Name: standardized in vitro assays to visualize and quantify interactions between human neutrophils and staphylococcus aureus biofilms
Uploaded: 2022-06-08T14:00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Standardized In vitro Assays to Visualize and Quantify Interactions between Human Neutrophils and Staphylococcus aureus Biofilms at JoVE.com

Dit werk werd gefinancierd door het National Institute of Allergy and Infectious Diseases (R01AI077628) aan DJW en een American Heart Association Career Development Award (19CDA34630005) aan ESG. We danken Dr. Paul Stoodley voor het verstrekken van USA 300 LAC GFP-stam. Bovendien erkennen we bronnen van de Campus Microscopy and Imaging Facility (CMIF) en het OSU Comprehensive Cancer Center (OSUCCC) Microscopy Shared Resource (MSR), de Ohio State University. We bedanken ook Amelia Staats, Peter Burback en Lisa Coleman van het Stoodley-lab voor het uitvoeren van bloedafnames.

Alle procedures zijn goedgekeurd door de Ohio State University Institutional Review Board (IRB) (2014H0154). Geïnformeerde schriftelijke toestemming werd verkregen van alle donoren voor het verzamelen van perifeer bloed om primaire menselijke neutrofielen te isoleren. Staphylococcus aureus (USA300 LAC)31 werd gebruikt als modelorganisme voor het uitvoeren van de experimenten. De experimenten werden uitgevoerd met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) vanwege mogelijke blootstelling aan een door bloed overgedragen pathogeen.
1. Bereiding van in vitro biofilm
<ol><li>Verkrijg geïsoleerde kolonies van S. aureus uit een gecryopreserveerde stam31 met behulp van een streepplaattechniek32,33 op een voedingsrijke agarplaat, zoals Tryptic Soy Agar (zie Tabel van materialen).</li>
	<li>Bedek individuele putten van een 96-wells plaat met 100 μL van 0,001% (v /v) poly-L-Lysine (PLL) verdund in steriel H2O en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Aspirateer de PLL-oplossing aseptisch met behulp van een vacuümondersteunde aspiratieval. Laat de putjes een nacht op kamertemperatuur drogen. OPMERKING: Alle aspiratiestappen in het protocol worden uitgevoerd met behulp van een vacuümondersteunde aspiratieval, tenzij anders vermeld.</li>
	<li>Bereid een nachtkweek voor door een kolonie S. aureus in te enten in minimaal essentiële media alfa (MEMα) aangevuld met 2% glucose en incubeer bij 37 °C, schudden bij 200 tpm gedurende 16-18 uur.</li>
	<li>Verdun de nachtcultuur door 50 μL over te brengen naar 5 ml verse MEMα aangevuld met 2% glucose en incubeer bij 37 °C, schuddend bij 200 tpm, tot halverwege de logaritmische fase, meestal tussen optische dichtheid 600 (OD600nm) van 0,5-0,8. Gebruik MEMα om de mid-logaritmische cultuur te normaliseren tot een OD600nm van 0,1.</li>
	<li>Breng 150 μL genormaliseerde cultuur over naar elk putje van de met PLL behandelde 96-well plaat. Incubeer statisch gedurende 18-20 uur in een bevochtigde kamer bij 37 °C. OPMERKING: De biofilms kunnen ook in andere formaten worden gekweekt, zoals μ-kanaals dia's (zie Materiaaltabel).</li>
	<li>Aspirateer het supernatant om de planktoncellen te verwijderen. Was de resterende biomassa voorzichtig met 150 μL Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) om de niet-vastgemaakte cellen te verwijderen. Voeg HBSS druppelsgewijs toe om te voorkomen dat de biofilm wordt verstoord. OPMERKING: Laat tijdens het aanzuigen van het supernatant en HBSS tijdens het wassen net genoeg vloeistof (supernatant of HBSS) achter in de putten die biofilm bevatten, zodat de biofilm nog steeds wordt ondergedompeld. Dit voorkomt de verstoring van de biofilmstructuur wanneer HBSS druppelsgewijs wordt toegevoegd om de biofilm te wassen.</li>
	<li>Herhaal stap 1.6 nog minstens twee keer om alle planktoncellen te verwijderen. Op dit punt zijn biofilms klaar voor onmiddellijke downstream-experimenten. OPMERKING: Als de biofilms niet worden gebruikt voor neutrofiele experimenten, kan HBSS worden vervangen door fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). HBSS heeft de voorkeur boven PBS omdat HBSS componenten bevat, waaronder glucose, die optimale omstandigheden bieden voor neutrofielenactivering34.</li>
</ol>2. Kwantificering van biofilmbiomassa
<ol><li>Bereid een voorraad van 0,1% (w/v) Crystal Violet (CV) oplossing (zie Materiaaltabel) door op te lossen in 20% (v/v) ethanol en 80% (v/v) H2O. Zorg ervoor dat het CV volledig is opgelost in ethanol voordat u H2O toevoegt. Filter-steriliseer de oplossing.</li>
	<li>Voeg 150 μL 0,1% CV-oplossing toe aan de gewassen biofilm en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Gebruik ten minste drie lege putjes als besturingselementen voor alleen media.</li>
	<li>Haal de 0,1% CV-oplossing uit de biofilms en was de gekleurde biofilms met 200 μL 1x PBS. Herhaal dit proces voor een totaal van drie wasbeurten om overtollig CV uit de putten te verwijderen.</li>
	<li>Voeg 150 μL 33% (v/v) ijsazijn verdund met H2O. Incubeer bij kamertemperatuur op een rocker bij 50 rpm gedurende 30 minuten om het CV gebonden aan de biomassa volledig te laten oplossen. LET OP: Voer deze stap uit in een laminaire stromingskap met geschikte PBM's, omdat ijsazijn een corrosieve chemische stof is.</li>
	<li>Stel in de tussentijd de microplaatlezer in (zie Materiaaltabel) om de CV-vlekwaarden af te lezen. Na een behandeling met ijsazijn, lees de plaat af op een golflengte van 595 nm. OPMERKING: De golflengte die wordt gebruikt om de OD van CV te meten, kan variëren van 500-600 nm35.</li>
</ol>3. Neutrofielen isolatie
OPMERKING: Neutrofielen werden geïsoleerd volgens een eerder gepubliceerde methode met kleine veranderingen36. Dit isolatieprotocol combineert eerst dichtheidsgradiëntcentrifugatie, gevolgd door 3% dextran sedimentatie. Deze sectie behandelt alleen het algemene neutrofielenisolatieprotocol, met de nadruk op de wijzigingen die in het gepubliceerde protocol zijn aangebracht. Bovendien is het onderstaande protocol een van de vele methoden die neutrofielen kunnen isoleren en indien nodig kunnen worden vervangen. Andere methoden voor het isoleren van neutrofielen omvatten het gebruik van celscheidingsmedia of magnetische antilichaamcelscheiding37.
<ol><li>Neem bloed af van een volwassen donor via venapunctie, volgens het protocol dat is uiteengezet in de institutionele IRB. Zorg er voorafgaand aan de bloedafname voor dat de spuit voldoende conserveermiddelvrije heparine bevat, zodat de uiteindelijke concentratie heparine 20 E / ml is.</li>
	<li>Verdun het gehepariniseerde bloed met 3/4 van het volume endotoxinevrij 0,9% NaCl (zie Materiaaltabel) in H2O bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Voor elke 20 ml van het verdunde bloedmonster, aliquot 14 ml van een in de handel verkrijgbaar dichtheidsgradiëntmedium (zie materiaaltabel) in een verse conische buis van 50 ml. Leg het verdunde bloedmonster voorzichtig op het dichtheidsgradiëntmedium.</li>
	<li>Centrifugeer het gelaagde bloedmonster bij 400 x g gedurende 40 minuten bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat de centrifuge een langzame breuk heeft om te voorkomen dat de laag wordt verstoord zodra de centrifugatie is voltooid. OPMERKING: Het bloedmonster heeft vijf lagen met een mengsel van zoutoplossing en plasma, een mononucleaire cellaag, dichtheidsgradiëntmedium, neutrofielen en erytrocyten.</li>
	<li>Aspirateer met behulp van een serologische pipet alle lagen boven de neutrofielen en erytrocytenkorrel, gevolgd door een zachte resuspensie van de pellet in koud endotoxinevrij 0,9% NaCl in H2O. Voor elke pellet die wordt gegenereerd uit een bloedmonster van 20 ml, resuspenseert u de pellet terug tot een totaal volume van 20 ml. Voeg 1:1 volume van 3% dextran toe (zie Materiaaltabel). Incubeer de buis rechtop gedurende 18-20 minuten op ijs. OPMERKING: Zorg ervoor dat de 3% dextran is gemaakt met endotoxine-vrije 0,9% NaCl in H2O.</li>
	<li>Verwijder 20 ml van de bovenste laag die neutrofielen en sommige erytrocyten bevat op een nieuwe conische buis van 50 ml en centrifugeer deze bij 355 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Giet het supernatant af en laat een rode pellet achter.</li>
	<li>Resuspenseer de pellet voorzichtig in 10 ml koude, steriele H2O gedurende 30 s om de resterende erytrocyten te lyseren. Voeg onmiddellijk 10 ml koude endotoxinevrije 0,9% zoutoplossing toe aan het mengsel om de toniciteit te herstellen. Centrifugeer de oplossing bij 233 x g gedurende 3 min bij 4 °C.</li>
	<li>Giet het supernatant af en resuspendeer de pellet met 95% -97% neutrofielen in 1 ml koude HBSS per 20 ml van het bloedmonster.</li>
	<li>Breng 10 μL van de geresuspendeerde neutrofielen over in 90 μL van 0,4% trypanblauwe uitsluitingskleurstof en tel de cellen met behulp van een hemocytometer (zie Materiaaltabel). OPMERKING: Niet-levensvatbare cellen zijn blauw gekleurd omdat trypanblauwe uitsluitingskleurstof ondoordringbaar is in levensvatbare cellen. Dit protocol biedt >99% cel levensvatbaarheid37,38.</li>
	<li>Voeg extra HBSS toe zodat de uiteindelijke concentratie neutrofielen 4 x 106 cellen / ml is. OPMERKING: Voor gevallen met <99% cel levensvatbaarheid, kan de uiteindelijke concentratie van 4 x 106 cellen / ml nog steeds worden bereikt; het totale volume van de verkregen oplossing met 4 x 106 cellen/ml zal echter afnemen. De uiteindelijke concentratie neutrofielen kan worden aangepast aan de experimentele behoeften van de gebruiker. De neutrofielen werden geresuspendeerd met een eindconcentratie van 4 x 106 cellen / ml voor alle hieronder beschreven experimenten. Om rekening te houden met de variabiliteit tussen donoren, wordt het ten zeerste aanbevolen om alle experimenten met neutrofielen uit te voeren met ten minste drie verschillende donoren.</li>
</ol>4. Meting van ROS geproduceerd door neutrofielen
<ol><li>Voeg druppelsgewijs 100 μL 20% normaal humaan serum (verdund in HBSS) toe aan de gewassen biofilm (stap 1.6) en incubeer bij 37 °C onder statische omstandigheden gedurende 30 minuten om de biofilm te opsoniseren.</li>
	<li>Giet de 20% serumoplossing aan en was de biofilms eenmaal druppelsgewijs met 150 μL HBSS. Aspirateer de HBSS en laat putten achter met opsonized biofilms. OPMERKING: Voor interpretatie van het experiment wordt minimaal vier groepen aanbevolen: (A) Neutrofielen + Biofilm, (B) Neutrofielen + PMA (positieve controle, zie Tabel van Materialen), (C) Alleen neutrofielen en (D) Alleen biofilm.</li>
	<li>Voeg luminol (zie materiaaltabel) toe aan de neutrofielen die in HBSS zijn geresuspendeerd in een concentratie van 4 x 106 cellen/ml, zodat de uiteindelijke luminolconcentratie 50 μM bedraagt. Deze oplossing is klaar voor gebruik voor groepen (A) en (C). Voeg 4 x 105 neutrofielen gemengd met luminol toe aan de putten met opsonized biofilms.</li>
	<li>Bereid in een aparte tube 50 μM luminoloplossing in HBSS zonder neutrofielen en voeg deze toe aan de put met biofilm (groep D).</li>
	<li>Aliquot 350 μL neutrofielen gemengd met luminol en voeg phorbol 12-myristate 13-acetaat (PMA) toe in een eindconcentratie van 500 ng / ml aan het mengsel. Voeg voor groep (B) 4 x 105 neutrofielen uit dit mengsel toe aan putten zonder biofilm. Dit dient als een positieve controle. OPMERKING: De concentratie PMA die in deze stap wordt aangegeven, is relatief hoog om een robuuste burstrespons te garanderen, aangezien PMA gestimuleerde neutrofielen een positieve controle is. PMA kan in een lagere concentratie worden gebruikt om neutrofielen te activeren, afhankelijk van het experiment.</li>
	<li>Centrifugeer de plaat bij 270 x g gedurende 30 s bij 4 °C.</li>
	<li>Zorg ervoor dat de plaatlezer is ingesteld op 37 °C, samen met de instelling voor luminescentie en kinetische aflezing gedurende 60 minuten met intervallen van 3 minuten. Plaats de plaat in de plaatlezer om de ROS-productie door neutrofielen gedurende 60 minuten te meten. OPMERKING: Voor deze test werden biofilms gekweekt in witte platen die werden gebruikt voor luminescentietests. PMA is een bekende agonist voor de oxidatieve burst response39. Zorg er bij het uitvoeren van studies met PMA voor dat PMA in de laatste stap wordt toegevoegd, terwijl de oplossing die neutrofielen bevat koud is, omdat PMA onmiddellijk de burst-respons initieert.</li>
</ol>5. Beeldvorming van biofilm-neutrofiele interacties
<ol><li>Stel een biofilm in met behulp van stappen 1.2-1.6. Om biofilmbeeldvorming te vergemakkelijken, gebruikt u een fluorescerende stam van S. aureus, zoals USA300 die groen fluorescerend eiwit (GFP)40,41 tot expressie brengt, om het gemak van microscopiebeeldvorming te vergroten. OPMERKING: Een 6 μ-kanaals dia (zie Tabel van materialen) werd gebruikt in plaats van een 96-well plaat om het in vitro biofilmmodel te demonstreren (stap 1).</li>
	<li>Incubeer 4 x 106 cellen/ml neutrofielen met 100 μM blauwe CMAC (7-amino-4-chloormethylcoumarine) kleurstof (BCD, zie materiaaltabel) gedurende 30 minuten in een rocker bij 37 °C en 5% CO2. Zorg ervoor dat de monsters in het donker worden geïncubeerd en beperk de blootstelling aan licht voor de resterende stappen.</li>
	<li>Om overtollige BCD te wassen, centrifugeer neutrofielen op 270 x g gedurende 5 minuten en aspirateer het supernatant. Resuspendeer de neutrofielen in verse HBSS. Voeg op dit punt ethidium homodimeer-1 (zie tabel met materialen) toe aan de BCD-gekleurde neutrofielen in een eindconcentratie van 4 μM om neutrofielen en bacteriële dood te controleren.</li>
	<li>Voeg 150 μL neutrofielen toe aan de S. aureus biofilm die is gekweekt in μ-dia's, zodat de verhouding tussen neutrofielen en bacteriën 1:30 is (neutrofiel: bacteriën). Incubeer de μ-dia's in een bevochtigde kamer gedurende 30 minuten. Het aantal bacteriële cellen is gebaseerd op de celtellingen die worden verkregen door het platen van een biofilm van 18 uur.</li>
	<li>Beeld de neutrofiel-biofilminteractie af met behulp van fluorescerende kanalen die overeenkomen met de excitatie- en emissiegolflengten van de fluorescerende kleurstoffen/eiwitten. OPMERKING: Voor de huidige studie is BCD 353/466 nm, ethidium homodimeer-1 is 528/617 nm en GFP is 395/509 nm. Beperk de blootstelling van het monster aan de laser of het licht om fotobleaching van de monsters te voorkomen.</li>
	<li>Analyseer de beelden met behulp van microscopie beeldanalyse software of programma's zoals FIJI / ImageJ, COMSTAT2, BiofilmQ en BAIT, onder nog veel meer 42,43,44,45. OPMERKING: Bij het werken met vlekken is het belangrijk om rekening te houden met de specificiteit van de gebruikte kleurstoffen. Sommige vlekken werken op prokaryote en eukaryote cellen, terwijl andere slechts op één werken. Als neutrofielen en biofilms afzonderlijk worden gekleurd met kleurstoffen die beide celtypen kunnen bevlekken, zorg er dan voor dat u alle resterende kleurstof afwast voordat u neutrofielen en biofilms combineert om kruiskleuring te voorkomen.</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Er zijn talloze inspanningen geleverd om robuuste en reproduceerbare S. aureus-biofilms te kweken voor downstream-experimenten in vitro 48,49,50. Er wordt een gestandaardiseerd protocol geschetst dat gebruik maakt van de kationische aard van PLL, evenals het aanvullen van de media met glucose voor de groei van robuuste in vitro S. aureus biofilms. De toevoeging van PLL zorgt voor een betere hechting van de negatief geladen bacteriële cel aan de positief geladen PLL-gecoate oppervlakken. Het is belangrijk op te merken dat PLL bij een concentratie van 10 μg / ml antimicrobiële activiteit heeft tegen Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli en S. aureus wanneer geïncubeerd gedurende 24 h51. Dezelfde concentratie wordt gebruikt om oppervlakken te coaten; overtollige PLL wordt echter aangezogen, waardoor de concentratie PLL lager is dan 10 μg/ml bij het zaaien voor biofilmgroei.
Het is belangrijk op te merken dat PLL alleen heeft gewerkt in specifieke groeimedia zoals MEMα met 2% glucose, waar werd waargenomen dat S. aureus robuuste biofilms produceerde met minimale variabiliteit (figuur 2A). PLL-concentratie die in combinatie met andere mediatypen kan worden gebruikt, vereist verdere optimalisatie, zoals het gebruik van een verhoogde concentratie PLL om de putten te coaten. Bovendien zijn deze omstandigheden geoptimaliseerd voor een monospecies S. aureus biofilm. Hoewel chronische wondbiofilms vaak polymicrobiaal zijn, is het standaardiseren van assays om monospecies biofilm en zijn interacties met neutrofielen en andere immuuncellen te bestuderen de sleutel tot het begrijpen van hun bijdrage aan pathogenese52. Deze gestandaardiseerde protocollen kunnen verder worden geoptimaliseerd om polymicrobiële biofilms en hun interacties met neutrofielen te ondersteunen en te bestuderen.
Er werd ook waargenomen dat rijke bacteriële kweekmedia, zoals TSB, leidden tot een verlies van levensvatbaarheid van neutrofielen (figuur 1). Daarom werden de groeicondities van S. aureus-biofilms in MEMα, gebruikt voor celculturen van zoogdieren, geoptimaliseerd. Voor studies met neutrofielen ondersteunt dit medium de levensvatbaarheid van neutrofielen en bevordert het de groei van S. aureus . Hoewel werd waargenomen dat media de levensvatbaarheid van neutrofielen beïnvloeden, is het ook belangrijk om te overwegen dat neutrofielen geïsoleerd uit perifeer menselijk bloed ex vivo apoptose ondergaan met ongeveer 70% apoptotische neutrofielen tegen 20 h53. Dit vereist een goede behandeling, zoals het opslaan van de neutrofielen op ijs bij de voorbereiding op experimenten, het gebruik van endotoxinevrije reagentia en het voorkomen van activering van neutrofielen door vortexing van monsters met neutrofielen te voorkomen.
De beoordeling van oxidatieve uitbarstingen bij neutrofielen wordt routinematig uitgevoerd om het dodende effect van neutrofielen op de ziekteverwekker 14,54,55 te bepalen. Deze studies worden vaak uitgevoerd met planktonische bacteriën waar neutrofielen worden toegevoegd, en de oxidatieve burst-respons wordt gekwantificeerd met behulp van luminol-versterkte chemiluminescentie die superoxide-anionen detecteert die door neutrofielen worden geproduceerd. Het huidige protocol wordt aangepast door planktonische bacteriën te vervangen door statisch gekweekte 18 h S. aureus biofilm. Als zodanig kunnen neutrofielen direct aan de biofilm worden toegevoegd om hun activering te beoordelen. Aan de andere kant produceren bacteriën in biofilms enzymen, zoals catalase en superoxide dismutase om ROS23,56 te ontgiften. Staphylococcus epidermidis biofilms produceren hogere catalase dan zijn plankton tegenhanger onder stress57. De totale chemiluminescentie van PMA-gestimuleerde neutrofielen in een S. aureus biofilm is significant lager dan de PMA-gestimuleerde neutrofielen waar biofilm afwezig is (figuur 2). Dit kan te wijten zijn aan de activiteit van deze ontgiftende enzymen. Bovendien produceren S. aureus-biofilms verschillende porievormende toxines die leukocidanen worden genoemd en die neutrofielen doden58. De verminderde burst-respons is waarschijnlijk ook te wijten aan de verminderde levensvatbaarheid van neutrofielen in aanwezigheid van S. aureus-biofilm. Hoewel deze studie luminol gebruikt dat de totale ROS detecteert die zowel binnen als buiten de cellen wordt geproduceerd, moeten andere reagentia, zoals CM-H2DCFDA (5-(en-6)-chloormethyl-2'7'-dichloordibutafluoresceïnediacetaat) of isoluminol, worden overwogen als het doel van het werk is om intracellulaire of extracellulaire ROS-productie 14,53,54 specifiek te bestuderen.
Het vermogen om neutrofiel-biofilminteracties via microscopie te visualiseren, kan informatief zijn over het gedrag van neutrofielen en biofilms in aanwezigheid van elkaar. De excitatie- en emissiespectra van de fluorescerende kleurstoffen en eiwitten vertegenwoordigen een momentopname van de interactie tussen een 18 h S. aureus biofilm en neutrofielen na een incubatie van 30 minuten. Om signalen van gekleurde cellen effectief op te vangen, is het belangrijk om de blootstelling van de monsters aan lichtbronnen te beperken terwijl de monsters worden ingesteld voor microscopie. Tijdens de beeldvorming werd snelle fotobleaching van de monsters vermeden door de intensiteit van de lichtbron te verlagen bij het aanpassen van alle parameters zoals Z-stackhoogte en belichtingstijd voor verschillende kanalen.
Deze eenvoudige praktijken maakten een goede microscopiebeeldvorming mogelijk waarbij werd waargenomen dat weinig neutrofielen gelokaliseerd zijn in de biofilm (figuur 4A). Dit kan te wijten zijn aan ruimtes in de biofilm als 18 h S. aureus biofilm gekweekt in MEMα met 2% glucose bedekt het oppervlak niet gelijkmatig (figuur 4B). Het gebruik van rijke media door andere studies heeft echter een uniform gazon van S. aureus biofilmgroei en leukocyten aangetoond die door de biofilm doordringen30,58. Verder wordt ook waargenomen dat er neutrofiele celdood was na 30 minuten incubatie met S. aureus biofilms als gevolg van S. aureus biofilm-geproduceerde leukocidines die neutrofielen lyseren58 (Figuur 4A,D). Toevoeging van een wasstap om niet-gehechte neutrofielen te verwijderen na het incuberen met biofilm gedurende 30 minuten verwijderde ~ 15% van de dode neutrofielen uit het systeem in vergelijking met de ongewassen groep, waarbij microscopie onmiddellijk na 30 minuten incubatie werd uitgevoerd (figuur 4D). Neutrofielen die interageren met S. aureus werden ook waargenomen (figuur 4C). Verdere experimenten zijn nodig om te beoordelen of S. aureus wordt overspoeld door neutrofielen of wordt gehecht aan het celoppervlak van neutrofielen54. Het in beeld brengen van neutrofielen en biofilms is de eerste stap om verschillende neutrofiele functionaliteiten stroomafwaarts te evalueren, zoals fagocytose en NETosis54,59. Het effect van neutrofielen op biofilms kan ook worden beoordeeld door de biofilmbiomassa, structurele veranderingen van de biofilm en de levensvatbaarheid van biofilms te kwantificeren, naast vele andere, met behulp van beeldanalysetools die in stap 5.6 worden vermeld. Ten slotte bestaat donor-tot-donorvariabiliteit bij neutrofielen; daarom wordt aanbevolen om ten minste drie verschillende donoren te gebruiken voor studies met neutrofielen.
Over het algemeen werden gestandaardiseerde in vitro assays gecombineerd om interacties tussen neutrofielen en biofilms te beoordelen. Hoewel deze testen S. aureus gebruiken, kunnen de beschreven protocollen gemakkelijk worden aangepast om andere pathogenen te bestuderen. Hoewel er verschillende in vivo modellen zijn om gastheer-pathogeen interacties te bestuderen, kunnen ze duur en arbeidsintensief zijn, vooral als de omstandigheden niet zijn geoptimaliseerd. Werken met gestandaardiseerde in vitro assays stelt u in staat om experimentele omstandigheden te optimaliseren en waarnemingen te bevestigen voordat men naar een in vivo systeem gaat. Ten slotte zijn verschillende dierinfectiemodellen gebruikt om biofilm-neutrofiele interacties in vivo te bestuderen. Het is echter belangrijk om immunologische verschillen tussen mens en dier te overwegen 60,61,62,63. Dit vereist het gebruik van neutrofielen afkomstig van mensen om deze complexe gastheer-pathogeen interacties te bestuderen.

Een biofilm is een gemeenschap van oppervlakte-geassocieerde microben of niet-gehechte aggregaten omhuld in een extracellulaire polymere stof (EPS)1,2. Deze gemeenschappen beschermen de ingekapselde micro-organismen tegen omgevingsstressoren, waaronder tolerantie voor antimicrobiële stoffen en het immuunsysteem3. Verschillende pathogene microbiële soorten vormen biofilms die in verband zijn gebracht met chronische infecties4. De ontwikkeling van biofilms is een ingewikkeld proces waarbij hechting aan oppervlakken, EPS-productie, celproliferatie, biofilmstructurering en celloslating5. Zodra cellen zich verspreiden om een biofilm te vormen, blijven ze mentonisch of transloceren ze naar een nieuw substraat en starten ze opnieuw de ontwikkeling van de biofilm6.
Staphylococcus aureus, een opportunistische ziekteverwekker, volgt een algemeen schema van biofilmontwikkeling, inclusief aanhechting, proliferatie, rijping en verspreiding7. Het hechtingsproces in S. aureus-biofilms wordt bepaald door hydrofobe interacties, teichoëzuren en microbiële oppervlaktecomponenten die kleefmatrixmoleculen (MSCRAMMs) herkennen 8,9. Naarmate de proliferatie van S. aureus begint, wordt EPS, dat voornamelijk bestaat uit polysacchariden, eiwitten, extracellulair DNA en teichoëzuren, geproduceerd5. Naarmate EPS-componenten worden geproduceerd, worden ook verschillende exo-enzymen en kleine moleculen geproduceerd, die bijdragen aan de biofilm 3-dimensionale structuur en helpen bij het losmaken5. S. aureus maakt gebruik van deze sterk gecoördineerde levensstijl om verschillende chronische infecties vast te stellen, waaronder infecties als gevolg van de inwoning van medische hulpmiddelen10.
Methicilline-resistente S. aureus (MRSA) is een van de belangrijkste oorzaken van infecties die verband houden met inwonende medische hulpmiddelen, zoals centraal veneuze en urinekatheters, prothetische gewrichten, pacemakers, mechanische hartkleppen en intra-uteriene apparaten11. Tijdens dergelijke infecties zijn neutrofielen de eerste gastheer-immuuncellen die naar de infectieplaats worden gerekruteerd om pathogenen te bestrijden via meerdere strategieën12. Deze omvatten fagocytose, degranulatie, productie van reactieve zuurstof- en stikstofsoorten (ROS / RNS) of het vrijkomen van neutrofiele extracellulaire vallen (NET's) om pathogenen te elimineren13.
Generatie van ROS op fagocytose van microben is een van de belangrijkste antimicrobiële reacties die neutrofielen vertonen14. Fagocytose wordt versterkt als microben worden gecoat met opsoninen, met name immunoglobulinen en complementcomponenten die worden aangetroffen in serum15. De geopsoniseerde microben worden vervolgens herkend door celoppervlakreceptoren op neutrofielen en overspoeld, waardoor een compartiment wordt gevormd dat het fagosoom15 wordt genoemd. Neutrofielen genereren en geven ROS af in het fagosoom via het membraan-geassocieerde NADPH-oxidase16. Dit meercomponenten enzymcomplex genereert superoxide-anionen door elektronen over te brengen naar moleculaire zuurstof16. Bovendien genereren neutrofielen ook RNS door de expressie van induceerbare stikstofmonoxidesynthase (iNOS)17. Deze hoge superoxide- en stikstofmonoxideradicalen in het fagosoom hebben brede antimicrobiële activiteiten. Ze kunnen interageren met metaalcentra in enzymen en nucleïnezuren, eiwitten en celmembranen van de ziekteverwekker 18,19,20,21 beschadigen. Talrijke microben nemen een biofilmlevensstijl aan en gebruiken verschillende strategieën om het doden met ROS22,23 te ontwijken. Gestandaardiseerde testen die biofilms koppelen aan neutrofielen om ROS te kwantificeren, zijn dus gunstig voor consistente resultaten.
Hoewel assays, zoals het kwantificeren van neutrofielen ROS-productie, informatie verschaffen over de reacties van neutrofielen op biofilms, kan het vermogen om de interacties van neutrofielen binnen een biofilm te visualiseren ook dienen als een krachtig hulpmiddel. Het gebruik van fluorescerende kleurstoffen voor microscopie vereist vaak optimalisatie om beelden van hoge kwaliteit te verkrijgen die kunnen worden gebruikt voor microscopiebeeldvormingsanalyse. De flexibiliteit om sommige aandoeningen te optimaliseren is beperkt omdat neutrofielen celdood kunnen ondergaan na isolatie. Bovendien worden biofilms meestal gewassen om de planktonpopulatie uit de experimentele opstelling te verwijderen voordat neutrofielen worden toegevoegd. Tijdens het wassen kan variabiliteit tussen replicerende biofilms ontstaan als gevolg van verlies van gedeeltelijke biomassa als biofilms losjes aan het oppervlak worden gehecht.
In grote lijnen omvatten de huidige methoden in het veld om interacties tussen neutrofielen en biofilms te analyseren voornamelijk microscopie, flowcytometrie en kolonievormende eenheden (CFU) opsomming 24,25,26,27. Microscopie omvat het gebruik van kleurstoffen die ofwel direct de neutrofielen en biofilms kleuren, of zich richten op verschillende neutrofiele reacties tegen microben zoals NET-vorming, degranulatie en celdood25,28. Een subset van deze reacties, zoals neutrofiele celdood en degranulatie, kan ook worden geanalyseerd via flowcytometrie, maar vereist dat neutrofielen bij voorkeur niet geassocieerd worden met grote aggregaten microben in een biofilm28,29. Flowcytometrie kan ook enkele biofilmparameters kwantificeren, zoals cel levensvatbaarheid27. Deze processen vereisen echter verstoring van de biofilmbiomassa en zouden niet nuttig zijn om andere belangrijke interacties te visualiseren, zoals de ruimtelijke verdeling van neutrofielen en hun componenten binnen een biofilm 27,29,30.
Het huidige protocol richt zich op het aanpassen van enkele van de traditioneel gebruikte methoden om neutrofiel-biofilminteracties op biofilms te bestuderen die zijn geoptimaliseerd om minimale variabiliteit tijdens de hantering te bieden. Dit protocol biedt dus gestandaardiseerde methoden om biofilms te laten groeien en kwantificeren, primaire menselijke neutrofielen uit perifeer bloed te isoleren, ROS-productie te kwantificeren en biofilm-neutrofiele interacties via microscopie te visualiseren. Dit protocol kan worden aangepast aan verschillende systemen om biofilm-neutrofiele interacties te begrijpen, rekening houdend met de heterogeniteit tussen donorpools.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% sodium chloride irrigation, USP</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>2F7124</td>
			<td>Endotoxin-free; Used for isolation of neutrophils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mL rapid-flow filter unit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>565-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 proof ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89125-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td>Used for blood draw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td>Used for blood draw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1423-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swab</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>Used for blood draw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band-aids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for blood draw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Bacto Tryptic Soy Broth</td>
			<td>BD</td>
			<td>DF0370-07-5</td>
			<td>Combine with 1.5% agar to make Tryptic Soy Agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Bal Saupply</td>
			<td>202C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker blue CMCH</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C2111</td>
			<td>Blue CMAC Dye (BCD)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear bottom 96-well flat bottom polystyrene plates</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton gauze</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-761-52</td>
			<td>Used for blood draw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet</td>
			<td>Acros Organic</td>
			<td>40583-0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14-961-27</td>
			<td>Borosilicate Glass 13 x 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G-8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran from Leuconostoc spp.</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>31392-250G</td>
			<td>Used for isolation of neutrophils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (DPBS) 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium homodimer-1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224 B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque plus</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17144003</td>
			<td>Used for isolation of neutrophils (density gradient medium)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; balanced salt solution (HBSS) 1x</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>21-022-CV</td>
			<td>without calcium, magnesium, and phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Bright Line</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Novaplus</td>
			<td>NDC 63323-540-57</td>
			<td>1000 USP units/mL, Used for blood draw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMARIS 9.8</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8511-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimal essential media (MEM) Alpha 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41061-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle (23 G1)</td>
			<td>BD</td>
			<td>305145</td>
			<td>Used for blood draw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti2</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Quantification of dead neutrophils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal human serum</td>
			<td>Complement Technology</td>
			<td>NHS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish (100 x 15 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4707-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP358-10</td>
			<td>Used for neutrophil isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SoftMax Pro Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Microplate reader software used for data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax i3x</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water for irrigation, USP</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>2F7114</td>
			<td>Endotoxin-free; Used for neutrophil isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surflo winged infusion set</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SC*19BLK</td>
			<td>19 G x 3/4&#34;, used for blood draw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain (0.4%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turnicate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for blood draw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White opaque 96-well plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353296</td>
			<td>Tissue culture treated and flat bottom plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;-Slide VI 0.4</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80601</td>
			<td>&#956;-channel slide</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standardized in vitro assays to visualize and quantify interactions between human neutrophils and staphylococcus aureus biofilms

Neutrofielen zijn de eerste verdedigingslinie die door het immuunsysteem wordt ingezet tijdens microbiële infectie. In vivo worden neutrofielen gerekruteerd naar de plaats van infectie waar ze processen zoals fagocytose, productie van reactieve zuurstof- en stikstofsoorten (RESPECTIEVELIJK ROS, RNS), NETosis (neutrofiele extracellulaire val) en degranulatie gebruiken om microben te doden en de infectie op te lossen. Interacties tussen neutrofielen en planktonische microben zijn uitgebreid bestudeerd. Er zijn de laatste jaren opkomende interesses in het bestuderen van infecties veroorzaakt door biofilms. Biofilms vertonen eigenschappen, waaronder tolerantie voor het doden door neutrofielen, verschillend van hun planktonische tegenhangers. Met de succesvolle opstelling van zowel in vitro als in vivo biofilmmodellen kunnen interacties tussen deze microbiële gemeenschappen met verschillende immuuncellen nu worden onderzocht. Hier worden technieken die een combinatie van traditionele biofilmmodellen en gevestigde neutrofiele activiteitstests gebruiken, specifiek afgestemd op het bestuderen van neutrofiele en biofilminteracties. Wide-field fluorescentiemicroscopie wordt gebruikt om de lokalisatie van neutrofielen in biofilms te controleren. Deze biofilms worden gekweekt in statische omstandigheden, gevolgd door de toevoeging van neutrofielen afkomstig van menselijk perifeer bloed. De monsters worden gekleurd met de juiste kleurstoffen voordat ze onder de microscoop worden gevisualiseerd. Bovendien wordt de productie van ROS, een van de vele neutrofiele reacties tegen pathogenen, gekwantificeerd in de aanwezigheid van een biofilm. De toevoeging van immuuncellen aan dit gevestigde systeem zal het begrip van gastheer-pathogeeninteracties vergroten en tegelijkertijd het gebruik van gestandaardiseerde en geoptimaliseerde omstandigheden garanderen om deze processen nauwkeurig te meten.

De media die worden gebruikt om bacteriële biofilms te kweken, beïnvloeden de overleving van neutrofielen. Verschillende media werden getest om het effect van media alleen op de levensvatbaarheid van neutrofielen te verminderen voor het bestuderen van neutrofiel-biofilminteracties (figuur 1). Bacteriële groeimedia zoals Tryptic Soy Broth minimaliseren de levensvatbaarheid van neutrofielen, zodat ~ 60% van de neutrofielen in leven is na een incubatietijd van 30 minuten bij 37 ° C met 5% CO2. Zoogdiercelkweekmedia, zoals MEMα, hebben geen invloed op de levensvatbaarheid van neutrofielen en ondersteunen de groei van S. aureus-biofilms. In feite bevordert minimale media een robuuste groei van biofilms in andere bacteriën 46,47.
Om het effect van media op biofilmgroei en variabiliteit in biofilmbiomassakwantificering na het wassen van de biomassa te beoordelen om planktoncellen te elimineren, werd een 18 h S. aureus biofilm gekweekt in een 96-well plaat, met putten behandeld of onbehandeld met poly-L-Lysine. Een voedingsrijk (Tryptic Soy Broth (TSB)) en minimale (MEMα) media werden gebruikt zoals het is of aangevuld met 2% glucose. Uit de biofilmbiomassa gekleurd met CV bleek dat S. aureus biofilm gekweekt in MEMα aangevuld met 2% glucose de meest robuuste biofilm produceerde van alle geteste media (figuur 2A). Bovendien vertoonden biofilms gekweekt in PLL-voorbehandelde putten die MEMα + 2% glucose bevatten minder variabiliteit dan biofilms in PLL-onbehandelde putten die MEMα + 2% glucose bevatten. Deze biofilms vertoonden minder variabiliteit in kwantificering via CV-assay35 en de CFU/ml wanneer ze werden verguld na nauwkeurige verwerking van biofilms voor biomassakwantificering. Deze biofilms bevatten gemiddeld 1 x 108 CFU/ml, zoals aangetoond door de biofilms in 3 afzonderlijke dagen te beplateren (figuur 2B). Dit aantal is nuttig bij het bepalen van het aantal neutrofielen dat moet worden toegevoegd aan de biofilms voor neutrofiele functionaliteitstests.
Om de ROS-productie door neutrofielen als reactie op biofilms te meten, werden S. aureus-biofilms gedurende 18-20 uur statisch gekweekt in een 96-well plaat. Biofilms werden vervolgens geopsoniseerd en neutrofielen werden toegevoegd. De ROS-productie werd vervolgens gedurende 60 minuten gemeten (figuur 3A). Het gebied onder de curve wordt berekend uit de kinetische curve om de totale ROS-productie door neutrofielen te kwantificeren. Neutrofielen behandeld met een agonist, zoals PMA, gebruikt als controle, vertonen een verhoogde ROS-productie. Bij afwezigheid van biofilms vertoonden neutrofielen behandeld met PMA een robuuste ROS-productie. In aanwezigheid van S. aureus biofilm daalde de totale ROS-productie door neutrofielen behandeld met PMA. Bij afwezigheid van PMA vertrouwen neutrofielen uitsluitend op hun interactie met de biofilm, waardoor de hoeveelheid geproduceerde ROS verder afneemt (figuur 3B).
Om de interacties tussen neutrofielen en biofilms te visualiseren met behulp van fluorescentiemicroscopie, werd een GFP-tot expressie brengende stam van S. aureus, Blue CMAC-kleurstof en ethidium homodimeer-1 gebruikt, die respectievelijk het cytoplasma van levende cellen en DNA van dode cellen kleurt. S. aureus biofilm werd gedurende 18 uur gekweekt in een 6 μ-kanaals dia. Blauwe CMAC kleurstof-gelabelde neutrofielen werden samen met ethidium homodimeer-1 toegevoegd aan de gewassen biofilms en geïncubeerd gedurende 30 minuten bij 37 °C met 5% CO2 voorafgaand aan beeldvorming. Wide-field fluorescentiemicroscopie onthulde dat veel neutrofielen gelokaliseerd waren op het oppervlak van S. aureus-biofilms , terwijl een paar zich binnen de biofilm bevinden (figuur 4A). De interactie tussen S. aureuscellen binnen neutrofielen was ook duidelijk (figuur 4C). De meeste S. aureus-cellen die interageren met neutrofielen (cyaan) waren dood (magenta), terwijl een paar in leven bleven (geel) zoals bepaald door levend-dood kleuren (figuur 4C). Ter vergelijking: GFP-expresserende S. aureus biofilms werden gekleurd met ethidium homodimer-1, wat een fractie van de dode S. aureus populatie binnen de biofilm onthulde (figuur 4B). Niet-levensvatbare neutrofielen die positief waren voor ethidium homodimeer-1 werden gekwantificeerd met behulp van analysesoftware (zie Materiaaltabel) na incubatie met S. aureus biofilms. Ongeveer 48% van de neutrofielen was al dood binnen 30 minuten na incubatie met S. aureus biofilm. Tijdens de optimalisatie van het microscopieprotocol werd ook het effect beoordeeld van het wassen van de biofilm en neutrofielen na 30 minuten incubatie om niet-gehechte neutrofielen te verwijderen, waarbij ongeveer 33% van de dode neutrofielen nog steeds aan de biofilm vastzit (figuur 4D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63773/63773fig1v2.jpg"> Figuur 1: LIVE-DEAD assay vergelijkt de overleving van neutrofielen tussen bacteriële en zoogdiergroeimedia. Neutrofielen werden geïsoleerd en geïncubeerd in HBSS, MEMα, TSB of 0,1% SDS gedurende 30 min. LIVE-DEAD-kleuring werd uitgevoerd met Calcein AM (levend) en ethidium homodimeer-1 (dood). Percentage levende neutrofielen werd bepaald, waarbij HBSS-geïncubeerde neutrofielen werden behandeld als 100% levende neutrofielen. De resultaten vertegenwoordigen gemiddeld twee onafhankelijke experimenten uitgevoerd in drievoud, met neutrofielen verkregen van twee verschillende donoren. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD (*p < 0,05, ****p < 0,0001. One-way ANOVA). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63773/63773fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63773/63773fig02.jpg"> Figuur 2: Kwantificering van biofilmbiomassa in verschillende omstandigheden en bacteriële levensvatbaarheid van biofilms gekweekt in de geoptimaliseerde omstandigheden. (A) S. aureus werd gezaaid in een 96-well plaat, al dan niet bedekt met poly-L-Lysine (PLL). Biofilms werden gekweekt in TSB, MEMα of een van de media aangevuld met 2% glucose onder statische omstandigheden gedurende 18 uur. Kristalviolet (CV) kleuring werd uitgevoerd om biofilm biomassa te kleuren. De geëlueerde CV-vlek werd verdund op 1:10 en ingelezen in een microplaatlezer. De resultaten vertegenwoordigen een gemiddelde van drie onafhankelijke experimenten die in drievoud worden uitgevoerd. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD. De SD voor elke groep wordt onderaan weergegeven om de variabiliteit van verschillende biofilmgroeiomstandigheden aan te tonen. (B) Bacteriële KVE-tellingen werden verkregen uit biofilms gekweekt in een geoptimaliseerd medium (MEMα + 2% glucose). De statische biofilms van 18 uur werden onderworpen aan hetzelfde aantal wasbeurten, gevolgd door een ultrasoonapparaat van 10 minuten om de biofilmbiomassa los te maken en door een 22G-naald te gaan om de aggregaten te verstoren voorafgaand aan het plateren. De resultaten vertegenwoordigen drie replicaties die in drievoud worden uitgevoerd. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD (ns = niet significant. One-way ANOVA). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63773/63773fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63773/63773fig03.jpg"> Figuur 3: Kwantificering van ROS-productie door neutrofielen via chemiluminescentietest. (A) Neutrofielen (PMN) werden geïncubeerd met HBSS-gewassen S. aureus biofilms (BF) hetzij in aanwezigheid (gesloten grijze driehoek) of afwezigheid (open grijze omgekeerde driehoek) van PMA om ros-productie door neutrofielen te meten. Luminol werd gebruikt om ROS elke 3 min gedurende 60 minuten te detecteren in een microplaatlezer. Terwijl neutrofielen behandeld met PMA in afwezigheid van een biofilm (gesloten zwarte cirkel) dienden als een positieve controle, dienden alleen neutrofielen (open zwarte cirkel) en biofilm alleen (open grijze driehoek) groepen als negatieve controles. Gegevens vertegenwoordigen gemiddeld twee onafhankelijke experimenten uitgevoerd in drievoud met neutrofielen verkregen van twee verschillende donoren. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD. (B) Het gebied onder de curve van (A) werd berekend om de totale ROS gegenereerd door de neutrofielen te kwantificeren. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD. (***p < 0,0001. One-way ANOVA). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63773/63773fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63773/63773fig04.jpg"> Figuur 4: Visualisatie van de interactie tussen S. aureus biofilm en neutrofielen met behulp van wide-field fluorescentiemicroscopie. Blauwe CMAC kleurstof-gelabelde neutrofielen (cyaan) werden aangevuld met ethidium homodimeer-1 (magenta; dood) voorafgaand aan het incuberen met een 18 h S. aureus biofilm (geel). Biofilm-neutrofiele interacties werden in beeld gebracht met behulp van wide-field fluorescente microscopie en beelden verwerkt met behulp van een beeldanalysesoftware. Er werd geëxperimenteerd met drie verschillende donoren. Representatieve beelden worden gepresenteerd als (A) 3D-weergave van S. aureus-biofilm met levende (cyaan) en dode (magenta; een paar aangegeven met witte pijlen) neutrofielen, (B) 3D-weergave van een S. aureus-biofilm in afwezigheid van neutrofielen met levende S. aureus die GFP (geel) of dode S. aureus uitdrukt gekleurd met ethidium homodimeer-1 (magenta), (C) een orthogonale weergave van S. aureus en neutrofiele interactie zoals weergegeven door de xy-, yz- en xz-vlakken, en (D) kwantificering van neutrofiele levensvatbaarheid in aanwezigheid van S. aureus-biofilm na 30 minuten onmiddellijk (ongewassen) of na drie wasrondes met HBSS om niet-gehechte neutrofielen (gewassen) te verwijderen. Neutrofiele celdood wordt gepresenteerd als gemiddelde ± SD (Student's t-test). De schaalbalk geeft 50 μm in (A) en (B) en 10 μm in (C) aan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63773/63773fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Standardized In vitro Assays to Visualize and Quantify Interactions between Human Neutrophils and Staphylococcus aureus Biofilms at JoVE.com

Standardized In vitro Assays to Visualize and Quantify Interactions between Human Neutrophils and Staphylococcus aureus Biofilms

Dit protocol beschrijft de studie van neutrofiel-biofilm interacties. Staphylococcus aureus biofilms worden in vitro vastgesteld en geïncubeerd met perifere bloed-afgeleide menselijke neutrofielen. De oxidatieve burst-respons van neutrofielen wordt gekwantificeerd en de neutrofiellokalisatie in de biofilm wordt bepaald door microscopie.

Gestandaardiseerde in vitro assays om interacties tussen menselijke neutrofielen en staphylococcus aureus biofilms te visualiseren en te kwantificeren

Neutrophils are the first line of defense deployed by the immune system during microbial infection. In vivo, neutrophils are recruited to the site of ...

Deze protocollen zijn ontworpen om te begrijpen hoe menselijke neutrofielen interageren met bacteriële biofilms en deze doden. Het doel is om dit beter te begrijpen en de variabiliteit van test tot test te beperken, begrijpend dat er inherente problemen zijn met menselijke neutrofielen van donor tot donorvariatie. De hier genoemde technieken zijn geoptimaliseerd om de gebruikers in staat te stellen experimenten uit te voeren met minimale variabiliteit, vooral met losjes bevestigde biofilms.Bovendien kunnen deze protocollen ook worden aangepast om andere microben te bestuderen die biofilms kunnen vormen. Begin met het verkrijgen van geïsoleerde kolonies Staphylococcus aureus uit een gecryopreserveerde voorraad met behulp van een streakplaattechniek op een voedingsrijke agarplaat, zoals tryptische soja-agar. Bekleed individuele putten van een 96-wellsplaat met 100 microliter PLL verdund in steriel water en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.Aspirateer de PLL-oplossing aseptisch met behulp van een vacuümondersteunde aspiratieval. Laat de putjes een nacht op kamertemperatuur drogen. Bereid een nachtcultuur voor door een kolonie S.aureus in MEM-alfa te enten, aangevuld met 2% glucose en geïncubeerd bij 37 graden Celsius gedurende 16 tot 18 uur bij 200 rotaties per minuut.Verdun de nachtcultuur door 50 microliter over te brengen op vijf milliliter verse MEM-alfa aangevuld met 2% glucose. Incubeer het vervolgens bij 37 graden Celsius met 200 rotaties per minuut totdat de middelste logaritmische fase is bereikt. Gebruik MEM-alfa om de mid-logaritmische cultuur te normaliseren tot een OD van 0,1.Breng 150 microliter genormaliseerde cultuur over naar elk putje van de met PLL behandelde 96-well plaat. Incubeer de plaat in een bevochtigde kamer bij 37 graden Celsius gedurende 18 tot 20 uur. Aspirateer het supernatant om de planktoncellen te verwijderen.Was de resterende biomassa voorzichtig met 150 microliter HBSS om de niet-gehechte cellen te verwijderen. Herhaal dit minstens twee keer om alle planktoncellen te verwijderen. Voeg 100 microliter 20% normaal humaan serum verdund in HBSS druppelsgewijs toe aan de gewassen biofilm en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius om de biofilm te opsoniseren.Aspirateer de serumoplossing en was de biofilms druppelsgewijs met 150 microliter HBSS. Aspirateer de HBSS en laat putten achter met opsonized biofilms. Voeg luminol toe aan de neutrofielen die opnieuw in HBSS zijn gesuspendeerd om een uiteindelijke concentratie van vijf micromolaire luminol te vormen.Deze oplossing is klaar voor gebruik voor groepen A en C.Voeg neutrofielen gemengd met luminol toe aan de putten met opsonized biofilms. Bereid voor groep D 50 micromolaire luminoloplossing in HBSS in een aparte buis zonder neutrofielen en voeg deze toe aan de put met de biofilm. Aliquot 350 microliter neutrofielen gemengd met luminol en voeg PMA toe met een uiteindelijke concentratie van 500 nanogram per milliliter aan het mengsel.Voeg voor groep B de neutrofielen uit dit mengsel toe aan putjes zonder biofilm. Dit dient als een positieve controle. Centrifugeer de plaat op 270 RCF gedurende 30 seconden bij vier graden Celsius.Zorg ervoor dat de plaatlezer is ingesteld op 37 graden Celsius, de luminescentie en kinetische aflezing gedurende 60 minuten met intervallen van drie minuten. Plaats de plaat in de plaatlezer om de ROS-productie door neutrofielen gedurende 60 minuten te meten. Gebruik een fluorescerende stam van S.aureus, zoals USA300, die GFP tot expressie brengt om microscopiebeelden te vergemakkelijken.Incubeer neutrofielen met 100 micromolaire BCD gedurende 30 minuten in een rocker bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide in de atmosfeer. Zorg ervoor dat de monsters in het donker worden geïncubeerd en beperk de blootstelling aan licht. Om overtollige BCD te wassen, centrifugeer neutrofielen op 270 RCF gedurende vijf minuten en aspirateer het supernatant.Suspensie de neutrofielen opnieuw in verse HBSS. Voeg vervolgens ethidium homodimeer-1 toe aan de BCD-gekleurde neutrofielen in een uiteindelijke concentratie van vier micromolar om neutrofielen en bacteriële dood te controleren. Was de biofilm met HBSS en voeg 150 microliter neutrofielen toe aan de S.aureus-biofilm die in microverschuivingen is gekweekt.Incubeer de microslides in een bevochtigde kamer gedurende 30 minuten. Het aantal bacteriële cellen zal worden gebaseerd op de celtellingen verkregen uit de 18-uurs biofilmplating. Beeld de neutrofiele biofilminteractie af met behulp van fluorescerende kanalen die overeenkomen met fluorescerende kleurstoffen, of excitatie- en emissiegolflengten van eiwitten.Bacteriële groeimedia minimaliseerden de levensvatbaarheid van neutrofielen tot ongeveer 60% na 30 minuten incubatietijd. Zoogdiercelkweekmedia hadden echter geen invloed op de levensvatbaarheid van neutrofielen en kunnen ook de groei van S.aureus-biofilms ondersteunen. Neutrofielen behandeld met PMA gebruikt als controle vertoonden een verhoogde ROS-productie.Bij afwezigheid van biofilms vertoonden neutrofielen behandeld met PMA een robuuste ROS-productie. In aanwezigheid van S.aureus-biofilm nam de totale ROS-productie door neutrofielen behandeld met PMA af, terwijl bij afwezigheid van PMA neutrofielen uitsluitend vertrouwden op hun interactie met de biofilm, waardoor de ROS-productie verder werd verminderd. Widefield fluorescerende microscopie onthulde dat veel neutrofielen gelokaliseerd waren aan de oppervlakte, terwijl een paar zich in de S.aureus-biofilms bevonden.De meeste S.aureus-cellen die interactie hadden met neutrofielen waren dood, terwijl een paar in leven bleven zoals bepaald door LIVE / DEAD-kleuring. Ethidium homodimeer-1-gekleurde biofilms onthulden een fractie van de dode S.aureus-populatie binnen de biofilm. Het effect van het wassen van de biofilm en neutrofielen na 30 minuten incubatie om niet-gehechte neutrofielen te verwijderen, onthulde dat ongeveer 33% van de dode neutrofielen nog steeds aan de biofilm was gehecht.De hier genoemde protocollen kunnen ook worden gebruikt om andere functionaliteiten van neutrofielen verder te bestuderen, zoals fagocytose en de vorming van neutrofiele extracellulaire vallen wanneer neutrofielen biofilms tegenkomen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Standardized In vitro Assays to Visualize and Quantify Interactions between Human Neutrophils and Staphylococcus aureus Biofilms

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA)

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus MRSA

Subcutane Infectie van Methicilline Resistente Staphylococcus Aureus (MRSA)

MRSA is a worldwide threat to public health, and MRSA skin and soft-tissue infections now account for more than half of all soft-tissue infections in the ...

Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in Rat

Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus MRSA in Rat

Experimentele Endocarditis Model van Methicilline Resistente<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; (MRSA) in Rat

Endovascular infections, including endocarditis, are life-threatening infectious syndromes1-3. Staphylococcus aureus is the most common world-wide cause ...

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Staphylococcus aureus Growth met humaan hemoglobine als een ijzerbron

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

Studeren Interacties van<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Met Neutrofielen door flowcytometrie en Time Lapse Microscopie

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel<em&gt; In vitro</em&gt; Model voor het bestuderen van de interactie tussen menselijk volbloed en endotheel

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Meting van extracellulaire DNA los en Kwantitatieve NET Formation in menselijke neutrofielen<em&gt; In Vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Gericht op biofilm geassocieerde<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Met behulp van Resazurin Gebaseerd Drug-gevoeligheid Assay

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

genotypering van<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Door Ribosomaal Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

Methodologie voor de studie van horizontale genoverdracht in<em&gt; Staphylococcus aureus</em

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to ...

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

Een muismodel te beoordelen ingeboren immuunreactie op Staphylococcus aureus -infectie

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...