Name: standardized in vitro assays to visualize and quantify interactions between human neutrophils and staphylococcus aureus biofilms
Uploaded: 2022-06-08T14:00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Standardized In vitro Assays to Visualize and Quantify Interactions between Human Neutrophils and Staphylococcus aureus Biofilms at JoVE.com

Dette arbeidet ble finansiert av National Institute of Allergy and Infectious Diseases (R01AI077628) til DJW og en American Heart Association Career Development Award (19CDA34630005) til ESG. Vi takker Dr. Paul Stoodley for å gi oss USA 300 LAC GFP stamme. Videre anerkjenner vi ressurser fra Campus Microscopy and Imaging Facility (CMIF) og OSU Comprehensive Cancer Center (OSUCCC) Microscopy Shared Resource (MSR), Ohio State University. Vi takker også Amelia Staats, Peter Burback og Lisa Coleman fra Stoodley-laboratoriet for å utføre blodtrekk.

Alle prosedyrer ble godkjent av Ohio State University Institutional Review Board (IRB) (2014H0154). Informert skriftlig samtykke ble innhentet fra alle giverne for å samle inn perifert blod for å isolere primære humane nøytrofiler. Staphylococcus aureus (USA300 LAC)31 ble brukt som modellorganisme for å utføre forsøkene. Forsøkene ble utført med riktig personlig verneutstyr (PPE) på grunn av potensiell eksponering for et blodbårent patogen.
1. Tilberedning av in vitro biofilm
<ol><li>Oppnå isolerte kolonier av S. aureus fra en kryopreservert bestand 31 ved hjelp av en strekplateteknikk32,33 på en næringsrik agarplate, for eksempel Tryptic Soy Agar (se Materialtabell).</li>
	<li>Belegg individuelle brønner av en 96-brønns plate med 100 μL 0,001% (v / v) poly-L-lysin (PLL) fortynnet i steril H2O og inkuber ved romtemperatur i 30 minutter. Aseptisk, aspirer PLL-løsningen ved hjelp av en vakuumassistert aspirasjonsfelle. La brønnene tørke over natten ved romtemperatur. MERK: Alle aspirasjonstrinn i protokollen utføres ved hjelp av en vakuumassistert aspirasjonsfelle med mindre annet er oppgitt.</li>
	<li>Forbered en nattkultur ved å inokulere en koloni av S. aureus i minimal essensiell media alfa (MEMα) supplert med 2% glukose og inkuber ved 37 ° C, risting ved 200 o / min i 16-18 timer.</li>
	<li>Fortynn nattkulturen ved å overføre 50 μL til 5 ml fersk MEMα supplert med 2% glukose og inkuber ved 37 ° C, risting ved 200 o / min, til midten av logaritmisk fase, vanligvis mellom optisk tetthet 600 (OD600 nm) på 0,5-0,8. Bruk MEMα til å normalisere mellomlogaritmisk kultur til en OD600 nm på 0,1.</li>
	<li>Overfør 150 μL normalisert kultur til hver brønn i PLL-behandlet 96-brønnplate. Inkuber statisk i 18-20 timer i et fuktet kammer ved 37 °C. MERK: Biofilmene kan også dyrkes i andre formater som μ-kanals lysbilder (se Materialtabell).</li>
	<li>Aspirer supernatanten for å fjerne de planktoniske cellene. Vask forsiktig gjenværende biomasse med 150 μL Hanks balanserte saltløsning (HBSS) for å fjerne de ufestede cellene. Legg HBSS dråpevis for å unngå å forstyrre biofilmen. MERK: Mens du aspirerer supernatanten og HBSS under vask, la det være akkurat nok væske (supernatant eller HBSS) i brønnene som inneholder biofilm slik at biofilmen fortsatt er nedsenket. Dette forhindrer forstyrrelse av biofilmstrukturen når HBSS tilsettes dråpevis for å vaske biofilmen.</li>
	<li>Gjenta trinn 1.6 minst to ganger til for å fjerne alle planktoniske celler. På dette tidspunktet er biofilmer klare for umiddelbare nedstrømseksperimenter. MERK: Hvis biofilmene ikke brukes til nøytrofile eksperimenter, kan HBSS erstattes med fosfatbufret saltvann (PBS). HBSS foretrekkes fremfor PBS da HBSS inneholder komponenter, inkludert glukose, som gir optimale forhold for nøytrofilaktivering34.</li>
</ol>2. Kvantifisering av biofilmbiomasse
<ol><li>Forbered et lager av 0,1% (w / v) Crystal Violet (CV) løsning (se tabell over materialer) ved å oppløse i 20% (v / v) etanol og 80% (v / v) H 2 O.Forsikre deg om at CVen er fullstendig oppløst i etanol før tilsetning av H2O. Filtersteriliser løsningen.</li>
	<li>Tilsett 150 μL 0,1% CV-løsning til den vasket biofilmen og inkuber i 20 minutter ved romtemperatur. Bruk minst tre tomme brønner som bare mediekontroller.</li>
	<li>Aspirer 0,1% CV-løsningen fra biofilmene og vask de fargede biofilmene med 200 μL 1x PBS. Gjenta denne prosessen i totalt tre vasker for å fjerne overflødig CV fra brønnene.</li>
	<li>Tilsett 150 μL av 33% (v / v) iseddiksyre fortynnet med H2O. Inkuber ved romtemperatur på en rocker ved 50 o / min i 30 minutter for å la CVen bundet til biomassen oppløses helt. FORSIKTIG: Utfør dette trinnet i en laminær strømningshette med passende PPE, da iseddik er et etsende kjemikalie.</li>
	<li>I mellomtiden setter du opp mikroplateleseren (se Materialtabell) for å lese av CV-flekkverdiene. Etter iseddikbehandling, les platen ved 595 nm bølgelengde. MERK: Bølgelengden som brukes til å måle OD av CV kan variere fra 500-600 nm35.</li>
</ol>3. Nøytrofil isolasjon
MERK: Nøytrofile ble isolert etter en tidligere publisert metode med mindre endringer36. Denne isolasjonsprotokollen kombinerer tetthetsgradient sentrifugering først, etterfulgt av 3% dextran sedimentering. Denne delen dekker bare den generelle nøytrofile isolasjonsprotokollen, med fokus på endringene som er gjort i den publiserte protokollen. Videre er protokollen som er skissert nedenfor en av de mange metodene som kan isolere nøytrofiler, og kan erstattes etter behov. Andre metoder for å isolere nøytrofiler inkluderer bruk av celleseparasjonsmedier eller magnetisk antistoffcelleseparasjon37.
<ol><li>Tegn blod fra en voksen donor via venepunksjon, i henhold til protokollen som er skissert i den institusjonelle IRB. Før blodprøvetaking, sørg for at sprøyten har tilstrekkelig konserveringsfri heparin, slik at den endelige konsentrasjonen av heparin er 20 U / ml.</li>
	<li>Fortynn det hepariniserte blodet med 3/4 volumet av endotoksinfritt 0,9% NaCl (se materialtabell) i H2O ved romtemperatur.</li>
	<li>For hver 20 ml av den fortynnede blodprøven, aliquot 14 ml av et kommersielt tilgjengelig tetthetsgradientmedium (se tabell over materialer) i et friskt 50 ml konisk rør. Legg den fortynnede blodprøven forsiktig på toppen av tetthetsgradientmediet.</li>
	<li>Sentrifuger den lagdelte blodprøven ved 400 x g i 40 minutter ved romtemperatur. Forsikre deg om at sentrifugen har en langsom pause for å unngå å forstyrre laget når sentrifugeringen er fullført. MERK: Blodprøven vil ha fem lag som inneholder en blanding av saltvann og plasma, et mononukleært cellelag, tetthetsgradientmedium, nøytrofiler og erytrocytter.</li>
	<li>Ved hjelp av en serologisk pipette aspirerer du alle lagene over nøytrofile og erytrocytpellet, etterfulgt av en mild resuspendering av pelleten i kaldt endotoksinfritt 0,9% NaCl i H2O. For hver pellet generert fra en 20 ml blodprøve, resuspend pelleten tilbake til 20 ml volum totalt. Legg til 1: 1 volum på 3% dextran (se materialtabell). Inkuber røret oppreist i 18-20 min på is. MERK: Sørg for at 3% dextran er laget med endotoksinfri 0,9% NaCl i H2O.</li>
	<li>Fjern 20 ml av det øvre laget som inneholder nøytrofiler og noen erytrocytter på et nytt 50 ml konisk rør og sentrifuger det ved 355 x g i 10 minutter ved 4 °C. Hell av supernatanten og etterlatt en rød pellet.</li>
	<li>Resuspender pelleten forsiktig i 10 ml kald, steril H2O i 30 s for å lyse de resterende erytrocyttene. Tilsett umiddelbart 10 ml kaldt endotoksinfritt 0,9% saltvann til blandingen for å gjenopprette tonicitet. Sentrifuge løsningen ved 233 x g i 3 min ved 4 °C.</li>
	<li>Hell av supernatanten og resuspendere pelleten som inneholder 95% -97% nøytrofiler i 1 ml kald HBSS per 20 ml blodprøve.</li>
	<li>Overfør 10 μL av de resuspenderte nøytrofile i 90 μL på 0,4% trypan blå eksklusjonsfargestoff og telle cellene ved hjelp av et hemocytometer (se materialtabell). MERK: Ikke-levedyktige celler er farget blå som trypan blå eksklusjonsfarge er ugjennomtrengelig i levedyktige celler. Denne protokollen gir >99% celle levedyktighet37,38.</li>
	<li>Tilsett ytterligere HBSS slik at den endelige konsentrasjonen av nøytrofiler er 4 x 106 celler / ml. MERK: For eksempel med <99% celle levedyktighet, kan den endelige konsentrasjonen på 4 x 106 celler / ml fortsatt oppnås; Det totale volumet av oppløsninger som inneholder 4 x 106 celler/ml som er oppnådd, vil imidlertid reduseres. Den endelige konsentrasjonen av nøytrofiler kan justeres i henhold til brukerens eksperimentelle behov. Nøytrofile granulocytter ble resuspendert ved en 4 x 106 celler/ml endelig konsentrasjon for alle forsøkene beskrevet nedenfor. For å ta hensyn til donor-til-donor-variabilitet, anbefales det sterkt at alle eksperimenter involvert med nøytrofiler utføres med minst tre forskjellige givere.</li>
</ol>4. Måling av ROS produsert av nøytrofiler
<ol><li>Tilsett 100 μL 20 % normalt humant serum (fortynnet i HBSS) dråpevis til den vaskede biofilmen (trinn 1.6) og inkuber ved 37 °C under statisk tilstand i 30 minutter for å opsonisere biofilmen.</li>
	<li>Aspirer 20% serumoppløsning og vask biofilmene dråpevis med 150 μL HBSS en gang. Aspirer HBSS, etterlater brønner med opsoniserte biofilmer. MERK: For tolkning av eksperimentet anbefales minst fire grupper: (A) Neutrofiler + Biofilm, (B) Neutrofiler + PMA (positiv kontroll, se Materialtabell), (C) Kun nøytrofiler og (D) Kun biofilm.</li>
	<li>Legg luminol (se materialtabell) til nøytrofile resuspendert i HBSS ved en konsentrasjon på 4 x 106 celler / ml slik at den endelige luminolkonsentrasjonen er 50 μM. Denne løsningen er klar til bruk for gruppene (A) og (C). Tilsett 4 x 105 nøytrofiler blandet med luminol til brønnene med opsoniserte biofilmer.</li>
	<li>I et separat rør, lag 50 μM luminoloppløsning i HBSS uten nøytrofiler og tilsett den til brønnen som inneholder biofilm (gruppe D).</li>
	<li>Aliquot 350 μL nøytrofiler blandet med luminol og tilsett phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA) ved en endelig konsentrasjon på 500 ng / ml til blandingen. For gruppe (B), tilsett 4 x 105 nøytrofiler fra denne blandingen i brønner uten biofilm. Dette fungerer som en positiv kontroll. MERK: Konsentrasjonen av PMA som er angitt i dette trinnet er relativt høy for å sikre robust utbruddsrespons, da PMA-stimulerte nøytrofiler er en positiv kontroll. PMA kan brukes i en lavere konsentrasjon for å aktivere nøytrofiler, avhengig av forsøket.</li>
	<li>Sentrifuge platen ved 270 x g i 30 s ved 4 °C.</li>
	<li>Forsikre deg om at plateleseren er satt til 37 °C sammen med innstillingen for luminescens og kinetisk avlesning i 60 minutter med 3 minutters intervaller. Plasser platen i plateleseren for å måle ROS-produksjonen av nøytrofiler i 60 minutter. MERK: For denne analysen ble biofilmer dyrket i hvite plater som ble brukt til luminescensanalyser. PMA er en kjent agonist for oksidativ burstrespons39. Når du utfører studier som involverer PMA, må du sørge for at PMA tilsettes på det siste trinnet mens løsningen som inneholder nøytrofiler er kald, siden PMA umiddelbart starter burstresponsen.</li>
</ol>5. Imaging biofilm-nøytrofile interaksjoner
<ol><li>Sett opp en biofilm ved hjelp av trinn 1.2-1.6. For å lette biofilmavbildning, bruk en fluorescerende stamme av S. aureus, for eksempel USA300 som uttrykker grønt fluorescerende protein (GFP) 40,41, for å øke enkel mikroskopiavbildning. MERK: Et lysbilde på 6 μ (se materialtabell) ble brukt i stedet for en 96-brønnsplate for å demonstrere in vitro biofilmmodellen (trinn 1).</li>
	<li>Inkuber 4 x 106 celler/ml nøytrofiler med 100 μM blå CMAC (7-amino-4-klormetylcoumarin) fargestoff (BCD, se materialtabell) i 30 minutter i en rocker ved 37 °C og 5 % CO2. Sørg for at prøvene inkuberes i mørket og begrens eksponeringen for lys for de resterende trinnene.</li>
	<li>For å vaske overflødig BCD, sentrifuger nøytrofiler ved 270 x g i 5 minutter og aspirerer supernatanten. Resuspend nøytrofile stoffer i fersk HBSS. På dette tidspunktet legger du til ethidium homodimer-1 (se materialtabell) til BCD-fargede nøytrofiler ved en endelig konsentrasjon på 4 μM for å overvåke nøytrofil og bakteriell død.</li>
	<li>Tilsett 150 μL nøytrofiler til S. aureus biofilm som har blitt dyrket i μ-lysbilder, slik at nøytrofil til bakterieforholdet er 1:30 (nøytrofil: bakterier). Inkuber μ-lysbildene i et fuktet kammer i 30 minutter. Antall bakterieceller er basert på celletallene oppnådd ved plating av en 18 timers biofilm.</li>
	<li>Bilde nøytrofil-biofilminteraksjonen ved bruk av fluorescerende kanaler som tilsvarer eksitasjons- og utslippsbølgelengdene til de fluorescerende fargestoffene / proteinene. MERK: For denne studien er BCD 353/466 nm, ethidium homodimer-1 er 528/617 nm, og GFP er 395/509 nm. Begrens eksponeringen av prøven til laseren eller lyset for å forhindre fotobleking av prøvene.</li>
	<li>Analyser bildene ved hjelp av mikroskopi bildeanalyse programvare eller programmer som FIJI / ImageJ, COMSTAT2, BiofilmQ og BAIT, blant mange flere42,43,44,45. NOTAT: Når du arbeider med flekker, er det viktig å vurdere spesifisiteten til fargestoffene som er i bruk. Noen flekker fungerer på prokaryote og eukaryote celler, mens andre bare fungerer på en. Hvis nøytrofiler og biofilmer er separat farget ved hjelp av fargestoffer som kan flekke begge celletyper, må du vaske av gjenværende fargestoff før du kombinerer nøytrofiler og biofilmer for å forhindre kryssfarging.</li>
</ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Det har vært mange anstrengelser for å vokse robuste og reproduserbare S. aureus biofilmer for nedstrøms eksperimenter in vitro48,49,50. En standardisert protokoll er skissert som utnytter PLLs kationiske natur, samt supplerer media med glukose for vekst av robuste in vitro S. aureus biofilmer. Tilsetningen av PLL muliggjør bedre festing av den negativt ladede bakteriecellen til de positivt ladede PLL-belagte overflatene. Det er viktig å merke seg at PLL ved en konsentrasjon på 10 μg / ml har antimikrobiell aktivitet mot Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli og S. aureus når den inkuberes i 24 timer51. Den samme konsentrasjonen brukes til å belegge overflater; Imidlertid aspireres overflødig PLL, noe som gjør konsentrasjonen av PLL lavere enn 10 μg / ml ved såing for biofilmvekst.
Det er viktig å merke seg at PLL kun har virket i spesifikke vekstmedier som MEMα med 2% glukose, hvor det ble observert at S. aureus produserte robuste biofilmer med minimal variabilitet (figur 2A). PLL-konsentrasjon som skal brukes sammen med andre medietyper vil kreve ytterligere optimalisering, for eksempel bruk av økt konsentrasjon av PLL for å belegge brønnene. I tillegg er disse forholdene optimalisert for en monospecies S. aureus biofilm. Mens kroniske sårbiofilmer ofte er polymikrobielle, er standardiseringsanalyser for å studere monospecies biofilm og dets interaksjoner med nøytrofiler og andre immunceller nøkkelen til å forstå deres bidrag til patogenese52. Disse standardiserte protokollene kan optimaliseres videre for å opprettholde og studere polymikrobielle biofilmer og deres interaksjoner med nøytrofiler.
Det ble også observert at rike bakteriekulturmedier, som TSB, førte til tap av nøytrofil levedyktighet (figur 1). Derfor ble vekstforholdene for S. aureus biofilmer i MEMα, brukt til pattedyrcellekulturer, optimalisert. For studier som involverer nøytrofiler, støtter dette mediet nøytrofil levedyktighet og fremmer S. aureus vekst. Mens det ble observert at media påvirker levedyktigheten til nøytrofiler, er det også viktig å vurdere at nøytrofiler isolert fra perifert humant blod gjennomgår apoptose ex vivo med ca. 70% apoptotiske nøytrofiler innen 20 timer53. Dette krever riktig håndtering, for eksempel lagring av nøytrofile på is når du forbereder eksperimenter, ved bruk av endotoksinfrie reagenser og forhindrer aktivering av nøytrofiler ved å unngå vortexing av prøver med nøytrofiler.
Vurderingen av oksidativt utbrudd i nøytrofiler utføres rutinemessig for å bestemme drapseffekten av nøytrofiler på patogenet14,54,55. Disse studiene utføres ofte med planktoniske bakterier hvor nøytrofiler tilsettes, og den oksidative burstresponsen kvantifiseres ved hjelp av luminolforsterket kjemiluminescens som oppdager superoksidanioner produsert av nøytrofiler. Den nåværende protokollen modifiseres ved å erstatte planktoniske bakterier med statisk dyrket 18 timers S. aureus biofilm. Som sådan kan nøytrofiler legges direkte til biofilmen for å vurdere aktiveringen. På den annen side produserer bakterier i biofilmer enzymer, som katalase og superoksiddismutase for å avgifte ROS23,56. Staphylococcus epidermidis biofilmer produserer høyere katalase enn sin planktoniske motpart under stress57. Den totale kjemiluminescensen av PMA-stimulerte nøytrofiler i en S. aureus-biofilm er signifikant lavere enn de PMA-stimulerte nøytrofile der biofilm er fraværende (figur 2). Dette kan skyldes aktiviteten til disse avgiftende enzymene. Videre produserer S. aureus biofilmer flere poredannende toksiner kalt leukocidiner som dreper nøytrofiler58. Den reduserte burstresponsen skyldes sannsynligvis også den reduserte levedyktigheten til nøytrofiler i nærvær av S. aureus biofilm. Mens denne studien bruker luminol som oppdager den totale ROS produsert både i og utenfor cellene, må andre reagenser, som CM-H 2 DCFDA (5-(og-6)-klormetyl-2'7'-diklordihydrofluorescein diacetat) eller isoluminol, vurderes hvis målet med arbeidet er å studere intracellulær eller ekstracellulær ROS-produksjon14,53,54 spesifikt.
Evnen til å visualisere nøytrofil-biofilm-interaksjoner via mikroskopi kan være informativ om oppførselen til nøytrofiler og biofilmer i nærvær av hverandre. Eksitasjons- og utslippsspektrene til fluorescerende fargestoffer og proteiner representerer et øyeblikksbilde av samspillet mellom en 18 timers S. aureus biofilm og nøytrofiler etter en 30 minutters inkubasjon. For å effektivt fange opp signaler fra fargede celler, er det viktig å begrense eksponeringen av prøvene til lyskilder mens du setter opp prøvene for mikroskopi. Under avbildning ble rask fotobleking av prøvene unngått ved å senke lyskildens intensitet ved justering av alle parametrene som Z-stackhøyde og eksponeringstid for forskjellige kanaler.
Disse enkle praksisene tillot riktig mikroskopiavbildning der det ble observert at få nøytrofiler er lokalisert i biofilmen (figur 4A). Dette kan skyldes mellomrom som er tilstede i biofilmen, da 18 timers S. aureus biofilm dyrket i MEMα med 2% glukose ikke dekker overflaten jevnt (figur 4B). Andre studiers bruk av rike medier har imidlertid vist en ensartet plen av S. aureus biofilmvekst og leukocytter som trenger gjennom biofilmen30,58. Videre er det også observert at det var nøytrofil celledød etter 30 minutters inkubasjon med S. aureus biofilmer på grunn av S. aureus biofilmproduserte leukocidiner som lyse nøytrofiler58 (figur 4A,D). Tilsetning av et vasketrinn for å fjerne ikke-festede nøytrofiler etter inkubering med biofilm i 30 minutter fjernet ~ 15% av døde nøytrofiler fra systemet sammenlignet med den uvaskede gruppen, hvor mikroskopi ble utført umiddelbart etter 30 minutters inkubasjon (figur 4D). Det ble også observert nøytrofiler som interagerer med S. aureus (figur 4C). Ytterligere eksperimenter er nødvendig for å vurdere om S. aureus er oppslukt av nøytrofiler eller festet til celleoverflaten til nøytrofiler54. Imaging nøytrofiler og biofilmer er det første trinnet for å evaluere flere nøytrofile funksjoner nedstrøms, for eksempel fagocytose og NETosis54,59. Effekten av nøytrofiler på biofilm kan også vurderes ved å kvantifisere biofilmbiomassen, strukturelle endringer i biofilmen og biofilmens levedyktighet, blant mange andre, ved hjelp av bildeanalyseverktøy oppført i trinn 5.6. Til slutt eksisterer donor-til-donor-variabilitet i nøytrofiler; Det anbefales derfor at minst tre forskjellige donorer brukes til studier som involverer nøytrofiler.
Samlet sett ble standardiserte in vitro-analyser kombinert for å vurdere interaksjoner mellom nøytrofiler og biofilmer. Selv om disse analysene bruker S. aureus, kan de beskrevne protokollene lett tilpasses for å studere andre patogener. Mens det finnes ulike in vivo-modeller for å studere vertspatogeninteraksjoner, kan de være dyre og arbeidsintensive, spesielt hvis forholdene ikke er optimalisert. Arbeid med standardiserte in vitro-analyser gjør det mulig å optimalisere eksperimentelle forhold og bekrefte observasjoner før man går over til et in vivo-system. Endelig har ulike dyreinfeksjonsmodeller blitt brukt til å studere biofilm-nøytrofile interaksjoner in vivo. Det er imidlertid viktig å vurdere immunologiske forskjeller mellom mennesker og dyremodeller60,61,62,63. Dette nødvendiggjør bruk av nøytrofiler avledet fra mennesker for å studere disse komplekse vertspatogeninteraksjonene.

En biofilm er et fellesskap av overflateassosierte mikrober eller ikke-vedlagte aggregater innkapslet i en ekstracellulær polymer substans (EPS)1,2. Disse samfunnene beskytter de innkapslede mikroorganismer mot miljøstressorer, inkludert toleranse for antimikrobielle midler og immunsystemet. Flere patogene mikrobielle arter danner biofilmer som har vært assosiert med kroniske infeksjoner4. Utviklingen av biofilm er en intrikat prosess som involverer festing til overflater, EPS-produksjon, celleproliferasjon, biofilmstrukturering og celleløsning5. Når celler sprer seg for å danne en biofilm, forblir de planktoniske eller translokerer til et nytt substratum og gjenopptar biofilmutvikling6.
Staphylococcus aureus, et opportunistisk patogen, følger en generell ordning for biofilmutvikling, inkludert vedlegg, spredning, modning og spredning7. Festeprosessen i S. aureus biofilmer dikteres av hydrofobe interaksjoner, teichoic syrer og mikrobielle overflatekomponenter som gjenkjenner klebende matrisemolekyler (MSCRAMMs)8,9. Når spredning av S. aureus begynner, produseres EPS, som hovedsakelig består av polysakkarider, proteiner, ekstracellulært DNA og teichoic syrer, 5. Etter hvert som EPS-komponenter produseres, produseres også forskjellige eksoenzymer og små molekyler, noe som bidrar til biofilmens 3-dimensjonale struktur og hjelper til med løsrivelse5. S. aureus utnytter denne svært koordinerte livsstilen for å etablere ulike kroniske infeksjoner, inkludert infeksjoner på grunn av inneboende medisinsk utstyr10.
Meticillinresistent S. aureus (MRSA) er en av de viktigste årsakene til infeksjoner relatert til inneliggende medisinsk utstyr, som sentrale vene- og urinkatetre, proteser, pacemakere, mekaniske hjerteventiler og intrauterin utstyr11. Under slike infeksjoner er nøytrofiler de første vertsimmuncellene som rekrutteres til infeksjonsstedet for å bekjempe patogener via flere strategier12. Disse inkluderer fagocytose, degranulering, produksjon av reaktive oksygen- og nitrogenarter (ROS / RNS), eller frigjøring av nøytrofile ekstracellulære feller (NETs) for å eliminere patogener13.
Generering av ROS ved fagocytose av mikrober er en av de viktigste antimikrobielle responsene som utvises av nøytrofiler14. Fagocytose forsterkes hvis mikrober er belagt med opsoniner, spesielt immunglobuliner og komplementkomponenter som finnes i serum15. De opsoniserte mikrober blir deretter gjenkjent av celleoverflatereseptorer på nøytrofiler og oppslukt, og danner et rom kalt fagosomet15. Nøytrofiler genererer og frigjør ROS i fagosomet via membranassosiert NADPH-oksidase16. Dette multikomponentenzymkomplekset genererer superoksidanioner ved å overføre elektroner til molekylært oksygen16. I tillegg genererer nøytrofiler også RNS gjennom ekspresjon av induserbar nitrogenoksidsyntase (iNOS)17. Disse høye superoksid- og nitrogenoksidradikalene i fagosomet har brede antimikrobielle aktiviteter. De kan samhandle med metallsentre i enzymer og skade nukleinsyrer, proteiner og cellemembraner av patogenet 18,19,20,21. Mange mikrober vedtar en biofilm-livsstil og bruker forskjellige strategier for å unngå drap med ROS22,23. Dermed er standardiserte analyser som par biofilmer med nøytrofiler for å kvantifisere ROS gunstig for konsistente resultater.
Mens analyser, for eksempel kvantifisering av nøytrofil ROS-produksjon, gir informasjon om responsene til nøytrofiler til biofilmer, kan evnen til å visualisere samspillet mellom nøytrofiler i en biofilm også tjene som et kraftig verktøy. Bruken av fluorescerende fargestoffer for mikroskopi krever ofte optimalisering for å oppnå bilder av høy kvalitet som kan brukes til mikroskopiavbildningsanalyse. Fleksibiliteten til å optimalisere noen forhold er begrenset da nøytrofiler kan gjennomgå celledød etter isolasjon. Videre vaskes biofilmer vanligvis for å fjerne den planktoniske populasjonen fra det eksperimentelle oppsettet før tilsetning av nøytrofiler. Under vask kan variabilitet mellom replikerende biofilmer oppstå på grunn av tap av delvis biomasse hvis biofilmer er løst festet til overflaten.
I stor grad inkluderer nåværende metoder i feltet for å analysere interaksjoner mellom nøytrofiler og biofilmer hovedsakelig mikroskopi, flowcytometri og kolonidannende enheter (CFU) oppregning 24,25,26,27. Mikroskopi innebærer bruk av fargestoffer som enten direkte flekker nøytrofile og biofilmer, eller retter seg mot forskjellige nøytrofile responser mot mikrober som NET-dannelse, degranulering og celledød25,28. En undergruppe av disse responsene, som nøytrofil celledød og degranulering, kan også analyseres via flowcytometri, men krever at nøytrofiler fortrinnsvis ikke er assosiert med store mengder mikrober i en biofilm28,29. Flowcytometri kan også kvantifisere noen biofilmparametere, for eksempel cellens levedyktighet27. Disse prosessene krever imidlertid forstyrrelse av biofilmbiomassen og vil ikke være nyttige for å visualisere andre viktige interaksjoner som romlig fordeling av nøytrofiler og deres komponenter i en biofilm27,29,30.
Den nåværende protokollen fokuserer på å tilpasse noen av de tradisjonelt brukte metodene for å studere nøytrofil-biofilminteraksjoner på biofilmer som er optimalisert for å gi minimal variasjon under håndtering. Denne protokollen gir dermed standardiserte metoder for å vokse og kvantifisere biofilmer, isolere primære humane nøytrofiler fra perifert blod, kvantifisere ROS-produksjon og visualisere biofilm-nøytrofile interaksjoner via mikroskopi. Denne protokollen kan tilpasses forskjellige systemer for å forstå biofilm-nøytrofile interaksjoner mens man vurderer heterogeniteten mellom donorbassenger.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% sodium chloride irrigation, USP</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>2F7124</td>
			<td>Endotoxin-free; Used for isolation of neutrophils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mL rapid-flow filter unit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>565-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 proof ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89125-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td>Used for blood draw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td>Used for blood draw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1423-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swab</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>Used for blood draw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band-aids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for blood draw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Bacto Tryptic Soy Broth</td>
			<td>BD</td>
			<td>DF0370-07-5</td>
			<td>Combine with 1.5% agar to make Tryptic Soy Agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Bal Saupply</td>
			<td>202C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker blue CMCH</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C2111</td>
			<td>Blue CMAC Dye (BCD)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear bottom 96-well flat bottom polystyrene plates</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton gauze</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-761-52</td>
			<td>Used for blood draw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet</td>
			<td>Acros Organic</td>
			<td>40583-0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14-961-27</td>
			<td>Borosilicate Glass 13 x 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G-8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran from Leuconostoc spp.</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>31392-250G</td>
			<td>Used for isolation of neutrophils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (DPBS) 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium homodimer-1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224 B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque plus</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17144003</td>
			<td>Used for isolation of neutrophils (density gradient medium)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; balanced salt solution (HBSS) 1x</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>21-022-CV</td>
			<td>without calcium, magnesium, and phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Bright Line</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Novaplus</td>
			<td>NDC 63323-540-57</td>
			<td>1000 USP units/mL, Used for blood draw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMARIS 9.8</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8511-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimal essential media (MEM) Alpha 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41061-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle (23 G1)</td>
			<td>BD</td>
			<td>305145</td>
			<td>Used for blood draw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti2</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Quantification of dead neutrophils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal human serum</td>
			<td>Complement Technology</td>
			<td>NHS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish (100 x 15 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4707-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP358-10</td>
			<td>Used for neutrophil isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SoftMax Pro Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Microplate reader software used for data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax i3x</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water for irrigation, USP</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>2F7114</td>
			<td>Endotoxin-free; Used for neutrophil isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surflo winged infusion set</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SC*19BLK</td>
			<td>19 G x 3/4&#34;, used for blood draw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain (0.4%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turnicate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for blood draw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White opaque 96-well plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353296</td>
			<td>Tissue culture treated and flat bottom plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;-Slide VI 0.4</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80601</td>
			<td>&#956;-channel slide</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standardized in vitro assays to visualize and quantify interactions between human neutrophils and staphylococcus aureus biofilms

Neutrofiler er den første forsvarslinjen som brukes av immunsystemet under mikrobiell infeksjon. In vivo rekrutteres nøytrofiler til infeksjonsstedet der de bruker prosesser som fagocytose, produksjon av reaktive oksygen- og nitrogenarter (henholdsvis ROS, RNS), NETosis (nøytrofil ekstracellulær felle) og degranulering for å drepe mikrober og løse infeksjonen. Interaksjoner mellom nøytrofiler og planktoniske mikrober har blitt grundig studert. Det har vært nye interesser i å studere infeksjoner forårsaket av biofilm de siste årene. Biofilmer viser egenskaper, inkludert toleranse for drap av nøytrofiler, forskjellig fra deres planktonisk dyrkede kolleger. Med den vellykkede etableringen av både in vitro og in vivo biofilmmodeller, kan interaksjoner mellom disse mikrobielle samfunnene med forskjellige immunceller nå undersøkes. Her er teknikker som bruker en kombinasjon av tradisjonelle biofilmmodeller og veletablerte nøytrofile aktivitetsanalyser skreddersydd spesielt for å studere nøytrofile og biofilminteraksjoner. Bredfeltfluorescensmikroskopi brukes til å overvåke lokalisering av nøytrofiler i biofilmer. Disse biofilmene dyrkes under statiske forhold, etterfulgt av tilsetning av nøytrofiler avledet fra humant perifert blod. Prøvene er farget med passende fargestoffer før visualisering under mikroskopet. I tillegg kvantifiseres produksjonen av ROS, som er en av de mange nøytrofile responsene mot patogener, i nærvær av en biofilm. Tilsetningen av immunceller til dette etablerte systemet vil utvide forståelsen av vertspatogeninteraksjoner samtidig som det sikres bruk av standardiserte og optimaliserte forhold for å måle disse prosessene nøyaktig.

Mediene som brukes til å dyrke bakterielle biofilmer påvirker overlevelsen av nøytrofiler. Ulike medier ble testet for å redusere effekten av media alene på levedyktigheten til nøytrofiler for å studere nøytrofil-biofilm-interaksjoner (figur 1). Bakterielle vekstmedier som tryptisk soyabuljong minimerer levedyktigheten til nøytrofiler, slik at ~ 60% av nøytrofile er i live etter en 30 minutters inkubasjonsperiode ved 37 ° C med 5% CO2. Pattedyrcellekulturmedier, som MEMα, påvirker ikke levedyktigheten til nøytrofiler og støtter veksten av S. aureus biofilmer. Faktisk fremmer minimale medier robust vekst av biofilmer i andre bakterier46,47.
For å vurdere effekten av media på biofilmvekst og variabilitet i biofilmbiomassekvantifisering etter vask av biomassen for å eliminere planktoniske celler, ble en 18 timers S. aureus biofilm dyrket i en 96-brønns plate, med brønner behandlet eller ubehandlet med poly-L-lysin. En næringsrik (tryptisk soyabuljong (TSB)) og minimal (MEMα) media ble brukt som den er eller supplert med 2% glukose. Biofilmbiomassen farget med CV viste at S. aureus biofilm dyrket i MEMα supplert med 2% glukose produserte den mest robuste biofilmen blant alle testede medier (figur 2A). Videre viste biofilmer dyrket i PLL forbehandlede brønner som inneholdt MEMα + 2% glukose mindre variabilitet enn biofilmer i PLL-ubehandlede brønner som inneholdt MEMα + 2% glukose. Disse biofilmene viste mindre variasjon i kvantifisering via CV-analyse35 og CFU/ml når de ble belagt etter nøyaktig håndtering av biofilm for kvantifisering av biomasse. Disse biofilmene inneholdt i gjennomsnitt 1 x 108 CFU/ml, som vist ved plating av biofilmene på 3 separate dager (figur 2B). Dette tallet er nyttig for å bestemme antall nøytrofiler som skal legges til biofilmene for nøytrofile funksjonsanalyser.
For å måle ROS-produksjon av nøytrofiler som svar på biofilmer, ble S. aureus biofilmer dyrket statisk i 18-20 timer i en 96-brønnplate. Biofilmer ble deretter opsonisert, og nøytrofiler ble tilsatt. ROS-produksjonen ble deretter målt i 60 min (figur 3A). Arealet under kurven beregnes ut fra den kinetiske kurven for å kvantifisere total ROS-produksjon med nøytrofiler. Neutrofiler behandlet med en agonist, som PMA, brukt som kontroll, viser økt ROS-produksjon. I fravær av biofilm viste nøytrofiler behandlet med PMA robust ROS-produksjon. I nærvær av S. aureus biofilm ble den totale ROS-produksjonen av nøytrofiler behandlet med PMA redusert. I fravær av PMA er nøytrofiler utelukkende avhengige av samspillet med biofilmen, noe som ytterligere reduserer mengden ROS produsert (figur 3B).
For å visualisere nøytrofil-biofilm-interaksjonene ved bruk av fluorescensmikroskopi, ble en GFP-uttrykkende stamme av S. aureus, Blue CMAC-fargestoff og ethidium homodimer-1, som flekker cytoplasmaet til henholdsvis levende celler og DNA fra døde celler, brukt. S. aureus biofilm ble dyrket i 18 timer i et 6 μ-kanals lysbilde. Blå CMAC fargestoffmerkede nøytrofiler ble tilsatt sammen med ethidium homodimer-1 til de vaskede biofilmene og inkubert i 30 minutter ved 37 ° C med 5% CO2 før avbildning. Vidvinkelfluorescerende mikroskopi viste at mange nøytrofiler var lokalisert til overflaten av S. aureus biofilm, mens noen få er innenfor biofilmen (figur 4A). Interaksjonen mellom S. aureus-celler i nøytrofiler var også tydelig (figur 4C). De fleste av S. aureus-cellene som interagerer med nøytrofiler (cyan) var døde (magenta), mens noen få forble i live (gule) som bestemt av levende døde flekker (figur 4C). Til sammenligning ble GFP-uttrykkende S. aureus biofilmer farget med ethidium homodimer-1, som avslørte en brøkdel av den døde S. aureus-populasjonen i biofilmen (figur 4B). Ikke-levedyktige nøytrofiler som var positive for ethidium homodimer-1 ble kvantifisert ved hjelp av analyseprogramvare (se Materialtabell) etter inkubasjon med S. aureus biofilm. Omtrent 48% av nøytrofile var allerede døde innen 30 minutter etter inkubasjon med S. aureus biofilm. Under optimalisering av mikroskopiprotokollen ble effekten av å vaske biofilm og nøytrofiler etter 30 minutters inkubasjon for å fjerne ikke-adhererte nøytrofiler også vurdert, og avslørte rundt 33% av døde nøytrofiler som fortsatt er festet til biofilmen (figur 4D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63773/63773fig1v2.jpg"> Figur 1: LIVE-DEAD assay sammenligner nøytrofil overlevelse mellom bakterielle og pattedyrs vekstmedier. Nøytrofiler ble isolert og inkubert i HBSS, MEMα, TSB eller 0,1 % SDS i 30 minutter. LIVE-DEAD farging ble utført ved bruk av Calcein AM (live) og ethidium homodimer-1 (død). Prosent av levende nøytrofiler ble bestemt, hvor HBSS-inkuberte nøytrofiler ble behandlet som 100% levende nøytrofiler. Resultatene representerer i gjennomsnitt to uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer, med nøytrofiler oppnådd fra to forskjellige givere. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD (*p < 0,05, ****p < 0,0001. Enveis ANOVA). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63773/63773fig01large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63773/63773fig02.jpg"> Figur 2: Kvantifisering av biofilmbiomasse under ulike forhold og bakteriell levedyktighet for biofilm dyrket under optimaliserte forhold. (A) S. aureus ble sådd i en 96-brønns plate enten belagt eller ubestrøket med poly-L-lysin (PLL). Biofilmer ble dyrket i TSB, MEMα eller et av mediene supplert med 2% glukose under statiske forhold i 18 timer. Krystallfiolett (CV) farging ble utført for å beise biofilmbiomasse. Den eluerte CV-flekken ble fortynnet kl. 01.10 og lest i en mikroplateleser. Resultatene representerer i gjennomsnitt tre uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer. Data presenteres som gjennomsnitt ± SD. SD for hver gruppe er vist nederst for å demonstrere forskjellig variasjon i biofilmvekstforhold. (B) Bakterielle CFU-tall ble oppnådd fra biofilmer dyrket i et optimalisert medium (MEMα + 2% glukose). De 18 timers statiske biofilmene ble utsatt for samme antall vasker etterfulgt av en 10 minutters sonikering for å løsne biofilmbiomassen og passert gjennom en 22G-nål for å forstyrre aggregatene før plating. Resultatene representerer tre replikasjoner utført i tre eksemplarer. Data presenteres som gjennomsnitt ± SD (ns = ikke signifikant. Enveis ANOVA). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63773/63773fig02large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63773/63773fig03.jpg"> Figur 3: Kvantifisering av ROS-produksjon med nøytrofiler via kjemiluminescensanalyse. (A) Neutrofiler (PMN) ble inkubert med HBSS-vasket S. aureus biofilm (BF) enten i nærvær (lukket grå trekant) eller fravær (åpen grå invertert trekant) av PMA for å måle ROS-produksjon av nøytrofiler. Luminol ble brukt til å oppdage ROS hvert 3. minutt i 60 minutter i en mikroplateleser. Mens nøytrofiler behandlet med PMA i fravær av en biofilm (lukket svart sirkel) fungerte som en positiv kontroll, fungerte nøytrofile bare (åpen svart sirkel) og biofilm bare (åpen grå trekant) grupper som negative kontroller. Data representerer i gjennomsnitt to uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer med nøytrofiler oppnådd fra to forskjellige givere. Data presenteres som gjennomsnitt ± SD. (B) Arealet under kurven fra (A) ble beregnet for å kvantifisere den totale ROS generert av nøytrofilene. Dataene er representert som gjennomsnitt ± SD. (***p < 0,0001. Enveis ANOVA). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63773/63773fig03large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63773/63773fig04.jpg"> Figur 4: Visualisering av samspillet mellom S. aureus biofilm og nøytrofiler ved bruk av bredfelt fluorescensmikroskopi. Blå CMAC fargestoff-merkede nøytrofiler (cyan) ble supplert med ethidium homodimer-1 (magenta; død) før inkubering med en 18 timers S. aureus biofilm (gul). Biofilm-nøytrofile interaksjoner ble avbildet ved hjelp av bredfelt fluorescerende mikroskopi og bilder behandlet ved hjelp av en bildeanalyseprogramvare. Eksperimenter ble utført med tre forskjellige givere. Representative bilder presenteres som (A) 3D-visning av S. aureus biofilm med levende (cyan) og død (magenta; noen få indikert med hvite piler) nøytrofiler, (B) 3D-visning av en S. aureus biofilm i fravær av nøytrofiler med enten levende S. aureus som uttrykker GFP (gul) eller død S. aureus farget med ethidium homodimer-1 (magenta), (C) et ortogonalt syn på S. aureus og nøytrofil interaksjon som avbildet av xy-, yz- og xz-planene, og (D) kvantifisering av nøytrofil levedyktighet i nærvær av S. aureus biofilm etter 30 minutter enten umiddelbart (uvasket) eller etter tre runder med vask med HBSS for å fjerne ikke-adhererte nøytrofiler (vasket). Nøytrofil celledød er presentert som gjennomsnitt ± SD (Student t-test). Skalalinjen indikerer 50 μm i (A) og (B) og 10 μm i (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63773/63773fig04large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Standardized In vitro Assays to Visualize and Quantify Interactions between Human Neutrophils and Staphylococcus aureus Biofilms at JoVE.com

Standardized In vitro Assays to Visualize and Quantify Interactions between Human Neutrophils and Staphylococcus aureus Biofilms

Denne protokollen beskriver studiet av nøytrofil-biofilm-interaksjoner. Staphylococcus aureus biofilmer er etablert in vitro og inkuberes med perifere blodavledede humane nøytrofiler. Den oksidative burstresponsen fra nøytrofiler kvantifiseres, og nøytrofillokaliseringen i biofilmen bestemmes ved mikroskopi.

Standardiserte in vitro-analyser for å visualisere og kvantifisere interaksjoner mellom humane nøytrofiler og Staphylococcus aureus biofilmer

Neutrophils are the first line of defense deployed by the immune system during microbial infection. In vivo, neutrophils are recruited to the site of ...

Disse protokollene er utformet for å forstå hvordan menneskelige nøytrofiler interagerer med og dreper bakterielle biofilmer. Målet er å forstå dette bedre, og å begrense variasjonen fra analyse til analyse, og forstå at det er iboende problemer med menneskelige nøytrofiler fra donor til donorvariasjon. Teknikkene som er oppført her, er optimalisert for å tillate brukerne å utføre eksperimenter med minimal variasjon, spesielt med løst vedlagte biofilmer.I tillegg kan disse protokollene også tilpasses for å studere andre mikrober som kan danne biofilmer. Begynn med å skaffe isolerte kolonier av Staphylococcus aureus fra en kryopreservert bestand ved hjelp av en strekplateteknikk på en næringsrik agarplate, for eksempel tryptisk soya agar. Belegg individuelle brønner av en 96-brønns plate med 100 mikroliter PLL fortynnet i sterilt vann og inkuber ved romtemperatur i 30 minutter.Aspirer PLL-løsningen aseptisk ved hjelp av en vakuumassistert aspirasjonsfelle. La brønnene tørke over natten ved romtemperatur. Forbered en nattkultur ved å inokulere en koloni av S.aureus i MEM-alfa supplert med 2% glukose og inkubert ved 37 grader Celsius i 16 til 18 timer ved 200 rotasjoner per minutt.Fortynn nattkulturen ved å overføre 50 mikroliter til fem milliliter fersk MEM-alfa supplert med 2% glukose. Inkuber den deretter ved 37 grader Celsius ved 200 rotasjoner per minutt til midten av logaritmisk fase oppnås. Bruk MEM-alfa til å normalisere mellomlogaritmisk kultur til en OD på 0,1.Overfør 150 mikroliter normalisert kultur til hver brønn på PLL-behandlet 96-brønnplate. Inkuber platen i et fuktet kammer ved 37 grader Celsius i 18 til 20 timer. Aspirer supernatanten for å fjerne de planktoniske cellene.Vask forsiktig den gjenværende biomassen med 150 mikroliter HBSS for å fjerne de ufestede cellene. Gjenta minst to ganger for å fjerne alle planktoniske celler. Tilsett 100 mikroliter med 20% normalt humant serum fortynnet i HBSS dråpevis til den vasket biofilmen og inkuber ved 37 grader Celsius i 30 minutter for å opsonisere biofilmen.Aspirer serumoppløsningen og vask biofilmene dråpevis med 150 mikroliter HBSS. Aspirer HBSS, etterlater brønner med opsoniserte biofilmer. Legg luminol til nøytrofile re-suspendert i HBSS for å utgjøre en endelig konsentrasjon av fem mikromolar luminol.Denne løsningen er klar til bruk for gruppe A og C.Legg nøytrofiler blandet med luminol til brønnene med opsoniserte biofilmer. For gruppe D, lag 50 mikromolær luminoloppløsning i HBSS i et eget rør uten nøytrofiler, og legg det til brønnen som inneholder biofilmen. Aliquot 350 mikroliter nøytrofiler blandet med luminol og tilsett PMA ved en endelig konsentrasjon på 500 nanogram per milliliter til blandingen.For gruppe B, tilsett nøytrofile fra denne blandingen i brønner uten biofilm. Dette fungerer som en positiv kontroll. Sentrifuge platen ved 270 RCF i 30 sekunder ved fire grader Celsius.Forsikre deg om at plateleseren er satt til 37 grader Celsius, luminescensen og kinetisk avlesning i 60 minutter med tre minutters intervaller. Plasser platen i plateleseren for å måle ROS-produksjonen med nøytrofiler i 60 minutter. Bruk en fluorescerende stamme av S.aureus, for eksempel USA300, som uttrykker GFP for å lette mikroskopibilder.Inkuber nøytrofiler med 100 mikromolar BCD i 30 minutter i en rocker ved 37 grader Celsius med 5% atmosfærisk karbondioksid. Sørg for at prøvene inkuberes i mørket, og begrens lyseksponeringen. For å vaske overflødig BCD, sentrifuger nøytrofiler ved 270 RCF i fem minutter, og aspirerer supernatanten.Re-suspendere nøytrofile i fersk HBSS. Deretter legger du til ethidium homodimer-1 til BCD-fargede nøytrofiler ved en endelig konsentrasjon av fire mikromolar for å overvåke nøytrofil og bakteriell død. Vask biofilmen med HBSS og tilsett 150 mikroliter nøytrofiler til S.aureus biofilm som har blitt dyrket i mikroslides.Inkuber mikrolysbildene i et fuktet kammer i 30 minutter. Antall bakterieceller vil være basert på celletallene oppnådd fra 18-timers biofilmbelegg. Bilde nøytrofilbiofilminteraksjonen ved bruk av fluorescerende kanaler som tilsvarer fluorescerende fargestoffer, eller proteiners eksitasjons- og utslippsbølgelengder.Bakterievekstmedier minimerte levedyktigheten til nøytrofiler til ca. 60 % etter 30 minutters inkubasjonstid. Pattedyrcellekulturmedier påvirket imidlertid ikke levedyktigheten til nøytrofiler, og kan også støtte veksten av S.aureus biofilmer. Nøytrofiler behandlet med PMA brukt som kontroll viste økt ROS-produksjon.I fravær av biofilm viste nøytrofiler behandlet med PMA robust ROS-produksjon. I nærvær av S.aureus biofilm ble den totale ROS-produksjonen av nøytrofiler behandlet med PMA redusert, mens i fravær av PMA stolte nøytrofiler utelukkende på samspillet med biofilmen, noe som ytterligere reduserte ROS-produksjonen. Widefield fluorescerende mikroskopi viste at mange nøytrofiler ble lokalisert til overflaten mens noen få var innenfor S. aureus biofilmer.De fleste av S.aureus-cellene som interagerte med nøytrofiler var døde, mens noen få forble i live som bestemt av LIVE / DEAD-farging. Ethidium homodimer-1-farget biofilm avslørte en brøkdel av den døde S.aureus-befolkningen i biofilmen. Effekten av å vaske biofilm og nøytrofiler etter 30 minutters inkubasjon for å fjerne ikke-adhererte nøytrofiler viste at rundt 33% av døde nøytrofiler fortsatt var festet til biofilmen.Protokollene som er oppført her, kan også brukes til å studere andre funksjoner av nøytrofiler, som fagocytose, og dannelse av nøytrofile ekstracellulære feller når nøytrofiler møter biofilmer.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Standardized In vitro Assays to Visualize and Quantify Interactions between Human Neutrophils and Staphylococcus aureus Biofilms

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA)

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus MRSA

MRSA is a worldwide threat to public health, and MRSA skin and soft-tissue infections now account for more than half of all soft-tissue infections in the ...

Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in Rat

Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus MRSA in Rat

Eksperimentell Endokarditt Modell av Meticillin Resistent<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; (MRSA) i Rat

Endovascular infections, including endocarditis, are life-threatening infectious syndromes1-3. Staphylococcus aureus is the most common world-wide cause ...

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Staphylococcus aureus Vekst med humant hemoglobin som en Iron Source

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

Studerer Samhandling av<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Med Neutrophils ved flowcytometri og Time Lapse Mikroskopi

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel<em&gt; In vitro</em&gt; Modell for å studere samspillet mellom humant fullblod og endotelet

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

Høy gjennomstrømning Måling av ekstracellulært DNA Slipp og kvantitative NET-formasjonen i Human Neutrophils<em&gt; In Vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Targeting Biofilm Associated<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Bruke Resazurin Basert Narkotika mottakelighet analyse

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

genotyping av<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; av Ribosomalt Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

Metodikk for studier av horisontal genoverføring i<em&gt; Staphylococcus aureus</em

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to ...

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

En musemodell å vurdere medfødte immunforsvaret til Staphylococcus aureus infeksjoner

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...