Name: standardized in vitro assays to visualize and quantify interactions between human neutrophils and staphylococcus aureus biofilms
Uploaded: 2022-06-08T14:00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Standardized In vitro Assays to Visualize and Quantify Interactions between Human Neutrophils and Staphylococcus aureus Biofilms at JoVE.com

Эта работа финансировалась Национальным институтом аллергии и инфекционных заболеваний (R01AI077628) для DJW и премией Американской кардиологической ассоциации за развитие карьеры (19CDA34630005) для ESG. Мы благодарим д-ра Пола Стэндли за предоставление нам штамма США 300 LAC GFP. Кроме того, мы признаем ресурсы из Центра микроскопии и визуализации кампуса (CMIF) и Комплексного онкологического центра OSU (OSUCCC) Microscopy Shared Resource (MSR), Университета штата Огайо. Мы также благодарим Амелию Стаатс, Питера Бербэка и Лизу Коулман из лаборатории Стэндли за проведение забора крови.

Авторам нечего раскрывать.

Были предприняты многочисленные усилия по выращиванию надежных и воспроизводимых биопленок S. aureus для последующих экспериментов in vitro 48,49,50. Изложен стандартизированный протокол, который использует катионную природу ФАПЧ, а также дополняет среды глюкозой для роста надежных биопленок S. aureus in vitro. Добавление ФАПЧ позволяет лучше прикреплять отрицательно заряженную бактериальную клетку к положительно заряженным поверхностям с покрытием ФАПЧ. Важно отметить, что ФАПЧ при концентрации 10 мкг/мл обладает антимикробной активностью в отношении Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli и S. aureus при инкубации в течение 24 ч51. Такая же концентрация используется для покрытия поверхностей; однако избыток ФАПЧ аспирируется, в результате чего концентрация ФАПЧ ниже 10 мкг/мл при посеве для роста биопленки.
Важно отметить, что PLL работал только в специфических средах роста, таких как MEMα с 2% глюкозы, где было замечено, что S. aureus производит надежные биопленки с минимальной изменчивостью (рисунок 2A). Концентрация ФАПЧ для использования в сочетании с другими типами сред потребует дальнейшей оптимизации, такой как использование повышенной концентрации ФАПЧ для покрытия скважин. Кроме того, эти условия были оптимизированы для моновидовой биопленки S. aureus . В то время как хронические раневые биопленки часто являются полимикробными, стандартизация анализов для изучения моновидовой биопленки и ее взаимодействия с нейтрофилами и другими иммунными клетками является ключом к пониманию их вклада в патогенез52. Эти стандартизированные протоколы могут быть дополнительно оптимизированы для поддержания и изучения полимикробных биопленок и их взаимодействия с нейтрофилами.
Было также отмечено, что богатые бактериальные питательные среды, такие как TSB, приводят к потере жизнеспособности нейтрофилов (рисунок 1). Поэтому были оптимизированы условия роста биопленок S. aureus в MEMα, используемых для культур клеток млекопитающих. Для исследований с участием нейтрофилов эта среда поддерживает жизнеспособность нейтрофилов и способствует росту S. aureus . Хотя было замечено, что среды влияют на жизнеспособность нейтрофилов, также важно учитывать, что нейтрофилы, выделенные из периферической крови человека, подвергаются апоптозу ex vivo с примерно 70% апоптотических нейтрофилов к 20 ч53. Это требует правильного обращения, такого как хранение нейтрофилов на льду при подготовке к экспериментам, использование реагентов без эндотоксинов и предотвращение активации нейтрофилов, избегая вихря образцов с нейтрофилами.
Оценка окислительного всплеска в нейтрофилах обычно проводится для определения убивающего эффекта нейтрофилов на возбудителя 14,54,55. Эти исследования часто проводятся с планктонными бактериями, где добавляются нейтрофилы, а окислительный взрывной ответ количественно определяется с использованием люминол-амплифицированной хемилюминесценции, которая обнаруживает супероксидные анионы, продуцируемые нейтрофилами. Настоящий протокол модифицируется путем замены планктонных бактерий статически выращенной 18-часовой биопленкой S. aureus. Таким образом, нейтрофилы могут быть непосредственно добавлены в биопленку для оценки их активации. С другой стороны, бактерии в биопленках продуцируют ферменты, такие как каталаза и супероксиддисмутаза для детоксикации ROS23,56. Биопленки Staphylococcus epidermidis производят больше каталазы, чем его планктонный аналог при стрессе57. Общая хемилюминесценция ПМА-стимулированных нейтрофилов в биопленке S. aureus значительно ниже, чем у нейтрофилов, стимулируемых ПМА, где биопленка отсутствует (рисунок 2). Это может быть связано с активностью этих детоксикационных ферментов. Кроме того, биопленки S. aureus производят несколько порообразующих токсинов, называемых лейкоцидинами, которые убивают нейтрофилы58. Снижение реакции на всплеск также вероятно из-за снижения жизнеспособности нейтрофилов в присутствии биопленки S. aureus. В то время как в этом исследовании используется люминол, который обнаруживает общий АФК, продуцируемый как внутри, так и снаружи клеток, другие реагенты, такие как CM-H2DCFDA (5-(и-6)-хлорметил-2'7'-дихлордигидрофлюоресцеин диацетат) или изолюминол, должны быть рассмотрены, если целью работы является изучение внутриклеточной или внеклеточной продукции АФК 14,53,54 конкретно.
Способность визуализировать взаимодействия нейтрофилов и биопленок с помощью микроскопии может быть информативной о поведении нейтрофилов и биопленок в присутствии друг друга. Спектры возбуждения и излучения флуоресцентных красителей и белков представляют собой снимок взаимодействия между 18-часовой биопленкой S. aureus и нейтрофилами после 30-минутной инкубации. Для эффективного захвата сигналов от окрашенных клеток важно ограничить воздействие образцов на источники света при настройке образцов для микроскопии. При визуализации быстрого фотоотбеливания образцов удалось избежать за счет снижения интенсивности источника света при регулировке всех параметров, таких как высота Z-стека и время экспозиции для разных каналов.
Эти простые методы позволили провести правильную микроскопическую визуализацию, где было замечено, что в биопленке локализовано мало нейтрофилов (рисунок 4А). Это может быть связано с пространствами, присутствующими внутри биопленки, поскольку 18 ч S. aureus биопленка, выращенная в MEMα с 2% глюкозой, неравномерно не покрывает поверхность (рисунок 4B). Тем не менее, использование других исследований богатых сред показало однородный газон роста биопленки S. aureus и лейкоцитов, проникающих через биопленку30,58. Кроме того, также наблюдается гибель клеток нейтрофилов после 30 мин инкубации с биопленками S. aureus из-за лейкоцидинов, продуцируемых биопленкой S. aureus, которые лизируют нейтрофилы58 (рисунок 4A,D). Добавление промывочного этапа для удаления неприлипших нейтрофилов после инкубации их биопленкой в течение 30 мин удаляло ~15% мертвых нейтрофилов из системы по сравнению с немытой группой, в которой микроскопию проводили сразу после 30 мин инкубации (рисунок 4D). Также наблюдались нейтрофилы, взаимодействующие с S. aureus (рисунок 4C). Необходимы дальнейшие эксперименты, чтобы оценить, поглощен ли S. aureus нейтрофилами или прикреплен к клеточной поверхности нейтрофилов54. Визуализация нейтрофилов и биопленок является первым шагом для оценки нескольких функциональных возможностей нейтрофилов, таких как фагоцитоз и NETosis54,59. Влияние нейтрофилов на биопленки также может быть оценено путем количественной оценки биомассы биопленки, структурных изменений биопленки и жизнеспособности биопленки, среди многих других, с использованием инструментов анализа изображений, перечисленных на этапе 5.6. Наконец, изменчивость от донора к донору существует в нейтрофилах; таким образом, рекомендуется использовать по крайней мере трех различных доноров для исследований с участием нейтрофилов.
В целом, стандартизированные анализы in vitro были объединены для оценки взаимодействия между нейтрофилами и биопленками. Хотя эти анализы используют S. aureus, описанные протоколы могут быть легко адаптированы для изучения других патогенов. Хотя существуют различные модели in vivo для изучения взаимодействий хозяина и патогена, они могут быть дорогостоящими и трудоемкими, особенно если условия не оптимизированы. Работа со стандартизированными анализами in vitro позволяет оптимизировать экспериментальные условия и подтвердить наблюдения перед переходом на систему in vivo. Наконец, различные модели инфекции животных были использованы для изучения взаимодействий биопленки и нейтрофилов in vivo. Тем не менее, важно учитывать иммунологические различия между человеческими и животными моделями 60,61,62,63. Это требует использования нейтрофилов, полученных от людей, для изучения этих сложных взаимодействий хозяин-патоген.

Биопленка представляет собой сообщество поверхностно-ассоциированных микробов или неприсоединенных агрегатов, заключенных во внеклеточное полимерное вещество (EPS)1,2. Эти сообщества защищают заключенные микроорганизмы от стрессоров окружающей среды, включая толерантность к противомикробным агентам и иммунной системе3. Несколько патогенных микробных видов образуют биопленки, которые были связаны с хроническими инфекциями4. Разработка биопленок представляет собой сложный процесс, включающий прикрепление к поверхностям, производство EPS, пролиферацию клеток, структурирование биопленки и отслоение клеток5. Как только клетки рассеиваются с образованием биопленки, они остаются планктонными или перемещаются в новый субстрат и повторно инициируют развитие биопленки6.
Золотистый стафилококк, условно-патогенный микроорганизм, следует общей схеме развития биопленки, включая прикрепление, пролиферацию, созревание и рассеивание7. Процесс присоединения в биопленках S. aureus продиктован гидрофобными взаимодействиями, тейховыми кислотами и компонентами поверхности микробов, распознающими молекулы адгезивной матрицы (MSCRAMMs)8,9. По мере того, как начинается пролиферация S. aureus, EPS, которая в основном состоит из полисахаридов, белков, внеклеточной ДНК и тейховых кислот, продуцируется5. По мере производства компонентов EPS также образуются различные экзоферменты и малые молекулы, способствующие 3-мерной структуре биопленки и способствующие отслоению5. S. aureus использует этот высоко скоординированный образ жизни для установления различных хронических инфекций, включая инфекции, вызванные пребыванием в медицинских устройствах10.
Метициллин-резистентный S. aureus (MRSA) является одной из ведущих причин инфекций, связанных с внутренними медицинскими устройствами, такими как центральные венозные и мочевые катетеры, протезные суставы, кардиостимуляторы, механические клапаны сердца и внутриматочные устройства11. Во время таких инфекций нейтрофилы являются первыми иммунными клетками-хозяевами, набранными в место инфекции для борьбы с патогенами с помощью нескольких стратегий12. К ним относятся фагоцитоз, дегрануляция, производство активных форм кислорода и азота (АФК/RNS) или высвобождение внеклеточных ловушек нейтрофилов (НЭТ) для устранения патогенов13.
Генерация АФК при фагоцитозе микробов является одним из ключевых антимикробных ответов, проявляемых нейтрофилами14. Фагоцитоз усиливается, если микробы покрыты опсонинами, особенно иммуноглобулинами и компонентами комплемента, содержащимися в сыворотке15. Затем опсонизированные микробы распознаются рецепторами клеточной поверхности на нейтрофилах и поглощаются, образуя компартмент, называемый фагосомой15. Нейтрофилы генерируют и высвобождают АФК в фагосоме через мембраноассоциированную NADPH-оксидазу16. Этот многокомпонентный ферментный комплекс генерирует супероксидные анионы путем переноса электронов в молекулярный кислород16. Кроме того, нейтрофилы также генерируют RNS посредством экспрессии индуцируемой синтазы оксида азота (iNOS)17. Эти радикалы с высоким содержанием супероксида и оксида азота в фагосоме обладают широкой антимикробной активностью. Они могут взаимодействовать с металлическими центрами в ферментах и повреждать нуклеиновые кислоты, белки и клеточные мембраны возбудителя 18,19,20,21. Многочисленные микробы принимают биопленочный образ жизни и используют различные стратегии, чтобы избежать убийства ROS22,23. Таким образом, стандартизированные анализы, которые связывают биопленки с нейтрофилами для количественной оценки АФК, полезны для последовательных результатов.
В то время как анализы, такие как количественная оценка производства АФК нейтрофилов, предоставляют информацию о реакциях нейтрофилов на биопленки, способность визуализировать взаимодействия нейтрофилов в биопленке также может служить мощным инструментом. Использование флуоресцентных красителей для микроскопии часто требует оптимизации для получения высококачественных изображений, которые могут быть использованы для анализа изображений микроскопии. Гибкость для оптимизации некоторых условий ограничена, поскольку нейтрофилы могут подвергаться гибели клеток после изоляции. Кроме того, биопленки обычно промывают, чтобы удалить планктонную популяцию из экспериментальной установки перед добавлением нейтрофилов. Во время промывки изменчивость между реплицированными биопленками может возникнуть из-за потери частичной биомассы, если биопленки слабо прилипают к поверхности.
В целом, современные методы в этой области для анализа взаимодействий между нейтрофилами и биопленками в основном включают микроскопию, проточную цитометрию и перечисление колониеобразующих единиц (КОЕ) 24,25,26,27. Микроскопия включает в себя использование красителей, которые либо непосредственно окрашивают нейтрофилы и биопленки, либо нацелены на различные реакции нейтрофилов против микробов, таких как образование NET, дегрануляция и гибель клеток25,28. Подмножество этих реакций, таких как гибель нейтрофильных клеток и дегрануляция, также может быть проанализировано с помощью проточной цитометрии, но требует, чтобы нейтрофилы были преимущественно не связаны с большими агрегатами микробов в биопленке 28,29. Проточная цитометрия также может количественно определять некоторые параметры биопленки, такие как жизнеспособность клеток27. Эти процессы, однако, требуют разрушения биомассы биопленки и не были бы полезны для визуализации других важных взаимодействий, таких как пространственное распределение нейтрофилов и их компонентов в биопленке 27,29,30.
Настоящий протокол фокусируется на адаптации некоторых из традиционно используемых методов для изучения взаимодействий нейтрофилов и биопленок на биопленках, которые были оптимизированы для обеспечения минимальной изменчивости во время обработки. Таким образом, этот протокол обеспечивает стандартизированные методы для выращивания и количественной оценки биопленок, выделения первичных нейтрофилов человека из периферической крови, количественной оценки производства АФК и визуализации взаимодействий биопленки и нейтрофилов с помощью микроскопии. Этот протокол может быть адаптирован к различным системам для понимания взаимодействий биопленки и нейтрофилов при одновременном рассмотрении гетерогенности среди донорских пулов.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% sodium chloride irrigation, USP</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>2F7124</td>
			<td>Endotoxin-free; Used for isolation of neutrophils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mL rapid-flow filter unit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>565-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 proof ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89125-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td>Used for blood draw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td>Used for blood draw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1423-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swab</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>Used for blood draw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band-aids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for blood draw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Bacto Tryptic Soy Broth</td>
			<td>BD</td>
			<td>DF0370-07-5</td>
			<td>Combine with 1.5% agar to make Tryptic Soy Agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Bal Saupply</td>
			<td>202C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker blue CMCH</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C2111</td>
			<td>Blue CMAC Dye (BCD)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear bottom 96-well flat bottom polystyrene plates</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton gauze</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-761-52</td>
			<td>Used for blood draw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet</td>
			<td>Acros Organic</td>
			<td>40583-0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14-961-27</td>
			<td>Borosilicate Glass 13 x 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G-8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran from Leuconostoc spp.</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>31392-250G</td>
			<td>Used for isolation of neutrophils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (DPBS) 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium homodimer-1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224 B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque plus</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17144003</td>
			<td>Used for isolation of neutrophils (density gradient medium)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; balanced salt solution (HBSS) 1x</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>21-022-CV</td>
			<td>without calcium, magnesium, and phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Bright Line</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Novaplus</td>
			<td>NDC 63323-540-57</td>
			<td>1000 USP units/mL, Used for blood draw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMARIS 9.8</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Microscopy image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8511-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimal essential media (MEM) Alpha 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41061-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle (23 G1)</td>
			<td>BD</td>
			<td>305145</td>
			<td>Used for blood draw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti2</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Quantification of dead neutrophils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal human serum</td>
			<td>Complement Technology</td>
			<td>NHS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish (100 x 15 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4707-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP358-10</td>
			<td>Used for neutrophil isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SoftMax Pro Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Microplate reader software used for data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax i3x</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water for irrigation, USP</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>2F7114</td>
			<td>Endotoxin-free; Used for neutrophil isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surflo winged infusion set</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SC*19BLK</td>
			<td>19 G x 3/4&#34;, used for blood draw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain (0.4%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turnicate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used for blood draw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White opaque 96-well plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353296</td>
			<td>Tissue culture treated and flat bottom plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;-Slide VI 0.4</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80601</td>
			<td>&#956;-channel slide</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standardized in vitro assays to visualize and quantify interactions between human neutrophils and staphylococcus aureus biofilms

Нейтрофилы являются первой линией защиты, развернутой иммунной системой во время микробной инфекции. In vivo нейтрофилы набираются в место инфекции, где они используют такие процессы, как фагоцитоз, производство активных форм кислорода и азота (ROS, RNS, соответственно), NETosis (внеклеточная ловушка нейтрофилов) и дегрануляция для уничтожения микробов и разрешения инфекции. Взаимодействия между нейтрофилами и планктонными микробами были широко изучены. В последние годы появился интерес к изучению инфекций, вызванных биопленками. Биопленки проявляют свойства, в том числе толерантность к уничтожению нейтрофилами, в отличие от их планктонных аналогов. С успешным созданием моделей биопленки in vitro и in vivo теперь можно исследовать взаимодействие между этими микробными сообществами с различными иммунными клетками. Здесь методы, которые используют комбинацию традиционных моделей биопленки и хорошо зарекомендовавших себя анализов активности нейтрофилов, специально разработаны для изучения взаимодействий нейтрофилов и биопленок. Широкоугольная флуоресцентная микроскопия используется для мониторинга локализации нейтрофилов в биопленках. Эти биопленки выращивают в статических условиях с последующим добавлением нейтрофилов, полученных из периферической крови человека. Образцы окрашиваются соответствующими красителями перед визуализацией под микроскопом. Кроме того, производство АФК, которое является одним из многих нейтрофильных ответов против патогенов, количественно определяется в присутствии биопленки. Добавление иммунных клеток в эту установленную систему расширит понимание взаимодействий хозяина и патогена, обеспечивая при этом использование стандартизированных и оптимизированных условий для точного измерения этих процессов.

Среда, используемая для выращивания бактериальных биопленок, влияет на выживание нейтрофилов. Различные среды были протестированы для снижения влияния одних только сред на жизнеспособность нейтрофилов для изучения взаимодействий нейтрофилов и биопленки (рисунок 1). Бактериальные питательные среды, такие как триптический соевый бульон, минимизируют жизнеспособность нейтрофилов, так что ~ 60% нейтрофилов живы после 30-минутного инкубационного периода при 37 ° C с 5% CO2. Питательные среды клеток млекопитающих, такие как MEMα, не влияют на жизнеспособность нейтрофилов и поддерживают рост биопленок S. aureus. Фактически, минимальные среды способствуют устойчивому росту биопленок у других бактерий46,47.
Чтобы оценить влияние среды на рост биопленки и изменчивость количественной оценки биомассы биопленки после промывки биомассы для устранения планктонных клеток, 18-часовую биопленку S. aureus выращивали в 96-луночной пластине, с лунками, обработанными или необработанными поли-L-лизином. Богатые питательными веществами (tryptic Soy Broth (TSB)) и минимальные (MEMα) среды использовались как есть или дополнялись 2% глюкозой. Биомасса биопленки, окрашенная CV, показала, что биопленка S. aureus , выращенная в MEMα, дополненная 2% глюкозой, производит самую надежную биопленку среди всех протестированных сред (рисунок 2A). Кроме того, биопленки, выращенные в скважинах с предварительной обработкой ФАПЧ, содержащих MEMα + 2% глюкозы, показали меньшую изменчивость, чем биопленки в скважинах без обработки ФАПЧ, содержащих MEMα + 2% глюкозы. Эти биопленки показали меньшую вариабельность количественной оценки с помощью анализа CV35 и КОЕ/ мл при нанесении на покрытие после точной обработки биопленок для количественной оценки биомассы. Эти биопленки содержали, в среднем, 1 х 108 КОЕ/мл, что было продемонстрировано путем покрытия биопленок за 3 отдельных дня (рисунок 2B). Это число полезно при определении количества нейтрофилов, добавляемых в биопленки для анализа функциональности нейтрофилов.
Для измерения производства АФК нейтрофилами в ответ на биопленки биопленки S. aureus выращивали статически в течение 18-20 ч в 96-луночной пластине. Затем биопленки были опсонизированы, и были добавлены нейтрофилы. Затем производство ROS измерялось в течение 60 мин (рисунок 3А). Площадь под кривой рассчитывается на основе кинетической кривой для количественной оценки общего производства АФК нейтрофилами. Нейтрофилы, обработанные агонистом, таким как PMA, используемые в качестве контроля, показывают повышенную выработку АФК. В отсутствие биопленок нейтрофилы, обработанные PMA, показали надежную продукцию АФК. В присутствии биопленки S. aureus общая продукция АФК нейтрофилами, получавшими ПМА, снижалась. При отсутствии ПМА нейтрофилы полагаются исключительно на свое взаимодействие с биопленкой, что еще больше снижает количество вырабатываемой АФК (рисунок 3В).
Для визуализации взаимодействия нейтрофил-биопленка с помощью флуоресцентной микроскопии был использован GFP-экспрессирующий штамм S. aureus, краситель Blue CMAC и гомодимер этидия-1, окрашивающий цитоплазму живых клеток и ДНК мертвых клеток, соответственно. Биопленку S. aureus выращивали в течение 18 ч на 6-μ-канальном слайде. Нейтрофилы, меченные красителем Blue CMAC, добавляли вместе с гомодимером этидия-1 в промытые биопленки и инкубировали в течение 30 мин при 37 °C с 5% CO2 перед визуализацией. Широкоугольная флуоресцентная микроскопия показала, что многие нейтрофилы локализованы на поверхности биопленок S. aureus , в то время как некоторые находятся в биопленке (рисунок 4A). Взаимодействие между клетками S. aureus внутри нейтрофилов также было очевидным (рисунок 4C). Большинство клеток S. aureus , взаимодействующих с нейтрофилами (голубой), были мертвы (пурпурные), в то время как некоторые остались живыми (желтые), как определено живым мертвым окрашиванием (рисунок 4C). Для сравнения, GFP-экспрессирующие биопленки S. aureus были окрашены гомодимером этидия-1, который выявил часть мертвой популяции S. aureus в биопленке (рисунок 4B). Нежизнеспособные нейтрофилы, которые были положительными для гомодимера этидия-1, были количественно определены с использованием аналитического программного обеспечения (см. Таблицу материалов) после инкубации с биопленками S. aureus . Приблизительно 48% нейтрофилов уже были мертвы в течение 30 минут после инкубации с биопленкой S. aureus . Во время оптимизации протокола микроскопии также оценивали эффект промывки биопленки и нейтрофилов после 30 мин инкубации для удаления неприлипших нейтрофилов, выявляя около 33% мертвых нейтрофилов, все еще прикрепленных к биопленке (рисунок 4D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63773/63773fig1v2.jpg"> Рисунок 1: Анализ LIVE-DEAD сравнивает выживаемость нейтрофилов между бактериальными и млекопитающими питательными средами. Нейтрофилы выделяли и инкубировали в HBSS, MEMα, TSB или 0,1% SDS в течение 30 мин. Окрашивание LIVE-DEAD проводили с использованием Calcein AM (живой) и гомодимера этидия-1 (мертвый). Был определен процент живых нейтрофилов, где HBSS-инкубированные нейтрофилы лечились как 100% живые нейтрофилы. Результаты представляют собой в среднем два независимых эксперимента, выполненных в трех экземплярах, с нейтрофилами, полученными от двух разных доноров. Данные представлены в виде среднего значения ± SD (*p < 0,05, ****p < 0,0001. Односторонняя ANOVA). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63773/63773fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63773/63773fig02.jpg"> Рисунок 2: Количественная оценка биомассы биопленки в различных условиях и количество бактериальной жизнеспособности биопленок, выращенных в оптимизированных условиях. (A) S. aureus засеяли в 96-луночную пластину, покрытую или не покрытую поли-L-лизином (ФАПЧ). Биопленки выращивали в TSB, MEMα или любой из сред, дополненных 2% глюкозой в статических условиях в течение 18 ч. Окрашивание кристаллической фиалкой (CV) проводилось для окрашивания биомассы биопленки. Элюированное пятно CV разбавляли в 1:10 и считывали в считывателе микропластин. Результаты представляют собой в среднем три независимых эксперимента, выполненных в трех экземплярах. Данные представлены в виде среднего ± УР. SD для каждой группы показан внизу, чтобы продемонстрировать изменчивость различных условий роста биопленки. (B) Количество бактериальных КОЕ было получено из биопленок, выращенных в оптимизированной среде (MEMα + 2% глюкозы). 18-часовые статические биопленки подвергали такому же количеству промывок с последующим 10-минутным ультразвуком для ослабления биомассы биопленки и пропускали через иглу 22G, чтобы разрушить агрегаты перед покрытием. Результаты представляют собой три реплики, выполненные в трех экземплярах. Данные представляются в виде среднего ± УР (ns = незначителен. Односторонняя ANOVA). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63773/63773fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63773/63773fig03.jpg"> Рисунок 3: Количественная оценка производства АФК нейтрофилами с помощью хемилюминесцентного анализа. (A) Нейтрофилы (PMN) инкубировали с биопленками S. aureus (BF), промытыми HBSS, либо в присутствии (закрытый серый треугольник), либо в отсутствии (открытый серый перевернутый треугольник) PMA для измерения продукции АФК нейтрофилами. Люминол использовался для обнаружения АФК каждые 3 мин в течение 60 мин в микропластинчатом считывателе. В то время как нейтрофилы, получавшие ПМА в отсутствие биопленки (замкнутого черного круга), служили положительным контролем, группы только нейтрофилов (открытый черный круг) и только биопленки (открытый серый треугольник) служили отрицательным контролем. Данные представляют собой в среднем два независимых эксперимента, выполненных в трех экземплярах с нейтрофилами, полученными от двух разных доноров. Данные представлены в виде среднего ± SD. (B) Площадь под кривой из (A) была рассчитана для количественной оценки общего АФК, генерируемого нейтрофилами. Данные представлены в виде среднего ± SD. (***p < 0,0001. Односторонняя ANOVA). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63773/63773fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63773/63773fig04.jpg"> Рисунок 4: Визуализация взаимодействия между биопленкой S. aureus и нейтрофилами с помощью широкопольной флуоресцентной микроскопии. Синие нейтрофилы, меченые красителем CMAC (голубой), были дополнены гомодимером этидия-1 (пурпурный; мертвый) перед инкубацией с 18-часовой биопленкой S. aureus (желтый). Взаимодействия биопленки и нейтрофилов были получены с использованием широкопольной флуоресцентной микроскопии и изображений, обработанных с использованием программного обеспечения для анализа изображений. Эксперименты проводились с тремя разными донорами. Репрезентативные изображения представлены в виде (A) 3D-вида биопленки S. aureus с живыми (голубой) и мертвыми (пурпурными; несколько обозначены белыми стрелками) нейтрофилами, (B) 3D-вид биопленки S. aureus в отсутствие нейтрофилов с живым S. aureus , экспрессирующим GFP (желтый), либо с мертвым S. aureus , окрашенным гомодимером этидия-1 (пурпурным), (C) ортогональным видом S. aureus и взаимодействие нейтрофилов, как показано плоскостями xy, yz и xz, и (D) количественная оценка жизнеспособности нейтрофилов в присутствии биопленки S. aureus через 30 мин либо немедленно (немытая), либо после трех раундов промывок HBSS для удаления неприлипших нейтрофилов (промытых). Гибель нейтрофильных клеток представлена как средняя ± SD (t-тест Стьюдента). Шкала указывает на 50 мкм в (A) и (B) и 10 мкм в (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63773/63773fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Standardized In vitro Assays to Visualize and Quantify Interactions between Human Neutrophils and Staphylococcus aureus Biofilms at JoVE.com

Standardized In vitro Assays to Visualize and Quantify Interactions between Human Neutrophils and Staphylococcus aureus Biofilms

Настоящий протокол описывает изучение взаимодействий нейтрофилов и биопленки. Биопленки золотистого стафилококка устанавливаются in vitro и инкубируются с нейтрофилами человека, полученными из периферической крови. Реакция окислительного всплеска от нейтрофилов количественно определяется, а локализация нейтрофилов в биопленке определяется с помощью микроскопии.

Стандартизированные анализы in vitro для визуализации и количественной оценки взаимодействий между нейтрофилами человека и биопленками золотистого стафилококка

Neutrophils are the first line of defense deployed by the immune system during microbial infection. In vivo, neutrophils are recruited to the site of ...

Эти протоколы предназначены для понимания того, как нейтрофилы человека взаимодействуют с бактериальными биопленками и убивают их. Цель состоит в том, чтобы лучше понять это и ограничить изменчивость от анализа к анализу, понимая, что существуют неотъемлемые проблемы с нейтрофилами человека от донора к донору. Методы, перечисленные здесь, были оптимизированы, чтобы позволить пользователям проводить эксперименты с минимальной изменчивостью, особенно со слабо прикрепленными биопленками.Кроме того, эти протоколы также могут быть адаптированы для изучения других микробов, которые могут образовывать биопленки. Начните с получения изолированных колоний золотистого стафилококка из криоконсервированного бульона с использованием метода полосовой пластины на богатой питательными веществами агаровой пластине, такой как триптический соевый агар. Обмазывайте отдельные колодцы из 96-луночной плиты 100 микролитрами ФАПЧ, разведенными в стерильной воде, и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут.Аспирируйте раствор ФАПЧ асептически с помощью вакуумной аспирационной ловушки. Дайте колодцам высохнуть ночью при комнатной температуре. Подготовьте ночную культуру, инокулируя колонию S.aureus в MEM-альфа, дополненную 2% глюкозой и инкубированную при 37 градусах Цельсия в течение 16-18 часов при 200 оборотах в минуту.Разбавить культуру на ночь, перенеся 50 микролитров на пять миллилитров свежего MEM-альфа, дополненного 2% глюкозой. Затем инкубируют его при 37 градусах Цельсия со скоростью 200 оборотов в минуту до достижения среднелогарифмической фазы. Используйте MEM-альфа для нормализации среднелогарифмической культуры до OD 0,1.Перенесите 150 микролитров нормализованной культуры в каждую лунку обработанной ФАПЧ 96-луночной пластины. Инкубируйте пластину в увлажненной камере при 37 градусах Цельсия в течение 18-20 часов. Аспирировать супернатант для удаления планктонных клеток.Осторожно промыть оставшуюся биомассу 150 микролитрами HBSS, чтобы удалить неприкрепленные клетки. Повторите по крайней мере дважды, чтобы удалить все планктонные клетки. Добавьте 100 микролитров 20% нормальной сыворотки человека, разведенной в HBSS по каплям, в промытую биопленку и инкубируйте при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут, чтобы опсонизировать биопленку.Аспирировать сывороточный раствор и промыть биопленки по каплям 150 микролитрами HBSS. Аспирировать HBSS, оставляя после себя колодцы с опсонизированными биопленками. Добавьте люминол к нейтрофилам, повторно суспендированным в HBSS, чтобы составить конечную концентрацию пяти микромолярного люминола.Этот раствор готов к применению для групп А и С.Добавляют нейтрофилы, смешанные с люминолом, в лунки с опсонизированными биопленками. Для группы D готовят 50 микромолярного раствора люминола в HBSS в отдельной пробирке без каких-либо нейтрофилов и добавляют его в лунку, содержащую биопленку. Aliquot 350 микролитров нейтрофилов смешивают с люминолом и добавляют PMA в конечной концентрации 500 нанограмм на миллилитр в смесь.Для группы В добавляют нейтрофилы из этой смеси в лунки без биопленки. Это служит положительным контролем. Центрифугируйте пластину при 270 RCF в течение 30 секунд при четырех градусах Цельсия.Убедитесь, что считыватель пластин установлен на 37 градусов цельсия, люминесценция и кинетическое чтение в течение 60 минут с трехминутными интервалами. Поместите пластину в считыватель пластин, чтобы измерить выработку АФК нейтрофилами в течение 60 минут. Используйте флуоресцентный штамм S.aureus, такой как USA300, экспрессирующий GFP, чтобы облегчить микроскопическую визуализацию.Инкубировать нейтрофилы со 100 микромолярами BCD в течение 30 минут в коромысле при 37 градусах Цельсия с 5% атмосферным углекислым газом. Убедитесь, что образцы инкубируются в темноте, и ограничьте воздействие света. Чтобы промыть избыток BCD, центрифугируют нейтрофилы при 270 RCF в течение пяти минут и аспирируют супернатант.Повторно суспендировать нейтрофилы в свежем HBSS. Затем добавляют гомодимер этидия-1 к окрашенным БКД нейтрофилам в конечной концентрации четырех микромоляров для мониторинга нейтрофилов и бактериальной гибели. Промыть биопленку HBSS и добавить 150 микролитров нейтрофилов в биопленку S.aureus, которая была выращена в микрослайдах.Высиживайте микрополости в увлажненной камере в течение 30 минут. Количество бактериальных клеток будет основано на количестве клеток, полученных в результате 18-часового покрытия биопленки. Представьте взаимодействие биопленки нейтрофилов с помощью флуоресцентных каналов, соответствующих флуоресцентным красителям, или длин волн возбуждения и излучения белков.Бактериальные питательные среды минимизировали жизнеспособность нейтрофилов примерно до 60% через 30 минут инкубационного периода. Питательные среды клеток млекопитающих, однако, не влияют на жизнеспособность нейтрофилов, а также могут поддерживать рост биопленок S.aureus. Нейтрофилы, обработанные ПМА, используемые в качестве контроля, показали повышенную продукцию АФК.В отсутствие биопленок нейтрофилы, обработанные PMA, показали надежную продукцию АФК. В присутствии биопленки S.aureus общая продукция АФК нейтрофилами, обработанными PMA, уменьшалась, в то время как в отсутствие PMA нейтрофилы полагались исключительно на свое взаимодействие с биопленкой, что еще больше снижало производство АФК. Широкоугольная флуоресцентная микроскопия показала, что многие нейтрофилы были локализованы на поверхности, в то время как некоторые находились в биопленках S.aureus.Большинство клеток S.aureus, взаимодействующих с нейтрофилами, были мертвы, в то время как некоторые остались живыми, как определено окрашиванием LIVE /DEAD. Биопленки, окрашенные гомодимером этидия-1, выявили часть мертвой популяции S.aureus в биопленке. Эффект промывки биопленки и нейтрофилов после 30 минут инкубации для удаления неприлипших нейтрофилов показал, что около 33% мертвых нейтрофилов все еще были прикреплены к биопленке.Перечисленные здесь протоколы также могут быть использованы для дальнейшего изучения других функциональных возможностей нейтрофилов, таких как фагоцитоз и формирование внеклеточных ловушек нейтрофилов, когда нейтрофилы сталкиваются с биопленками.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Standardized In vitro Assays to Visualize and Quantify Interactions between Human Neutrophils and Staphylococcus aureus Biofilms

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA)

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus MRSA

Подкожный Заражение метициллину Staphylococcus Aureus устойчивы (MRSA)

MRSA is a worldwide threat to public health, and MRSA skin and soft-tissue infections now account for more than half of all soft-tissue infections in the ...

Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in Rat

Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus MRSA in Rat

Экспериментальная модель Эндокардит метициллин устойчивый<em&gt; Золотистый стафилококк</em&gt; (MRSA) у крыс

Endovascular infections, including endocarditis, are life-threatening infectious syndromes1-3. Staphylococcus aureus is the most common world-wide cause ...

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Золотистый стафилококк рост использования человеческого гемоглобина в качестве источника железа

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

Изучение взаимодействий<em&gt; Золотистый стафилококк</em&gt; С нейтрофилами с помощью проточной цитометрии и микроскопии Длительная

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

Роман<em&gt; В пробирке</em&gt; Модель для изучения взаимодействия между человеческим цельной крови и эндотелия

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

Высокая пропускная способность измерения внеклеточной ДНК-релиз и количественный NET Формирование в нейтрофилах человека<em&gt; In Vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Ориентация биопленки Associated<em&gt; Стафилококк</em&gt; Использование ресазурин На основе лекарственной чувствительности анализа

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

генотипирование<em&gt; Стафилококк</em&gt; рибосомальным Spacer ПЦР (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

Методика изучения горизонтальных генного переноса в<em&gt; Стафилококк</em

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to ...

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

Мыши модель для оценки врожденный иммунный ответ инфекции стафилококк

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...