Name: standardized in vitro assays to visualize and quantify interactions between human neutrophils and staphylococcus aureus biofilms
Uploaded: 2022-06-08T14:00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Standardized In vitro Assays to Visualize and Quantify Interactions between Human Neutrophils and Staphylococcus aureus Biofilms at JoVE.com

تم تمويل هذا العمل من قبل المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية (R01AI077628) إلى DJW وجائزة التطوير الوظيفي لجمعية القلب الأمريكية (19CDA34630005) إلى ESG. نشكر الدكتور بول ستودلي على تزويدنا بسلالة USA 300 LAC GFP. علاوة على ذلك ، نحن نعترف بالموارد من مرفق الفحص المجهري والتصوير في الحرم الجامعي (CMIF) ومركز السرطان الشامل (OSUCCC) للفحص المجهري المشترك (MSR) ، جامعة ولاية أوهايو. كما نشكر أميليا ستاتس وبيتر بورباك وليزا كولمان من مختبر ستودلي على إجراء عمليات سحب الدم.

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

كانت هناك جهود عديدة لزراعة الأغشية الحيوية القوية والقابلة للتكرار S. aureus للتجارب النهائية في المختبر48،49،50. تم تحديد بروتوكول موحد يستفيد من الطبيعة الكاتيونية ل PLL ، بالإضافة إلى استكمال الوسائط بالجلوكوز لنمو الأغشية الحيوية القوية في المختبر S. aureus. تسمح إضافة PLL بربط أفضل للخلية البكتيرية سالبة الشحنة بالأسطح المطلية ب PLL المشحونة إيجابيا. من المهم ملاحظة أن PLL بتركيز 10 ميكروغرام / مل له نشاط مضاد للميكروبات ضد الزائفة الزنجارية والإشريكية القولونية و S. aureus عند حضنها لمدة 24 ساعة51. يتم استخدام نفس التركيز لطلاء الأسطح. ومع ذلك ، يتم استنشاق PLL الزائد ، مما يجعل تركيز PLL أقل من 10 ميكروغرام / مل عند البذر لنمو الأغشية الحيوية.
من المهم ملاحظة أن PLL قد عملت فقط في وسائط نمو محددة مثل MEMα مع 2٪ جلوكوز ، حيث لوحظ أن S. aureus أنتجت أغشية حيوية قوية مع الحد الأدنى من التباين (الشكل 2 أ). سيتطلب تركيز PLL الذي سيتم استخدامه جنبا إلى جنب مع أنواع الوسائط الأخرى مزيدا من التحسين ، مثل استخدام تركيز متزايد من PLL لتغطية الآبار. بالإضافة إلى ذلك ، تم تحسين هذه الظروف لغشاء حيوي أحادي النوع S. aureus. في حين أن الأغشية الحيوية للجرح المزمن غالبا ما تكون متعددة الميكروبات ، فإن توحيد المقايسات لدراسة الأغشية الحيوية أحادية النوع وتفاعلاتها مع العدلات والخلايا المناعية الأخرى أمر أساسي في فهم مساهمتها في التسببفي المرض 52. يمكن تحسين هذه البروتوكولات الموحدة بشكل أكبر للحفاظ على الأغشية الحيوية متعددة الميكروبات ودراستها وتفاعلاتها مع العدلات.
ولوحظ أيضا أن وسائط الاستزراع البكتيري الغنية، مثل TSB، أدت إلى فقدان صلاحية العدلات (الشكل 1). لذلك ، تم تحسين ظروف نمو الأغشية الحيوية S. aureus في MEMα ، المستخدمة في مزارع خلايا الثدييات. بالنسبة للدراسات التي تتضمن العدلات ، تدعم هذه الوسائط صلاحية العدلات وتعزز نمو العقدية الذهبية . بينما لوحظ أن الوسائط تؤثر على صلاحية العدلات ، من المهم أيضا مراعاة أن العدلات المعزولة من دم الإنسان المحيطي تخضع لموت الخلايا المبرمج خارج الجسم الحي مع ما يقرب من 70٪ من العدلات موت الخلايا المبرمج بحلول 20 ساعة53. وهذا يتطلب التعامل السليم ، مثل تخزين العدلات على الجليد عند التحضير للتجارب ، واستخدام الكواشف الخالية من السموم الداخلية ، ومنع تنشيط العدلات عن طريق تجنب دوامة العينات مع العدلات.
يتم إجراء تقييم الانفجار التأكسدي في العدلات بشكل روتيني لتحديد تأثير قتل العدلات على العامل الممرض14،54،55. يتم إجراء هذه الدراسات بشكل متكرر مع بكتيريا العوالق حيث تتم إضافة العدلات ، ويتم قياس استجابة الانفجار التأكسدي باستخدام التلألؤ الكيميائي المضخم للومينول الذي يكتشف أنيونات الأكسيد الفائق التي تنتجها العدلات. يتم تعديل البروتوكول الحالي عن طريق استبدال بكتيريا العوالق بغشاء حيوي S. aureus ينمو بشكل ثابت 18 ساعة. على هذا النحو ، يمكن إضافة العدلات مباشرة إلى الغشاء الحيوي لتقييم تنشيطها. من ناحية أخرى ، تنتج البكتيريا الموجودة في الأغشية الحيوية إنزيمات ، مثل الكاتلاز وديسموتاز الفائق لإزالة السموم من ROS23,56. تنتج الأغشية الحيوية للمكورات العنقودية البشروية كاتالاز أعلى من نظيرتها العوالق تحت الضغط57. يكون التلألؤ الكيميائي الكلي للعدلات المحفزة ب PMA في الأغشية الحيوية S. aureus أقل بكثير من العدلات المحفزة ب PMA حيث لا يوجد غشاء حيوي (الشكل 2). قد يكون هذا بسبب نشاط هذه الإنزيمات المزيلة للسموم. علاوة على ذلك ، تنتج الأغشية الحيوية S. aureus العديد من السموم المكونة للمسام والتي تسمى leukocidins التي تقتل العدلات58. من المحتمل أيضا أن تكون استجابة الانفجار المنخفضة بسبب انخفاض صلاحية العدلات في وجود الأغشية الحيوية S. aureus. بينما تستخدم هذه الدراسة اللومينول الذي يكتشف إجمالي أنواع الأكسجين التفاعلية المنتجة داخل الخلايا وخارجها ، يجب مراعاة الكواشف الأخرى ، مثل CM-H 2 DCFDA (5- (و-6) -كلوروميثيل -2'7'-ثنائي كلورو ثنائي هيدروفلوريسئين ثنائي الأسيتات) أو إيزولومينول ، إذا كان الهدف من العمل هو دراسة إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا أو خارج الخلية14،53،54 على وجه التحديد.
يمكن أن تكون القدرة على تصور تفاعلات العدلات والغشاء الحيوي عبر الفحص المجهري مفيدة حول سلوك العدلات والأغشية الحيوية في وجود بعضها البعض. تمثل أطياف الإثارة والانبعاث للأصباغ والبروتينات الفلورية لقطة للتفاعل بين الغشاء الحيوي S. aureus لمدة 18 ساعة والعدلات بعد حضانة مدتها 30 دقيقة. لالتقاط الإشارات بشكل فعال من الخلايا الملطخة ، من المهم الحد من تعرض العينات لمصادر الضوء أثناء إعداد العينات للفحص المجهري. أثناء التصوير ، تم تجنب التبييض الضوئي السريع للعينات عن طريق خفض شدة مصدر الضوء عند ضبط جميع المعلمات مثل ارتفاع Z-stack ووقت التعرض للقنوات المختلفة.
سمحت هذه الممارسات البسيطة بالتصوير المجهري المناسب حيث لوحظ أن عددا قليلا من العدلات موضعية داخل الغشاء الحيوي (الشكل 4 أ). قد يكون هذا بسبب المساحات الموجودة داخل الغشاء الحيوي حيث أن 18 ساعة من S. aureus biofilm المزروعة في MEMα مع 2٪ من الجلوكوز لا تغطي السطح بشكل موحد (الشكل 4B). ومع ذلك ، فقد أظهر استخدام دراسات أخرى للوسائط الغنية عشبا موحدا لنمو الأغشية الحيوية S. aureus والكريات البيض التي تخترق الغشاء الحيوي30,58. علاوة على ذلك ، لوحظ أيضا أنه كان هناك موت لخلايا العدلات بعد 30 دقيقة من الحضانة مع الأغشية الحيوية S. aureus بسبب leukocidins المنتجة من S. aureus biofilm التي تحللالعدلات 58 (الشكل 4A ، D). إضافة خطوة غسيل لإزالة العدلات غير الملتصقة بعد احتضانها بغشاء حيوي لمدة 30 دقيقة إزالة ~ 15٪ من العدلات الميتة من النظام مقارنة بالمجموعة غير المغسولة ، حيث تم إجراء الفحص المجهري مباشرة بعد 30 دقيقة من الحضانة (الشكل 4D). كما لوحظت العدلات التي تتفاعل مع S. aureus (الشكل 4C). هناك حاجة إلى مزيد من التجارب لتقييم ما إذا كانت S. aureus غارقة في العدلات أو متصلة بسطح الخلية من العدلات54. يعد تصوير العدلات والأغشية الحيوية الخطوة الأولى لتقييم العديد من وظائف العدلات في اتجاه مجرى النهر ، مثل البلعمة و NETosis54,59. يمكن أيضا تقييم تأثير العدلات على الأغشية الحيوية من خلال تحديد الكتلة الحيوية للغشاء الحيوي ، والتغيرات الهيكلية للغشاء الحيوي ، وصلاحية الأغشية الحيوية ، من بين أشياء أخرى كثيرة ، باستخدام أدوات تحليل الصور المدرجة في الخطوة 5.6. أخيرا ، يوجد تباين من مانح إلى مانح في العدلات. وبالتالي ، يوصى باستخدام ثلاثة متبرعين مختلفين على الأقل للدراسات التي تنطوي على العدلات.
بشكل عام ، تم الجمع بين المقايسات الموحدة في المختبر لتقييم التفاعلات بين العدلات والأغشية الحيوية. على الرغم من أن هذه المقايسات تستخدم المكورات العنقودية الذهبية ، إلا أنه يمكن بسهولة تكييف البروتوكولات الموصوفة لدراسة مسببات الأمراض الأخرى. في حين أن هناك العديد من النماذج في الجسم الحي لدراسة التفاعلات بين المضيف والممرض ، إلا أنها يمكن أن تكون باهظة الثمن وكثيفة العمالة ، خاصة إذا لم يتم تحسين الظروف. يسمح العمل مع المقايسات الموحدة في المختبر بتحسين الظروف التجريبية وتأكيد الملاحظات قبل الانتقال إلى نظام في الجسم الحي. أخيرا ، تم استخدام نماذج مختلفة للعدوى الحيوانية لدراسة تفاعلات الأغشية الحيوية والعدلات في الجسم الحي. ومع ذلك ، من المهم مراعاة الاختلافات المناعية بين البشر والنماذج الحيوانية60،61،62،63. وهذا يستلزم استخدام العدلات المشتقة من البشر لدراسة هذه التفاعلات المعقدة بين المضيف والممرض.

الغشاء الحيوي الرقيق هو مجتمع من الميكروبات المرتبطة بالسطح أو الركام غير المرتبط المغلف بمادة بوليمرية خارج الخلية (EPS)1,2. تحمي هذه المجتمعات الكائنات الحية الدقيقة المغلفة من الضغوطات البيئية ، بما في ذلك تحمل العوامل المضادة للميكروبات والجهاز المناعي3. تشكل العديد من الأنواع الميكروبية المسببة للأمراض الأغشية الحيوية التي ارتبطت بالعدوى المزمنة4. تطوير الأغشية الحيوية هو عملية معقدة تنطوي على التعلق بالأسطح ، وإنتاج EPS ، وتكاثر الخلايا ، وهيكلة الأغشية الحيوية ، وانفصال الخلية5. بمجرد أن تتشتت الخلايا لتشكل غشاء حيوي، فإنها تظل عوالق أو تنتقل إلى طبقة تحتية جديدة وتعيد بدء تطور الأغشية الحيوية6.
تتبع المكورات العنقودية الذهبية ، وهي ممرض انتهازي ، مخططا عاما لتطور الأغشية الحيوية ، بما في ذلك التعلق والانتشار والنضج والتشتت7. تملي عملية التعلق في الأغشية الحيوية S. aureus من خلال التفاعلات الكارهة للماء ، وأحماض teichoic ، ومكونات السطح الميكروبية التي تتعرف على جزيئات المصفوفة اللاصقة (MSCRAMMs)8,9. مع بدء تكاثر العقدية الذهبية ، يتم إنتاج EPS ، الذي يتكون بشكل أساسي من السكريات والبروتينات والحمض النووي خارج الخلية وأحماض teichoic ،5. أثناء إنتاج مكونات EPS ، يتم أيضا إنتاج العديد من الإنزيمات الخارجية والجزيئات الصغيرة ، مما يساهم في بنية الأغشية الحيوية ثلاثية الأبعاد ويساعد في الانفصال5. تستفيد S. aureus من نمط الحياة المنسق للغاية هذا لإنشاء العديد من الالتهابات المزمنة ، بما في ذلك الالتهابات الناجمة عن سكن الأجهزة الطبية10.
تعد المكورات العنقودية الذهبية المقاومة للميثيسيلين (MRSA) أحد الأسباب الرئيسية للعدوى المتعلقة بالأجهزة الطبية الساكنة ، مثل القسطرة الوريدية والبولية المركزية ، والمفاصل الاصطناعية ، وأجهزة تنظيم ضربات القلب ، وصمامات القلب الميكانيكية ، والأجهزة داخل الرحم11. خلال مثل هذه العدوى ، تكون العدلات هي أول خلايا مناعية مضيفة يتم تجنيدها في موقع العدوى لمكافحة مسببات الأمراض عبر استراتيجيات متعددة12. وتشمل هذه البلعمة ، وإزالة الحبيبات ، وإنتاج أنواع الأكسجين والنيتروجين التفاعلية (ROS / RNS) ، أو إطلاق مصائد العدلات خارج الخلية (NETs) للقضاء على مسببات الأمراض13.
يعد توليد أنواع الأكسجين التفاعلية عند البلعمة من الميكروبات أحد الاستجابات الرئيسية المضادة للميكروبات التي تظهرها العدلات14. تتعزز البلعمة إذا كانت الميكروبات مغلفة بالأوبسونين ، وخاصة الغلوبولين المناعي والمكونات التكميلية الموجودة في المصل15. ثم يتم التعرف على الميكروبات الأوبسونية بواسطة مستقبلات سطح الخلية على العدلات وتبتلعها ، وتشكل حجرة تسمى البلعمة15. تولد العدلات وتطلق أنواع الأكسجين التفاعلية في البلعمة عبر NADPH-oxidase16 المرتبط بالغشاء. يولد مركب الإنزيم متعدد المكونات هذا أنيونات الأكسيد الفائق عن طريق نقل الإلكترونات إلى الأكسجين الجزيئي16. بالإضافة إلى ذلك ، تولد العدلات أيضا RNS من خلال التعبير عن سينسيز أكسيد النيتريك المستحث (iNOS)17. هذه الجذور عالية الأكسيد وأكسيد النيتريك داخل البلعمة لها أنشطة واسعة مضادة للميكروبات. يمكن أن تتفاعل مع المراكز المعدنية في الإنزيمات وتتلف الأحماض النووية والبروتينات والأغشية الخلوية لمسبب المرض18،19،20،21. تتبنى العديد من الميكروبات أسلوب حياة الأغشية الحيوية وتوظف استراتيجيات مختلفة للتهرب من القتل بواسطة ROS22,23. وبالتالي ، فإن المقايسات الموحدة التي تربط الأغشية الحيوية مع العدلات لتحديد أنواع الأكسجين التفاعلية مفيدة للحصول على نتائج متسقة.
في حين أن المقايسات ، مثل تحديد إنتاج ROS العدلات ، توفر معلومات حول استجابات العدلات للأغشية الحيوية ، فإن القدرة على تصور تفاعلات العدلات داخل الأغشية الحيوية يمكن أن تكون أيضا بمثابة أداة قوية. غالبا ما يتطلب استخدام الأصباغ الفلورية للفحص المجهري تحسينا للحصول على صور عالية الجودة يمكن استخدامها لتحليل التصوير المجهري. المرونة لتحسين بعض الظروف محدودة حيث يمكن أن تخضع العدلات لموت الخلايا بعد العزل. علاوة على ذلك ، يتم غسل الأغشية الحيوية عادة لإزالة العوالق من الإعداد التجريبي قبل إضافة العدلات. أثناء الغسيل ، قد ينشأ التباين بين الأغشية الحيوية المكررة بسبب فقدان الكتلة الحيوية الجزئية إذا كانت الأغشية الحيوية ملتصقة بشكل فضفاض بالسطح.
على نطاق واسع ، تشمل الطرق الحالية في هذا المجال لتحليل التفاعلات بين العدلات والأغشية الحيوية بشكل أساسي الفحص المجهري وقياس التدفق الخلوي وتعداد وحدات تشكيل المستعمرات (CFU)24،25،26،27. يتضمن الفحص المجهري استخدام الأصباغ التي إما تلطخ العدلات والأغشية الحيوية مباشرة ، أو تستهدف استجابات العدلات المختلفة ضد الميكروبات مثل تكوين NET ، والتحلل ، وموت الخلايا25,28. يمكن أيضا تحليل مجموعة فرعية من هذه الاستجابات ، مثل موت الخلايا العدلة وتحلل الخلايا ، عن طريق قياس التدفق الخلوي ، ولكنها تتطلب أن تكون العدلات غير مرتبطة بشكل تفضيلي بمجاميع كبيرة من الميكروبات في الغشاء الحيوي28,29. يمكن لقياس التدفق الخلوي أيضا تحديد بعض معلمات الأغشية الحيوية ، مثل صلاحية الخلية27. ومع ذلك ، تتطلب هذه العمليات تعطيل الكتلة الحيوية للغشاء الحيوي ولن تكون مفيدة لتصور تفاعلات مهمة أخرى مثل التوزيع المكاني للعدلات ومكوناتها داخل الغشاء الحيوي27،29،30.
يركز البروتوكول الحالي على تكييف بعض الطرق المستخدمة تقليديا لدراسة تفاعلات العدلات والغشاء الحيوي على الأغشية الحيوية التي تم تحسينها لتوفير الحد الأدنى من التباين أثناء المناولة. وبالتالي يوفر هذا البروتوكول طرقا موحدة لزراعة الأغشية الحيوية وقياسها كميا ، وعزل العدلات البشرية الأولية عن الدم المحيطي ، وتحديد إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية ، وتصور تفاعلات الأغشية الحيوية والعدلات عبر الفحص المجهري. يمكن تكييف هذا البروتوكول مع أنظمة مختلفة لفهم تفاعلات الأغشية الحيوية والعدلات مع مراعاة عدم التجانس بين تجمعات المانحين.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% sodium chloride irrigation, USP</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>2F7124</td>
			<td>Endotoxin-free; Used for isolation of neutrophils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mL rapid-flow filter unit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>565-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 proof ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89125-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td>Used for blood draw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td>Used for blood draw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1423-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swab</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>Used for blood draw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band-aids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for blood draw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Bacto Tryptic Soy Broth</td>
			<td>BD</td>
			<td>DF0370-07-5</td>
			<td>Combine with 1.5% agar to make Tryptic Soy Agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Bal Saupply</td>
			<td>202C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker blue CMCH</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C2111</td>
			<td>Blue CMAC Dye (BCD)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear bottom 96-well flat bottom polystyrene plates</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton gauze</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-761-52</td>
			<td>Used for blood draw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet</td>
			<td>Acros Organic</td>
			<td>40583-0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14-961-27</td>
			<td>Borosilicate Glass 13 x 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G-8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran from Leuconostoc spp.</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>31392-250G</td>
			<td>Used for isolation of neutrophils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (DPBS) 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium homodimer-1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224 B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque plus</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17144003</td>
			<td>Used for isolation of neutrophils (density gradient medium)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; balanced salt solution (HBSS) 1x</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>21-022-CV</td>
			<td>without calcium, magnesium, and phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Bright Line</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Novaplus</td>
			<td>NDC 63323-540-57</td>
			<td>1000 USP units/mL, Used for blood draw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMARIS 9.8</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8511-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimal essential media (MEM) Alpha 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41061-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle (23 G1)</td>
			<td>BD</td>
			<td>305145</td>
			<td>Used for blood draw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti2</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Quantification of dead neutrophils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal human serum</td>
			<td>Complement Technology</td>
			<td>NHS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish (100 x 15 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4707-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP358-10</td>
			<td>Used for neutrophil isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SoftMax Pro Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Microplate reader software used for data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax i3x</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water for irrigation, USP</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>2F7114</td>
			<td>Endotoxin-free; Used for neutrophil isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surflo winged infusion set</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SC*19BLK</td>
			<td>19 G x 3/4&#34;, used for blood draw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain (0.4%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turnicate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for blood draw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White opaque 96-well plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353296</td>
			<td>Tissue culture treated and flat bottom plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;-Slide VI 0.4</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80601</td>
			<td>&#956;-channel slide</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standardized in vitro assays to visualize and quantify interactions between human neutrophils and staphylococcus aureus biofilms

العدلات هي خط الدفاع الأول الذي ينشره الجهاز المناعي أثناء العدوى الميكروبية. في الجسم الحي ، يتم تجنيد العدلات إلى موقع العدوى حيث تستخدم عمليات مثل البلعمة ، وإنتاج الأكسجين التفاعلي وأنواع النيتروجين (ROS ، RNS ، على التوالي) ، NETosis (مصيدة العدلات خارج الخلية) ، وإزالة التحلل لقتل الميكروبات وحل العدوى. تمت دراسة التفاعلات بين العدلات والميكروبات العوالق على نطاق واسع. كانت هناك اهتمامات ناشئة في دراسة العدوى التي تسببها الأغشية الحيوية في السنوات الأخيرة. تظهر الأغشية الحيوية خصائص ، بما في ذلك تحمل القتل بواسطة العدلات ، متميزة عن نظيراتها المزروعة بالعوالق. مع الإنشاء الناجح لكل من نماذج الأغشية الحيوية في المختبر وفي الجسم الحي ، يمكن الآن التحقيق في التفاعلات بين هذه المجتمعات الميكروبية مع الخلايا المناعية المختلفة. هنا ، تم تصميم التقنيات التي تستخدم مزيجا من نماذج الأغشية الحيوية التقليدية ومقايسات نشاط العدلات الراسخة خصيصا لدراسة تفاعلات العدلات والأغشية الحيوية. يستخدم المجهر الفلوري واسع المجال لمراقبة توطين العدلات في الأغشية الحيوية. تزرع هذه الأغشية الحيوية في ظروف ثابتة ، تليها إضافة العدلات المشتقة من الدم المحيطي البشري. يتم تلطيخ العينات بالأصباغ المناسبة قبل التصور تحت المجهر. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تحديد إنتاج ROS ، وهو أحد استجابات العدلات العديدة ضد مسببات الأمراض ، في وجود غشاء حيوي. ستؤدي إضافة الخلايا المناعية إلى هذا النظام القائم إلى توسيع فهم التفاعلات بين المضيف ومسبب المرض مع ضمان استخدام الظروف الموحدة والمحسنة لقياس هذه العمليات بدقة.

تؤثر الوسائط المستخدمة لزراعة الأغشية الحيوية البكتيرية على بقاء العدلات. تم اختبار وسائط مختلفة لتقليل تأثير الوسائط وحدها على صلاحية العدلات لدراسة تفاعلات العدلات والغشاء الحيوي (الشكل 1). تقلل وسائط النمو البكتيري مثل Tryptic Soy Broth من صلاحية العدلات ، بحيث ~ 60٪ من العدلات على قيد الحياة بعد فترة حضانة مدتها 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2. لا تؤثر وسائط زراعة خلايا الثدييات ، مثل MEMα ، على صلاحية العدلات وتدعم نمو الأغشية الحيوية S. aureus. في الواقع ، يعزز الحد الأدنى من الوسائط النمو القوي للأغشية الحيوية في البكتيريا الأخرى46,47.
لتقييم تأثير الوسائط على نمو الأغشية الحيوية والتباين في تحديد كمية الكتلة الحيوية للغشاء الحيوي بعد غسل الكتلة الحيوية للقضاء على الخلايا العوالق ، تم زراعة غشاء حيوي S. aureus لمدة 18 ساعة في صفيحة مكونة من 96 بئرا ، مع معالجة الآبار أو معالجتها باستخدام poly-L-Lysine. تم استخدام وسائط غنية بالمغذيات (مرق الصويا التربتيك (TSB)) والحد الأدنى (MEMα) كما هي أو مكملة بجلوكوز 2٪. كشفت الكتلة الحيوية للغشاء الحيوي الملطخة بالسيرة الذاتية أن الغشاء الحيوي S . aureus المزروع في MEMα المكمل بجلوكوز 2٪ أنتج الغشاء الحيوي الأقوى بين جميع الوسائط المختبرة (الشكل 2 أ). علاوة على ذلك ، أظهرت الأغشية الحيوية المزروعة في آبار PLL المعالجة مسبقا التي تحتوي على MEMα + 2٪ جلوكوز تباينا أقل من الأغشية الحيوية في الآبار غير المعالجة التي تحتوي على MEMα + 2٪ جلوكوز. أظهرت هذه الأغشية الحيوية تباينا أقل في القياس الكمي عبر مقايسة CV35 و CFU / mL عند طلائها بعد التعامل بدقة مع الأغشية الحيوية لتحديد كمية الكتلة الحيوية. تحتوي هذه الأغشية الحيوية ، في المتوسط ، على 1 × 108 CFU / مل ، كما يتضح من طلاء الأغشية الحيوية في 3 أيام منفصلة (الشكل 2B). هذا الرقم مفيد في تحديد عدد العدلات التي يجب إضافتها إلى الأغشية الحيوية لمقايسات وظائف العدلات.
لقياس إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية بواسطة العدلات استجابة للأغشية الحيوية ، تمت زراعة الأغشية الحيوية S. aureus بشكل ثابت لمدة 18-20 ساعة في لوحة 96 بئرا. ثم تم استخدام الأغشية الحيوية ، وأضيفت العدلات. ثم تم قياس إنتاج ROS لمدة 60 دقيقة (الشكل 3 أ). يتم حساب المساحة الموجودة أسفل المنحنى من المنحنى الحركي لتحديد إجمالي إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية بواسطة العدلات. تظهر العدلات المعالجة بناهض ، مثل PMA ، المستخدمة كعنصر تحكم ، زيادة في إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية. في غياب الأغشية الحيوية ، أظهرت العدلات المعالجة ب PMA إنتاجا قويا لأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS). في وجود S. aureus biofilm ، انخفض إجمالي إنتاج ROS بواسطة العدلات المعالجة ب PMA. في غياب PMA ، تعتمد العدلات فقط على تفاعلها مع الغشاء الحيوي ، مما يقلل من كمية أنواع الأكسجين التفاعلية المنتجة (الشكل 3 ب).
لتصور تفاعلات العدلات والغشاء الحيوي باستخدام المجهر الفلوري ، تم استخدام سلالة معبرة عن GFP من S. aureus وصبغة Blue CMAC و ethidium homodimer-1 ، التي تلطخ سيتوبلازم الخلايا الحية والحمض النووي للخلايا الميتة ، على التوالي. نمت S. aureus biofilm لمدة 18 ساعة في شريحة 6 μ القنوات. تمت إضافة العدلات الزرقاء ذات العلامات الصبغية CMAC جنبا إلى جنب مع إيثيديوم هوموديمر-1 إلى الأغشية الحيوية المغسولة وتم تحضينها لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 قبل التصوير. كشف الفحص المجهري الفلوري واسع المجال أن العديد من العدلات كانت موضعية على سطح الأغشية الحيوية S. aureus ، في حين أن القليل منها موجود داخل الغشاء الحيوي (الشكل 4 أ). كان التفاعل بين خلايا المكورات العنقودية الذهبية داخل العدلات واضحا أيضا (الشكل 4C). كانت معظم خلايا S. aureus التي تتفاعل مع العدلات (سماوي) ميتة (أرجوانية) ، بينما بقي عدد قليل منها على قيد الحياة (أصفر) كما هو محدد من خلال تلطيخ الأحياء والموتى (الشكل 4C). وعلى سبيل المقارنة، كانت الأغشية الحيوية المكورات العنقودية الذهبية المعبرة عن GFP ملطخة بإيثيديوم هوموديمر-1، والتي كشفت عن جزء صغير من أعداد المكورات العنقودية الذهبية الميتة داخل الأغشية الحيوية (الشكل 4 ب). تم قياس العدلات غير القابلة للحياة التي كانت إيجابية ل ethidium homodimer-1 باستخدام برنامج التحليل (انظر جدول المواد) بعد الحضانة مع الأغشية الحيوية S. aureus. ما يقرب من 48 ٪ من العدلات قد ماتت بالفعل في غضون 30 دقيقة من الحضانة مع S. aureus biofilm. أثناء تحسين بروتوكول الفحص المجهري ، تم أيضا تقييم تأثير غسل الأغشية الحيوية والعدلات بعد 30 دقيقة من الحضانة لإزالة العدلات غير الملتصقة ، مما كشف عن حوالي 33٪ من العدلات الميتة التي لا تزال مرتبطة بالغشاء الحيوي (الشكل 4 د).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63773/63773fig1v2.jpg"> الشكل 1: يقارن اختبار LIVE-DEAD بقاء العدلات بين وسائط النمو البكتيرية والثدييات. تم عزل العدلات وحضنها في HBSS أو MEMα أو TSB أو 0.1٪ SDS لمدة 30 دقيقة. تم إجراء تلطيخ LIVE-DEAD باستخدام Calcein AM (حي) وإيثيديوم هوموديمر -1 (ميت). تم تحديد النسبة المئوية للعدلات الحية ، حيث تم التعامل مع العدلات المحتضنة HBSS على أنها عدلات حية بنسبة 100٪. تمثل النتائج في المتوسط تجربتين مستقلتين تم إجراؤهما في ثلاث نسخ ، مع العدلات التي تم الحصول عليها من متبرعين مختلفين. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± SD (* p < 0.05 ، ****p < 0.0001. اتجاه واحد ANOVA). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63773/63773fig01large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63773/63773fig02.jpg"> الشكل 2: القياس الكمي للكتلة الحيوية للأغشية الحيوية في ظروف مختلفة وعدد الصلاحية البكتيرية للأغشية الحيوية المزروعة في الظروف المثلى. (أ) تم زرع S. aureus في صفيحة مكونة من 96 بئرا إما مطلية أو غير مطلية ببولي L-Lysine (PLL). نمت الأغشية الحيوية في TSB أو MEMα أو أي من الوسائط المكملة بجلوكوز 2٪ في ظل ظروف ثابتة لمدة 18 ساعة. تم إجراء تلطيخ الكريستال البنفسجي (CV) لتلطيخ الكتلة الحيوية للغشاء الحيوي. تم تخفيف وصمة عار السيرة الذاتية في الساعة 1:10 وقراءتها في قارئ الصفيحة الدقيقة. تمثل النتائج في المتوسط ثلاث تجارب مستقلة أجريت في ثلاث نسخ. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± SD. يظهر SD لكل مجموعة في الأسفل لإظهار تباين ظروف نمو الأغشية الحيوية المختلفة. (ب) تم الحصول على عدد CFU البكتيري من الأغشية الحيوية المزروعة في وسط محسن (MEMα + 2٪ جلوكوز). تم إخضاع الأغشية الحيوية الثابتة لمدة 18 ساعة لنفس العدد من عمليات الغسيل متبوعة بصوتنة لمدة 10 دقائق لتخفيف الكتلة الحيوية للغشاء الحيوي وتمريرها عبر إبرة 22G لتعطيل الركام قبل الطلاء. تمثل النتائج ثلاث نسخ مكررة يتم إجراؤها في ثلاث نسخ. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± SD (ns = غير مهم. اتجاه واحد ANOVA). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63773/63773fig02large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63773/63773fig03.jpg"> الشكل 3: القياس الكمي لإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية بواسطة العدلات عن طريق مقايسة التلألؤ الكيميائي. (أ) تم تحضين العدلات (PMN) بأغشية حيوية S. aureus المغسولة HBSS (BF) إما في وجود (مثلث رمادي مغلق) أو غياب (مثلث رمادي مقلوب مفتوح) ل PMA لقياس إنتاج ROS بواسطة العدلات. تم استخدام Luminol للكشف عن ROS كل 3 دقائق لمدة 60 دقيقة في قارئ microplate. في حين أن العدلات التي عولجت ب PMA في غياب الأغشية الحيوية (الدائرة السوداء المغلقة) كانت بمثابة عنصر تحكم إيجابي ، فإن مجموعات العدلات فقط (الدائرة السوداء المفتوحة) والأغشية الحيوية فقط (المثلث الرمادي المفتوح) كانت بمثابة عناصر تحكم سلبية. تمثل البيانات في المتوسط تجربتين مستقلتين تم إجراؤهما في ثلاث نسخ مع العدلات التي تم الحصول عليها من متبرعين مختلفين. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± SD. (ب) تم حساب المساحة تحت المنحنى من (A) لتحديد إجمالي ROS الناتج عن العدلات. يتم تمثيل البيانات كمتوسط ± SD. (***p < 0.0001. اتجاه واحد ANOVA). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63773/63773fig03large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63773/63773fig04.jpg"> الشكل 4: تصور التفاعل بين الغشاء الحيوي للمكورات العنقودية الذهبية والعدلات باستخدام المجهر الفلوري واسع المجال. تم استكمال العدلات الزرقاء CMAC ذات العلامات الصبغية (السماوي) بإيثيديوم هوموديمر -1 (أرجواني ؛ ميت) قبل الحضانة بغشاء حيوي S. aureus 18 ساعة (أصفر). تم تصوير تفاعلات الأغشية الحيوية والعدلات باستخدام المجهر الفلوري واسع المجال ومعالجة الصور باستخدام برنامج تحليل الصور. أجريت التجارب مع ثلاثة متبرعين مختلفين. يتم تقديم الصور التمثيلية على النحو التالي: (أ) عرض ثلاثي الأبعاد ل S. aureus biofilm مع العدلات الحية (السماوية) والميتة (أرجواني ؛ يشار إلى عدد قليل منها بأسهم بيضاء) ، (B) منظر ثلاثي الأبعاد لغشاء حيوي S. aureus في حالة عدم وجود عدلات مع S. aureus الحية التي تعبر عن GFP (الأصفر) أو الميتة S. aureus ملطخة بإيثيديوم هوموديمر -1 (أرجواني) ، (C) منظر متعامد للمكورات العنقودية الذهبية وتفاعل العدلات كما هو موضح في المستويات xy و yz و xz ، و (D) القياس الكمي لصلاحية العدلات في وجود الأغشية الحيوية S. aureus بعد 30 دقيقة إما على الفور (غير مغسولة) أو بعد ثلاث جولات من الغسيل باستخدام HBSS لإزالة العدلات غير الملتصقة (المغسولة). يتم تقديم موت خلايا العدلات كمتوسط ± SD (اختبار t للطالب). يشير شريط المقياس إلى 50 ميكرومتر في (A) و (B) و 10 ميكرومتر في (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63773/63773fig04large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Standardized In vitro Assays to Visualize and Quantify Interactions between Human Neutrophils and Staphylococcus aureus Biofilms at JoVE.com

Standardized In vitro Assays to Visualize and Quantify Interactions between Human Neutrophils and Staphylococcus aureus Biofilms

يصف هذا البروتوكول دراسة تفاعلات العدلات والغشاء الحيوي. يتم إنشاء الأغشية الحيوية للمكورات العنقودية الذهبية في المختبر ويتم تحضينها بعدلات بشرية مشتقة من الدم المحيطي. يتم تحديد استجابة الانفجار التأكسدي من العدلات ، ويتم تحديد توطين العدلات داخل الغشاء الحيوي بواسطة الفحص المجهري.

فحوصات موحدة في المختبر لتصور وتحديد التفاعلات بين العدلات البشرية والمكورات العنقودية الذهبية الأغشية الحيوية

Neutrophils are the first line of defense deployed by the immune system during microbial infection. In vivo, neutrophils are recruited to the site of ...

تم تصميم هذه البروتوكولات لفهم كيفية تفاعل العدلات البشرية مع الأغشية الحيوية البكتيرية وقتلها. الهدف هو فهم هذا بشكل أفضل ، والحد من التباين من الفحص إلى الفحص ، مع فهم أن هناك مشكلات متأصلة في العدلات البشرية من المانح إلى المانح. تم تحسين التقنيات المدرجة هنا للسماح للمستخدمين بإجراء تجارب بأقل قدر من التباين ، خاصة مع الأغشية الحيوية المرفقة بشكل فضفاض.بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضا تكييف هذه البروتوكولات لدراسة الميكروبات الأخرى التي يمكن أن تشكل الأغشية الحيوية. ابدأ بالحصول على مستعمرات معزولة من المكورات العنقودية الذهبية من مخزون محفوظ بالتبريد باستخدام تقنية لوحة مخططة على صفيحة أجار غنية بالمغذيات ، مثل أجار الصويا التربتيكي. قم بتغطية الآبار الفردية للوحة 96 بئرا ب 100 ميكرولتر من PLL المخفف في ماء معقم واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.قم بشفط محلول PLL بشكل معقم باستخدام مصيدة شفط بمساعدة الفراغ. اترك الآبار تجف طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. قم بإعداد مزرعة ليلية عن طريق تلقيح مستعمرة من S.aureus في MEM-alpha مكملة ب 2٪ جلوكوز وحضنت عند 37 درجة مئوية لمدة 16 إلى 18 ساعة بمعدل 200 دورة في الدقيقة.تمييع الثقافة بين عشية وضحاها عن طريق نقل 50 ميكرولتر إلى خمسة ملليلتر من MEM-alpha الطازجة تستكمل مع 2 ٪ الجلوكوز. ثم احتضانها عند 37 درجة مئوية بمعدل 200 دورة في الدقيقة حتى يتم تحقيق المرحلة اللوغاريتمية المتوسطة. استخدم MEM-alpha لتطبيع الثقافة اللوغاريتمية المتوسطة إلى OD 0.1.انقل 150 ميكرولترا من الثقافة الطبيعية إلى كل بئر من صفيحة 96 بئرا المعالجة ب PLL. احتضان اللوحة في غرفة مرطبة عند 37 درجة مئوية لمدة 18 إلى 20 ساعة. نضح الطاف لإزالة الخلايا العوالق.اغسل الكتلة الحيوية المتبقية برفق باستخدام 150 ميكرولتر من HBSS لإزالة الخلايا غير المرفقة. كرر مرتين على الأقل لإزالة جميع خلايا العوالق. أضف 100 ميكرولتر من مصل بشري طبيعي بنسبة 20٪ مخفف في HBSS بالتنقيط إلى الغشاء الحيوي المغسول واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لامتصاص الغشاء الحيوي.استنشاق محلول المصل وغسل الأغشية الحيوية بالتنقيط باستخدام 150 ميكرولتر من HBSS. نضح HBSS ، تاركا وراءه آبارا ذات أغشية حيوية أوبسونية. أضف اللومينول إلى العدلات المعاد تعليقها في HBSS لتكوين تركيز نهائي من خمسة ميكرومولار لومينول.هذا الحل جاهز للاستخدام للمجموعتين A و C.أضف العدلات الممزوجة باللومينول إلى الآبار مع الأغشية الحيوية الأوبسونية. بالنسبة للمجموعة D ، قم بإعداد 50 محلول لومينول ميكرومولار في HBSS في أنبوب منفصل بدون أي عدلات ، وأضفه إلى البئر الذي يحتوي على الغشاء الحيوي. حصة 350 ميكرولتر من العدلات الممزوجة مع اللومينول وإضافة PMA بتركيز نهائي قدره 500 نانوجرام لكل ملليلتر إلى الخليط.بالنسبة للمجموعة (ب)، أضف العدلات من هذا الخليط إلى آبار بدون غشاء حيوي. هذا بمثابة السيطرة الإيجابية. جهاز طرد مركزي للوحة عند 270 RCF لمدة 30 ثانية عند أربع درجات مئوية.تأكد من ضبط قارئ اللوحة على 37 درجة مئوية ، وقراءة التلألؤ والحركية لمدة 60 دقيقة بفواصل زمنية مدتها ثلاث دقائق. ضع اللوحة في قارئ اللوحة لقياس إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية بواسطة العدلات لمدة 60 دقيقة. استخدم سلالة فلورية من S.aureus ، مثل USA300 ، للتعبير عن GFP لتسهيل التصوير المجهري.احتضان العدلات مع 100 micromolar BCD لمدة 30 دقيقة في الروك عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون في الغلاف الجوي. تأكد من تحضين العينات في الظلام ، والحد من التعرض للضوء. لغسل BCD الزائد ، العدلات الطرد المركزي في 270 RCF لمدة خمس دقائق ، واستنشاق الطاف.أعد تعليق العدلات في HBSS الطازجة. ثم أضف إيثيديوم هوموديمر-1 إلى العدلات الملطخة ب BCD بتركيز نهائي يبلغ أربعة ميكرومولار لمراقبة العدلات والموت البكتيري. اغسل الغشاء الحيوي الرقيق باستخدام HBSS وأضف 150 ميكرولترا من العدلات إلى الغشاء الحيوي S.aureus الذي نما في شرائح صغيرة.احتضان الشرائح الصغيرة في غرفة مرطبة لمدة 30 دقيقة. سيعتمد عدد الخلايا البكتيرية على عدد الخلايا التي تم الحصول عليها من طلاء الأغشية الحيوية لمدة 18 ساعة. تخيل تفاعل الأغشية الحيوية للعدلات باستخدام قنوات الفلورسنت المقابلة للأصباغ الفلورية ، أو الأطوال الموجية لإثارة البروتينات وانبعاثاتها.قللت وسائط النمو البكتيري من صلاحية العدلات إلى حوالي 60٪ بعد 30 دقيقة من فترة الحضانة. ومع ذلك ، لم تؤثر وسائط زراعة خلايا الثدييات على صلاحية العدلات ، ويمكن أن تدعم أيضا نمو الأغشية الحيوية S.aureus. أظهرت العدلات المعالجة ب PMA المستخدمة كعنصر تحكم زيادة في إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية.في غياب الأغشية الحيوية ، أظهرت العدلات المعالجة ب PMA إنتاجا قويا لأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS). في وجود S.aureus biofilm ، انخفض إجمالي إنتاج ROS بواسطة العدلات المعالجة ب PMA ، بينما في غياب PMA ، اعتمدت العدلات فقط على تفاعلها مع الغشاء الحيوي ، مما قلل من إنتاج ROS. كشف المجهر الفلوري واسع المجال أن العديد من العدلات كانت موضعية على السطح بينما كان القليل منها داخل الأغشية الحيوية S.aureus.ماتت معظم خلايا S.aureus التي تتفاعل مع العدلات ، بينما بقي عدد قليل منها على قيد الحياة كما هو محدد من خلال تلطيخ LIVE / DEAD. كشفت الأغشية الحيوية الملطخة ب Ethidium homodimer-1 عن جزء صغير من مجموعة S.aureus الميتة داخل الغشاء الحيوي. كشف تأثير غسل الغشاء الحيوي والعدلات بعد 30 دقيقة من الحضانة لإزالة العدلات غير الملتصقة أن حوالي 33٪ من العدلات الميتة لا تزال مرتبطة بالغشاء الحيوي.يمكن أيضا استخدام البروتوكولات المدرجة هنا لمزيد من الدراسة للوظائف الأخرى للعدلات ، مثل البلعمة ، وتشكيل مصائد العدلات خارج الخلية عندما تواجه العدلات الأغشية الحيوية.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Standardized In vitro Assays to Visualize and Quantify Interactions between Human Neutrophils and Staphylococcus aureus Biofilms

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA)

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus MRSA

تحت الجلد من العدوى المكورات العنقودية المذهبة المقاومة للميثيسيلين (MRSA)

MRSA is a worldwide threat to public health, and MRSA skin and soft-tissue infections now account for more than half of all soft-tissue infections in the ...

Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in Rat

Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus MRSA in Rat

نموذج تجريبي من التهاب الشغاف مقاومة مثسلين<em&gt; المكورات العنقودية الذهبية</em&gt; (MRSA) في الجرذ

Endovascular infections, including endocarditis, are life-threatening infectious syndromes1-3. Staphylococcus aureus is the most common world-wide cause ...

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

المكورات العنقودية الذهبية النمو باستخدام الهيموجلوبين الإنسان باعتبارها المصدر الحديد

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

دراسة تفاعلات<em&gt; المكورات العنقودية الذهبية</em&gt; مع العدلات بواسطة التدفق الخلوي والوقت الفاصل بين المجهري

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

رواية<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج لدراسة التفاعلات بين الدم الكامل الإنسان والبطانة Endothelium

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

عالية الإنتاجية قياس خارج الخلية DNA الإصدار والكمي NET تشكيل في العدلات الإنسان<em&gt; في المختبر</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

استهداف بيوفيلم أسوشيتد<em&gt; المكورات العنقودية الذهبية</em&gt; استخدام ريسازورين استنادا الفحص المخدرات-القابلية

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

التنميط الجيني ل<em&gt; المكورات العنقودية الذهبية</em&gt; من جانب خاص بالريبوسوم فاصل PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

منهجية لدراسة نقل أفقي جين في<em&gt; المكورات العنقودية الذهبية</em

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to ...

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

نموذج الماوس لتقييم الفطرية الاستجابة المناعية للعدوى المكوّرات العنقودية الذهبية

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...