intestinal permeability in preterm infants.</a> British Journal of Nutrition. 105 (2), 268-274 (2011).</li><li>vanden Berg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+glutamine-enriched+enteral+nutrition+on+intestinal+permeability+in+very-low-birth-weight+infants:+A+randomized+controlled+trial.">The effect of glutamine-enriched enteral nutrition on intestinal permeability in very-low-birth-weight infants: A randomized controlled trial.</a> Journal of Parenteral and Enteral Nutrition. 30 (5), 408-414 (2006).</li><li>Foster, J. P., Seth, R., Cole, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+immunoglobulin+for+preventing+necrotizing+enterocolitis+in+preterm+and+low+birth+weight+neonates.">Oral immunoglobulin for preventing necrotizing enterocolitis in preterm and low birth weight neonates.</a> The Cochrane Database of Systematic Reviews. 4 (4), (2016).</li><li>Maffei, D., Schanler, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+milk+is+the+feeding+strategy+to+prevent+necrotizing+enterocolitis.">Human milk is the feeding strategy to prevent necrotizing enterocolitis.</a> Seminars in Perinatology. 41 (1), 36-40 (2017).</li><li>Patel, A. L., Kim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+milk+and+necrotizing+enterocolitis.">Human milk and necrotizing enterocolitis.</a> Seminars in Pediatric Surgery. 27 (1), 34-38 (2018).</li><li>Nolan, L. S., Parks, O. B., Good, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+immunomodulating+components+of+maternal+breast+milk+and+protection+against+necrotizing+enterocolitis.">A review of the immunomodulating components of maternal breast milk and protection against necrotizing enterocolitis.</a> Nutrients. 12 (1), 14 (2019).</li><li>Hill, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+milk+hyaluronan+enhances+innate+defense+of+the+intestinal+epithelium.">Human milk hyaluronan enhances innate defense of the intestinal epithelium.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (40), 29090-29104 (2013).</li><li>Burge, K., Bergner, E., Gunasekaran, A., Eckert, J., Chaaban, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+glycosaminoglycans+in+protection+from+neonatal+necrotizing+enterocolitis:+A+narrative+review.">The role of glycosaminoglycans in protection from neonatal necrotizing enterocolitis: A narrative review.</a> Nutrients. 12 (2), 546 (2020).</li><li>Chaaban, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acceleration+of+small+intestine+development+and+remodeling+of+the+microbiome+following+hyaluronan+35+kDa+treatment+in+neonatal+mice.">Acceleration of small intestine development and remodeling of the microbiome following hyaluronan 35 kDa treatment in neonatal mice.</a> Nutrients. 13 (6), 2030 (2021).</li><li>Gunasekaran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan+35+kDa+enhances+epithelial+barrier+function+and+protects+against+the+development+of+murine+necrotizing+enterocolitis.">Hyaluronan 35 kDa enhances epithelial barrier function and protects against the development of murine necrotizing enterocolitis.</a> Pediatric Research. 87 (7), 1177-1184 (2020).</li><li>Montenegro-Miranda, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+organoid+model+of+damage+and+repair+identifies+HNF4&#945;+as+a+critical+regulator+of+intestinal+epithelial+regeneration.">A novel organoid model of damage and repair identifies HNF4&#945; as a critical regulator of intestinal epithelial regeneration.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (2), 209-223 (2020).</li><li>Lee, C., Hong, S. N., Kim, E. R., Chang, D. K., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+regeneration+ability+of+Crohn's+disease+assessed+using+patient-derived+intestinal+organoids.">Epithelial regeneration ability of Crohn's disease assessed using patient-derived intestinal organoids.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 6013 (2021).</li><li>Gurung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+Zika+virus+(ZIKV)+infection+following+vaginal+inoculation+with+ZIKV-infected+semen+in+timed-pregnant+olive+baboons.">Maternal Zika virus (ZIKV) infection following vaginal inoculation with ZIKV-infected semen in timed-pregnant olive baboons.</a> Journal of Virology. 94 (11), 00058 (2020).</li><li>Suarez-Arnedo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+image+J+plugin+for+the+high+throughput+image+analysis+of+in+vitro+scratch+wound+healing+assays.">An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays.</a> PLoS One. 15 (7), 0232565 (2020).</li><li>Kobelt, D., Walther, W., Stein, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+cell+migration+monitoring+to+analyze+drug+synergism+in+the+scratch+assay+using+the+IncuCyte+system.">Real-time cell migration monitoring to analyze drug synergism in the scratch assay using the IncuCyte system.</a> Methods in Molecular Biology. 2294, 133-142 (2021).</li><li>de Jong, J. C. W., Ijssennagger, N., van Mil, S. W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+milk+nutrients+driving+intestinal+epithelial+layer+maturation+via+Wnt+and+Notch+signaling:+Implications+for+necrotizing+enterocolitis.">Breast milk nutrients driving intestinal epithelial layer maturation via Wnt and Notch signaling: Implications for necrotizing enterocolitis.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1867 (11), 166229 (2021).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietin+protects+epithelial+cells+from+excessive+autophagy+and+apoptosis+in+experimental+neonatal+necrotizing+enterocolitis.">Erythropoietin protects epithelial cells from excessive autophagy and apoptosis in experimental neonatal necrotizing enterocolitis.</a> PLoS One. 8 (7), 69620 (2013).</li><li>Kessler, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+role+of+35+kilodalton+hyaluronan+in+promoting+defense+of+the+intestinal+epithelium.">Multifunctional role of 35 kilodalton hyaluronan in promoting defense of the intestinal epithelium.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 66 (4), 273-287 (2018).</li><li>Fraser, J. R. E., Laurent, T. C., Laurent, U. B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan:+Its+nature,+distribution,+functions+and+turnover.">Hyaluronan: Its nature, distribution, functions and turnover.</a> Journal of Internal Medicine. 242 (1), 27-33 (1997).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan+35kDa+treatment+protects+mice+from+Citrobacter+rodentium+infection+and+induces+epithelial+tight+junction+protein+ZO-1+in+vivo.">Hyaluronan 35kDa treatment protects mice from Citrobacter rodentium infection and induces epithelial tight junction protein ZO-1 in vivo.</a> Matrix Biology. 62, 28-39 (2017).</li><li>Prehm, P., Schumacher, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+hyaluronan+export+from+human+fibroblasts+by+inhibitors+of+multidrug+resistance+transporters.">Inhibition of hyaluronan export from human fibroblasts by inhibitors of multidrug resistance transporters.</a> Biochemical Pharmacology. 68 (7), 1401-1410 (2004).</li><li>Stenson, W. F., Ciorba, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonmicrobial+activation+of+TLRs+controls+intestinal+growth,+wound+repair,+and+radioprotection.">Nonmicrobial activation of TLRs controls intestinal growth, wound repair, and radioprotection.</a> Frontiers in Immunology. 11 (3591), 617510 (2021).</li><li>Riehl, T. E., Ee, X., Stenson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronic+acid+regulates+normal+intestinal+and+colonic+growth+in+mice.">Hyaluronic acid regulates normal intestinal and colonic growth in mice.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 303 (3), 377-388 (2012).</li><li>Riehl, T. E., Santhanam, S., Foster, L., Ciorba, M., Stenson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44+and+TLR4+mediate+hyaluronic+acid+regulation+of+Lgr5++stem+cell+proliferation,+crypt+fission,+and+intestinal+growth+in+postnatal+and+adult+mice.">CD44 and TLR4 mediate hyaluronic acid regulation of Lgr5+ stem cell proliferation, crypt fission, and intestinal growth in postnatal and adult mice.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309 (11), 874-887 (2015).</li><li>Hill, D. R., Kessler, S. P., Rho, H. K., Cowman, M. K., de la Motte, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific-sized+hyaluronan+fragments+promote+expression+of+human+beta-defensin+2+in+intestinal+epithelium.">Specific-sized hyaluronan fragments promote expression of human beta-defensin 2 in intestinal epithelium.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (36), 30610-30624 (2012).</li><li>Fernando, E. H., Gordon, M. H., Beck, P. L., MacNaughton, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+intestinal+epithelial+wound+healing+through+protease-activated+receptor-2+activation+in+Caco2+cells.">Inhibition of intestinal epithelial wound healing through protease-activated receptor-2 activation in Caco2 cells.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 367 (2), 382-392 (2018).</li><li>Nyegaard, S., Christensen, B., Rasmussen, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+accurate+quantification+of+cell+migration+using+human+small+intestine+cells.">An optimized method for accurate quantification of cell migration using human small intestine cells.</a> Metabolic Engineering Communications. 3, 76-83 (2016).</li><li>Roodsant, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+2D+primary+organoid-derived+epithelial+monolayer+model+to+study+host-pathogen+interaction+in+the+small+intestine.">A human 2D primary organoid-derived epithelial monolayer model to study host-pathogen interaction in the small intestine.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 272 (2020).</li><li>Singh, A., Poling, H. M., Spence, J. R., Wells, J. M., Helmrath, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+organoids:+a+next-generation+tool+for+modeling+human+development.">Gastrointestinal organoids: a next-generation tool for modeling human development.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 319 (3), 375-381 (2020).</li><li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids+as+an+ex-vivo+model+of+host-pathogen+interactions+in+the+gastrointestinal+tract.">Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract.</a> Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1124-1134 (2014).</li><li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids+as+a+model+of+upper+small+intestinal+ion+transport+physiology+and+pathophysiology.">Human enteroids as a model of upper small intestinal ion transport physiology and pathophysiology.</a> Gastroenterology. 150 (3), 638-649 (2016).</li></ol>

Mag-tarmkanalen hos ett för tidigt barn är under kontinuerligt regenerativt tryck från upprepade exponeringar för miljöförolämpningar i samband med dysbios, inflammatoriska bakteriemetaboliter och toxiner och intermittent hypoxi23,24. Tyvärr kan tarmepitelet hos det för tidigt födda barnet inte snabbt fastställa funktionell integritet23, vilket resulterar i barriärdysfunktion, ökad tarmpermeabilitet och i allvarliga fall skena...

Nekrotiserande enterokolit (NEC) är en av de vanligaste gastrointestinala nödsituationerna hos för tidigt födda barn1. Sjukdomen kännetecknas av svår tarminflammation som snabbt kan försämras till tarmnekros, sepsis och potentiellt död. Även om etiologin är oklar, tyder bevis på att NEC är multifaktoriell och resultatet av en komplex interaktion mellan utfodring, onormal bakteriekolonisering och ett omoget tarmepitel 2,3. För tidigt födda barn har ökad tarmpermeabilitet, onormal bakteriekolonisering och låg enterocytregenerativ kapacitet4,5, vilket ökar risken för tarmbarriärdysfunktion, bakteriell translokation och NEC-utveckling. Därför är det viktigt att identifiera strategier eller ingrepp för att påskynda tarmepitelmognad och främja regenerering eller läkning av tarmepitelet för att förhindra denna dödliga sjukdom.
Studier har visat att bröstmjölk (HM) är skyddande mot NEC hos för tidigt födda barn 6,7,8,9,10,11. Både studier på människor och djur har visat att bovin formel ökar tarmpermeabiliteten och är direkt giftig för tarmepitelceller 2,12. Även om det inte är helt klarlagt, tyder bevis på att de skyddande effekterna av HM förmedlas genom bioaktiva komponenter såsom laktoferrin, immunglobulin A (IgA) och HM-oligosackarider13. HM är också rik på hyaluronan (HA), en unikt icke-sulfaterad glykosaminoglykan med upprepande D-glukuronsyra och N-acetyl-D-glukosamindisackarider14,15. Viktigt är att vi har visat att oral 35 kDa HA (HA35), en HM HA-efterlikning, dämpar svårighetsgraden av tarmskada, förhindrar bakteriell translokation och minskar dödligheten i en murin NEC-liknande tarmskademodell16,17. 
Här undersöks effekterna av HA35 på tarmläkning och regenerering in vitro ytterligare. För närvarande är den mest använda in vitro-analysen för tarmsårning och reparation en repsåranalys utförd i kolorektal cancer (CRC) cellmonolager. Den fysiologiska relevansen av en sådan modell för den prematura spädbarnstarmen är begränsad, eftersom sårreparation av CRC-celler är starkt beroende av cancercellernas mycket proliferativa natur snarare än stamcellsdrivna reparationsprocesser18. För att övervinna denna begränsning beskrivs här upprättandet av en 2D-enteroid repsårmodell, inklusive proceduren för att isolera och upprätthålla primära stamcellsderiverade tunntarmsenteroider från prematura icke-mänskliga primater (NHP). Med tanke på att prematur NEC oftast rapporteras i den distala tunntarmen, ger användningen av primära epitelcellorganoider i en modell av tarmskada och reparation en mer fysiologiskt översättbar in vitro-modell jämfört med befintliga modeller som använder traditionella kolorektalmonolager18,19.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-675-49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x21mm Dish, Nunclon Delta</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>172931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well, TC-Treated, Flat Bottom Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#181;M Reversible Cell Strainer</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>27215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Sterile Cell Strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin, Bovine (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium/Nutrient Ham&#39;s Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>36254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>100-0485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte S3 Live-Cell Analysis Instrument</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>4647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte Scratch Wound Analysis Software Module</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>9600-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>06010</td>
			<td>This is HOGMY, but without the Y-27632 or antibiotics. Also used as base for HOGM, but then only missing the antibiotics.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L3012-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>136101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate-Buffered Saline), 1X [-] Calcium, Magnesium, pH 7.4</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>This is broad-spectrum antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hyaluronate, Research Grade, HA20K</td>
			<td>Lifecore Biomedical</td>
			<td>HA20K-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20 Automated Cell Counter</td>
			<td>Company: Bio-Rad</td>
			<td>1450102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 1X, 0.25% Trypsin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT25053CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72302</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effect of hyaluronic acid 35 kda on an in vitro model of preterm small intestinal injury and healing using enteroid-derived monolayers

In vitro repsåranalyser används ofta för att undersöka mekanismerna och egenskaperna hos epitelläkning i en mängd olika vävnadstyper. Här beskriver vi ett protokoll för att generera ett tvådimensionellt (2D) monolager från tredimensionella (3D) icke-mänskliga primatenteroider härledda från tarmkrypter i terminal ileum. Dessa enteroid-härledda monolager användes sedan i en in vitro-repsåranalys för att testa förmågan hos hyaluronan 35 kDa (HA35), en human mjölk HA-efterlikning, för att främja cellmigration och spridning längs epitelsårkanten. Efter att monolagren hade odlats till sammanflöde repades de manuellt och behandlades med HA35 (50 μg/ml, 100 μg/ml, 200 μg/ml) eller kontroll (PBS). Cellmigration och proliferation in i gapet avbildades med hjälp av ett överfört ljusmikroskop utrustat för levande cellavbildning. Sårförslutning kvantifierades som procent sårläkning med hjälp av Wound Healing Size Plugin i ImageJ. Repområdet och hastigheten för cellmigration och andelen sårförslutning mättes över 24 timmar. HA35 in vitro påskyndar sårläkning i små intestinala enteroidmonolager, sannolikt genom en kombination av cellproliferation vid sårkanten och migration till sårområdet. Dessa metoder kan potentiellt användas som en modell för att utforska tarmregenerering i den prematura mänskliga tunntarmen.

Effekterna av HA på vävnadsreparation och sårläkning i olika vävnader och organ är väldokumenterade; De specifika effekterna av HA med en molekylvikt på 35 kDa på foster- eller neonatal tunntarmsläkning och regenerering är dock för närvarande okända. För att testa förmågan hos HA35 att främja sårläkning i en modell av fostrets eller neonatala tunntarmen genererade vi 3D-intestinala enteroider från NHP-ilealvävnad och dissocierade denna vävnad ytterligare i enskilda celler för att skapa 2D-enteroid...

Watch this Scientific Journal Video about Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers at JoVE.com

Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers

Detta protokoll beskriver en metod för att upprätta och utföra en repsåranalys på tvådimensionella (2D) monolager härledda från tredimensionella (3D) enteroider isolerade från icke-mänskliga primat ileum.

Effekt av hyaluronsyra 35 kDa på en in vitro-modell av prematur tunntarmsskada och läkning med hjälp av enteroid-härledda monolager

In vitro scratch wound assays are commonly used to investigate the mechanisms and characteristics of epithelial healing in a variety of tissue types. ...

Detta protokoll utökar den mycket vanliga repsåranalysen som används för regenereringsstudier med enteroid-härledda monolager som representerar alla större celltyper i tunntarmen. Denna teknik möjliggör visualisering i realtid av sårförslutning i en prematur 2D-enteroid monolagermodell för tarmregenerering. Vår teknik kan tillämpas på studier av prematur däggdjurstarm, som vanligtvis är dåligt modellerad med hjälp av transformerade kolorektalcancercellinjer.Börja med att tina 96 mikroliter extracellulär matris, eller ECM-baserad hydrogel BME, över natten på is vid två till åtta grader Celsius. Späd den ECM-baserade hydrogelen och iskall PBS utan kalcium eller magnesium i förhållandet ett till 50. Täck varje brunn i en 24-brunns vävnadsodlingsplatta med 200 mikroliter iskall utspädd ECM-baserad hydrogel och inkubera den belagda plattan i minst en timme vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid.Aspirera sedan mediet från 24-brunnsodlingsplattan som innehåller 3D-enteroiderna avsedda för monolager och ersätt det med 500 mikroliter celldissociationsreagens per brunn. Stör manuellt de ECM-baserade hydrogelkupolerna genom att pipettera upp och ner åtta till 12 gånger och överföra innehållet i 12 brunnar till ett 15-milliliters koniskt rör. Tvätta de 12 tomma brunnarna med 250 mikroliter celldissociationsreagens för att säkerställa att alla enteroider har tagits bort och överför innehållet till 15 ml koniska rör.Centrifugera de koniska rören vid 300 g i fem minuter vid fyra grader Celsius och kassera supernatanten. Tillsätt 10 ml iskall DMEM/F-12 tvättbuffert till de koniska rören och suspendera enteroidpelletsen genom att invertera rören. Centrifugera vid 300 g i fem minuter vid fyra grader Celsius och ta bort supernatanten.Återsuspendera cellpellets i 12 ml 37 grader Celsius Trypsin-EDTA och placera rören i ett 37 grader Celsius vattenbad i 10 minuter eller tills cellerna verkar lösliga. Tillsätt tre milliliter DMEM/F-12 tvättbuffert till varje rör för att späda ut Trypsin-EDTA. Blanda genom att invertera rören och lägg på is.Filtrera de dissocierade enteroiderna genom en 37 mikrometer nätcellsil. Samla innehållet i rena 15-milliliter koniska rör och centrifugera rören vid 300 g i fem minuter vid fyra grader Celsius. Ta bort supernatanten från de koniska rören och återsuspendera cellpelletsen med sex milliliter HOMGY.Ta sedan bort den ECM-baserade hydrogelbelagda plattan från inkubatorn och aspirera eventuellt överskott av ECM-baserad hydrogellösning utan att repa den belagda ytan eller torka plattan helt. Tillsätt 500 mikroliter av den kombinerade 12 ml HOMGY-cellsuspensionen i varje brunn på 24-brunnsplattan belagd med ECM-baserad hydrogel. Virvla plattan med locket på för att säkerställa en jämn fördelning av celler i brunnarna.Inkubera plattan vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid, byt HOMGY-media varannan dag tills monolagren når mer än 90% sammanflöde. När monolagren når mer än 90% sammanflöde, aspirera media för att ta bort eventuella celler som inte fäster. Behandla cellerna med 500 mikroliter HA35 eller PBS upplöst i HOMGY i 24 timmar.Ta sedan bort media utan att störa monoskiktets yta. Använd en 200-mikroliter pipettspets, gör en linjär repa över monoskiktets fulla ytdiameter i varje brunn, var försiktig så att du inte låter monolagren torka. Tvätta de repade monolagren en gång med 500 mikroliter 1X PBS och tillsätt 500 mikroliter HA35 eller PBS upplöst i HOMGY.Överför plattan till det levande cellanalysinstrumentet inom en 37 grader Celsius och 5% koldioxidinkubator. Under schemaikonen i programvaran för livecellanalys klickar du på ikonen Starta lägg till nytt fartyg. Välj Skanna enligt schema och klicka sedan på Nästa.Välj Ny under Skapa fartyg och klicka på Nästa, välj sedan Hela brunnen under Skanningstyp och klicka på Nästa. Välj Fas för bildkanaler och 4x för målet. Välj skylttillverkaren och katalognumret från den angivna listan och klicka på Nästa.Välj en tom fartygsplats följt av önskat skanningsmönster. Ange skyltnamn i Namn och välj sedan plus för att skapa en plåtlayout. Välj litet plus för att skapa ett behandlingsnamn.Ange kortnamn och sedan OK. Markera plattbrunnarna som motsvarar den behandlingen och slå stort plus för att utse brunnar med den behandlingen. Ange sammansatt koncentration och klicka på OK. När plattan är klar väljer du OK, Nästa. Välj Skjut upp analys till senare följt av Skapa nytt schema med genomsökningar med intervaller på fyra timmar.Sluta skanna på en dag, noll timmar. Kontrollera att sammanfattningen är korrekt och lägg sedan till i schemat. I programvara för cellanalys i realtid väljer du Visa högst upp på skärmen.Från menyn Fartygsnamn navigerar du till din slutförda 24-timmarsskanning och dubbelklickar på fartygsnamnet. Välj Exportera bilder och filmer ikonen till vänster följt av Som visas alternativ. Markera de brunnar som är intressanta och välj sedan intressanta tidpunkter och Bildserier som visas.Se till att sekvenstypen och skanningarna är korrekta. Välj önskad målmappplats. Välj JPEG från rullgardinsmenyn och sedan Exportera.Öppna ImageJ-programvaran och ladda upp repsåranalysbilden. Välj Bild och skriv sedan 8-bitars för att ändra bilden från 24-bitars RGB. Välj Plugins, Macros, Install, Wound_healing_size plugin för att installera Wound Healing Size Plugin.Därefter ställer du in variansfönstrets radie till 20, tröskelvärdet till 100, procentandelen mättade pixlar till 0,001. Ja för Ställ in skala globalt och klicka sedan på OK. Kontrollera att det skisserade området är sårområdet och upprepa för ytterligare repor. Slutligen beräkna procentandelen av repområdets sårläkning av migrerande eller prolifererande celler under 24 timmar med hjälp av ekvationen som visas på skärmen.Här är T0 området vid noll timmar, och TC är området vid noll timmar, fyra timmar, 12 timmar eller 24 timmar. Enteroid generation och enteroid-härledd monolayer sårläkningsanalysprocedur visas i dessa bilder. En kultur av tredimensionella, icke-mänskliga primatintestinala enteroider används för att dissociera i tvådimensionella monolager.Monolager odlades till mer än 90% sammanflöde i en 24-brunnsplatta och behandlades sedan med HA35 eller PBS i 24 timmar. Monolayers repades sedan med en P200-pipettspets. Här visas de representativa bilderna av HA35 i kontrollbehandlingar av icke-mänskliga primat enteroidmonolager.Bilder erhölls vid noll timmar, fyra timmar, 12 timmar och 24 timmar efter att ha utfört en repa med en P200-pipettspets. Effekten av HA35 på sårläkning och monolager visas här. Förändringen i sårläkning över tid i enteroidmonolager är beroende av HA35-behandlingskoncentrationen.HA35 ökade signifikant sårläkning efter fyra timmar och 12 timmar vid 100 mikrogram per milliliter och 200 mikrogram per milliliter jämfört med kontroll, men läkningshastigheterna konvergerade mellan behandlingar med 24 timmar. En av de viktigaste sakerna att komma ihåg med denna procedur är att intestinala enteroidmonolager är kortlivade. Så när de är 90% flytande bör utredarna se till att använda dem snabbt.Denna teknik har blivit vår go-to-modell för prematur tarmregenerering in vitro, särskilt om vi är intresserade av mer mekanisk snarare än inflammatorisk skada.

Research

JoVE Journal

Medicine

Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers

A Contusive Model of Unilateral Cervical Spinal Cord Injury Using the Infinite Horizon Impactor

En kontusiva Modell av ensidiga cervikal ryggmärgsskada Använda oändliga Horizon Impactor

While the majority of human spinal cord injuries occur in the cervical spinal cord, the vast majority of laboratory research employs animal models of ...

Murine Model of Wound Healing

Murinmodell sårläkning

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

An Alkali-burn Injury Model of Corneal Neovascularization in the Mouse

En Alkali-bränna Skada Modell av hornhinneneovaskularisering i musen

Under normal conditions, the cornea is avascular, and this transparency is essential for maintaining good visual acuity. Neovascularization (NV) of the ...

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Murin Endoskopi för<em&gt; In Vivo</em&gt; Multimodal avbildning av Carcinogenesis och Bedömning av intestinala sårläkning och inflammation

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions ...

Development of an Algorithm to Perform a Comprehensive Study of Autonomic Dysreflexia in Animals with High Spinal Cord Injury Using a Telemetry Device

Utveckling av en algoritm för att göra en studie av Autonom dysreflexi i djur med hög ryggmärgsskada med hjälp av en telemetrienhet

Spinal cord injury (SCI) is a debilitating neurological condition characterized by somatic and autonomic dysfunctions. In particular, SCI above the ...

Murine Model of Intestinal Ischemia-reperfusion Injury

Murina Modell av Intestinal ischemi-reperfusionsskada

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, ...

Open Tracheostomy Gastric Acid Aspiration Murine Model of Acute Lung Injury Results in Maximal Acute Nonlethal Lung Injury

Öppna Trakeostomituber Gastric Acid aspiration Murina Modell av akut lungskada Resultat i Maximal Akut nonlethal Lung Injury

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

Förbättrad metod för inrättandet av ett In Vitro blod - hjärnbarriären modell baserat på svin hjärnan endotelceller

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

In Vivo Utvärdering av fraktur förhårdnader utveckling under läkning hos möss med en MRI-kompatibel osteosyntes enhet för mus lårbenet

Endochondral fracture healing is a complex process involving the development of fibrous, cartilaginous, and osseous tissue in the fracture callus. The ...