Name: isolation, culture, and characterization of primary schwann cells, keratinocytes, and fibroblasts from human foreskin
Uploaded: 2022-03-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin at JoVE.com

نود أن نشكر الدكتورة فادية كمال والدكتور رياض البربري على السماح لنا باستخدام الأدوات المخبرية والدعم الفني. تم دعم هذا العمل من خلال منح من المعاهد الوطنية للصحة (K08 AR060164-01A) ووزارة الدفاع (W81XWH-16-1-0725) إلى J. C. E. بالإضافة إلى الدعم المؤسسي من مركز هيرشي الطبي بجامعة ولاية بنسلفانيا.

تمت مراجعة اقتناء واستخدام أنسجة القلفة البشرية غير المحددة لأغراض البحث وتلقى تحديد "البحث غير البشري" من قبل مجلس المراجعة المؤسسية لكلية ولاية بنسلفانيا للطب (IRB # 17574).
ملاحظة: باتباع البروتوكول أدناه، يتم الحصول على 2.4 × 10 6 خلايا كيراتينية، 4.4 × 10 6 خلايا ليفية، و1.1 × ...

<ol>
	<li>Hawksworth, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+disadvantages+of+using+human+cells+for+pharmacological+and+toxicological+studies.">Advantages and disadvantages of using human cells for pharmacological and toxicological studies.</a> Human &amp; Experimental Toxicology. 13 (8), 568-573 (1994).</li><li>Green, H., Kehinde, O., Thomas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+cultured+human+epidermal+cells+into+multiple+epithelia+suitable+for+grafting.">Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (11), 5665-5668 (1979).</li><li>Fuchs, E., Green, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+keratin+gene+expression+during+terminal+differentiation+of+the+keratinocyte.">Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocyte.</a> Cell. 19 (4), 1033-1042 (1980).</li><li>Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+cultivation+of+human+keratinocytes+from+skin+or+plucked+hair+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells.">Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).</li><li>Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+primary+adult+fibroblast+cultures+from+rodents.">Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2033 (2010).</li><li>Belviso, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+adult+human+dermal+fibroblasts+from+abdominal+skin+and+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+using+a+non-integrating+method.">Isolation of adult human dermal fibroblasts from abdominal skin and generation of induced pluripotent stem cells using a non-integrating method.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60629 (2020).</li><li>Silva, W. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Schwann+cells+in+cutaneous+wound+healing.">Role of Schwann cells in cutaneous wound healing.</a> Wound Repair and Regeneration. 26 (5), 392-397 (2018).</li><li>Bray, E. R., Cheret, J., Yosipovitch, G., Paus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cells+as+underestimated,+major+players+in+human+skin+physiology+and+pathology.">Schwann cells as underestimated, major players in human skin physiology and pathology.</a> Experimental Dermatology. 29 (1), 93-101 (2020).</li><li>Laverdet, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+innervation:+important+roles+during+normal+and+pathological+cutaneous+repair.">Skin innervation: important roles during normal and pathological cutaneous repair.</a> Histology and Histopathology. 30 (8), 875-892 (2015).</li><li>Jessen, K. R., Mirsky, R., Lloyd, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cells:+Development+and+role+in+nerve+repair.">Schwann cells: Development and role in nerve repair.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (7), 020487 (2015).</li><li>Bentley, C. A., Lee, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p75+is+important+for+axon+growth+and+Schwann+cell+migration+during+development.">p75 is important for axon growth and Schwann cell migration during development.</a> The Journal of Neuroscience. 20 (20), 7706-7715 (2000).</li><li>Rutkowski, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signals+for+proinflammatory+cytokine+secretion+by+human+Schwann+cells.">Signals for proinflammatory cytokine secretion by human Schwann cells.</a> Journal of Neuroimmunology. 101 (1), 47-60 (1999).</li><li>Kumar, A., Brockes, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+dependence+in+tissue,+organ,+and+appendage+regeneration.">Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration.</a> Trends in Neurosciences. 35 (11), 691-699 (2012).</li><li>Balakrishnan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+role+and+potential+of+Schwann+cells+for+peripheral+nerve+repair+from+studies+of+development+and+injury.">Insights into the role and potential of Schwann cells for peripheral nerve repair from studies of development and injury.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 608442 (2020).</li><li>Gresset, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boundary+caps+give+rise+to+neurogenic+stem+cells+and+terminal+glia+in+the+skin.">Boundary caps give rise to neurogenic stem cells and terminal glia in the skin.</a> Stem Cell Reports. 5 (2), 278-290 (2015).</li><li>Stratton, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+Schwann+cells+from+adult+human+skin+and+nerve.">Purification and characterization of Schwann cells from adult human skin and nerve.</a> eNeuro. 4 (3), (2017).</li></ol>

يصف هذا البروتوكول طريقة لعزل ثلاث مجموعات خلايا متميزة من قطعة واحدة من القلفة ، وهي الخلايا الكيراتينية والخلايا الليفية وخلايا شوان. هناك عدد قليل من بروتوكولات العزل المتاحة لعزل الخلايا الكيراتينية والخلايا الليفية2،3،5،6 <sup...

الخلايا الأولية المشتقة من الأنسجة الحية والمستزرعة في ظل ظروف المختبر تشبه إلى حد كبير الحالة الفسيولوجية1 ، مما يجعلها نموذجا مثاليا للتحقيق في العمليات الفسيولوجية والفسيولوجية المرضية. يحتوي الجلد على أنواع متعددة من الخلايا ، بما في ذلك الخلايا الكيراتينية والخلايا الليفية والخلايا الخلوية والخلايا الصباغية وخلايا شوان (SCs) ، والتي يمكن عزلها وزراعتها لإجراء تجارب في المختبر. لم يتم وصف طرق عزل وزراعة الخلايا الكيراتينية والخلايا الليفية و SCs ، من قطعة واحدة من الجلد. الهدف من هذا البروتوكول ذو شقين: 1) إنشاء طريقة موثوقة وقابلة للتكرار لعزل وزراعة SCs الجلدية و 2) لاستخدام طريقة فعالة وقوية لعزل الخلايا الكيراتينية والخلايا الليفية و SCs من قلفة بشرية واحدة.
في الوقت الحاضر ، هناك بروتوكولات راسخة لعزل الخلايا الكيراتينية الجلدية2،3،4 والخلايا الليفية5،6. تصف هذه الدراسات عزل الخلايا الكيراتينية أو الخلايا الليفية أو كليهما عن الجلد ، ولكن لا يوجد بروتوكول يتناول كيفية إنشاء ثقافات SCs الأولية من جلد الإنسان. تشير الدراسات الحديثة إلى أن SCs العصبية تعدل العمليات الخلوية الكيراتينية والخلايا الليفية وتنظم الوظائف الفسيولوجية الطبيعية للجلد7. وبالتالي ، فإن SCs ضرورية لتوازن الجلد وتساهم بشكل كبير في تنظيم علم وظائف الأعضاء الذي يؤثر على سلوك أنواع خلايا الجلد المجاورة الموجودة8. لذلك ، فإن البروتوكول الذي يسمح بعزل كل نوع من أنواع الخلايا هذه مثالي للتجارب المختبرية التي تنطوي على اتصال بين الخلايا الخلوية أو التحدث المتبادل بين أنواع الخلايا.
يصف هذا البروتوكول إنشاء مزارع خلايا فردية للخلايا الأولية من قطعة واحدة من الجلد. هذا البروتوكول مفيد بشكل خاص عندما تكون كمية الأنسجة المتاحة محدودة. وعلاوة على ذلك، فإن عزل جميع أنواع الخلايا الثلاثة عن متبرع واحد يسمح بإجراء مقارنات قوية بين أنواع الخلايا أو تجارب الزراعة المشتركة مع التخفيف من تأثير علم الوراثة أثناء التجربة المطلوبة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;M sterile filters (Millex-GP Syringe Filter Unit,polyethersulfone)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SLGPR33RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;M cell strainers</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;M cell strainers</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL disposable syringes</td>
			<td>BD Luer-Lok</td>
			<td>BD-309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL disposable syringes (Syringe sterile, single use)</td>
			<td>BD Luer-Lok</td>
			<td>BD309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL disposable syringes</td>
			<td>BD Luer-Lok</td>
			<td>BD305462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% TritonX-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-1L</td>
			<td>Prepared at the time of use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>J19943.K2</td>
			<td>Ready to use and store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td>Prepared at the time of use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemometec Vial1-Cassette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1420193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17018-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12544D 22*50-1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D46693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM basal medium</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>9221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline free from Ca2+ and Mg2+ (DPBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;21-031-CV)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL micro-centrifuge tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-681-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast complete medium</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>2331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11032</td>
			<td>Dilution (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>Dilution (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Buffered Saline Solution (HBSS buffer)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human foreskin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>De-identified human foreskin tissue for research purposes (Institutional Review Board- IRB #17574).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KGM-GOLD keratinocyte medium (KGM gold and supplements)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>00192151 and 00192152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse alpha-smooth muscle actin antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-9760-82</td>
			<td>Dilution (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Cytokeratin14 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7800</td>
			<td>Dilution (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse S100 antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MA5-12969</td>
			<td>Dilution (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi chambered (4 well glass slide)</td>
			<td>Tab-Tek</td>
			<td>154526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoCounter -Via1-Cassette</td>
			<td>Chemometec</td>
			<td>941-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysisne (PLL)</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>32503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Anti-fade Mountant with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit K10 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB4501656</td>
			<td>Dilution (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit p75-NTR antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB1554</td>
			<td>Dilution (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit vimentin</td>
			<td>ProteinTech</td>
			<td>10366-1-AP</td>
			<td>Dilution (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schwann cell culture medium</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>1701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision tweezers DUMONT straight with extra fine tips Dumostar, 5</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>LH75.1</td>
			<td>Sterilize with 70% alcohol before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS Scissors, sharp/sharp. Length 4&#8211;3/8&#34;(111mm)</td>
			<td>Codman</td>
			<td>54-6500</td>
			<td>Sterilize with 70% alcohol before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized surgical - sharp blade (Duro Edge Economy Single Edge Blades)</td>
			<td>Razor blade company</td>
			<td>94-0120</td>
			<td>Sterilize with 70% alcohol before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin neutralization buffer (TNS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Axio Observer 7- Axiocam 506 mono &#8211; Apotome.2 microscope</td>
			<td>For immunofluorescence of chamber slide containing stained cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Primovert</td>
			<td>For visulaizing/observing cell attachment or detachment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and characterization of primary schwann cells, keratinocytes, and fibroblasts from human foreskin

يصف هذا البروتوكول طرق العزل ، وظروف الزراعة ، وتوصيف الخلايا الأولية البشرية ذات العائد العالي والجدوى باستخدام التفكك الأنزيمي السريع للبشرة. يتم حصاد الخلايا الكيراتينية الأولية والخلايا الليفية وخلايا شوان من القلفة البشرية حديثي الولادة، والتي تتوفر وفقا لإجراءات الرعاية القياسية. يتم تطهير الجلد الذي تمت إزالته ، ويتم إزالة الدهون والعضلات تحت الجلد باستخدام مشرط. تتكون الطريقة من الفصل الأنزيمي والميكانيكي لطبقات البشرة والجلد ، يليه هضم إنزيمي إضافي للحصول على معلقات أحادية الخلية من كل طبقة من طبقات الجلد هذه. وأخيرا، تزرع الخلايا المفردة في وسائط زراعة الخلايا المناسبة باتباع بروتوكولات زراعة الخلايا القياسية للحفاظ على النمو والبقاء على مدى أسابيع. معا ، يسمح هذا البروتوكول البسيط بعزل وزراعة وتوصيف جميع أنواع الخلايا الثلاثة من قطعة واحدة من الجلد لتقييم نماذج الجلد والأعصاب في المختبر . بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام هذه الخلايا معا في الثقافات المشتركة لقياس آثارها على بعضها البعض واستجاباتها للصدمة في المختبر في شكل خدوش يتم إجراؤها آليا في الثقافة المرتبطة بالتئام الجروح.

تم استخدام القلفة الطبيعية لحديثي الولادة لعزل الخلايا الكيراتينية الأولية للبشرة و SCs الجلدية والخلايا الليفية. تم استزراع الخلايا الأولية المعزولة في وسائط زراعة الخلايا ذات الصلة التي تحتوي على عوامل النمو. بعد بذر SCs والخلايا الليفية في قوارير الثقافة ، التزمت معظم الخلايا بقاع القا?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin at JoVE.com

Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin

غالبا ما تتطلب دراسة التئام الجروح المرتبطة بالإصابة العضلية الهيكلية تقييم التفاعلات في المختبر بين خلايا شوان (SCs) والخلايا الكيراتينية والخلايا الليفية. يصف هذا البروتوكول عزل هذه الخلايا الأولية وزراعتها وتوصيف خصائصها من القلفة البشرية.

عزل وزراعة وتوصيف خلايا شوان الأولية والخلايا الكيراتينية والخلايا الليفية من القلفة البشرية

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid ...

يحتوي الجلد على أنواع متعددة من الخلايا بما في ذلك الخلايا الكيراتينية والخلايا الليفية وخلايا شوان العصبية. يسمح هذا البروتوكول بعزل كل نوع من أنواع الخلايا هذه للتجارب في المختبر. يسمح عزل وإنشاء مزارع الخلايا الأولية الفردية من متبرع واحد بإجراء مقارنات قوية وتجارب الزراعة المشتركة ، مع التخفيف من آثار التباين الجيني.باستخدام هذا البروتوكول ، يسمح تحليل الخلايا الفردية وتفاعلاتها بتحليل دور خلايا Schwann في توازن الجلد والفيزيولوجيا المرضية. يمكن استخدام مجموعات الخلايا المتميزة هذه لدراسة خلايا شوان أو الخلايا الليفية أو الخلايا الكيراتينية إما بشكل فردي أو مجتمعة في فسيولوجيا الجلد الطبيعية أو التئام الجروح أو في الحالات المريضة بالجلد. سيساعدني Jagadeeshaprasad M G ، وهو باحث ما بعد الدكتوراه في مختبري ، في إظهار الإجراء.بعد الحصول على القلفة الوليدية باتباع إجراءات الرعاية القياسية ، ضع القلفة المستأصلة في أنبوب طرد مركزي صغير يحتوي على ثمانية إلى 10 ملليلتر من الوسط القاعدي DMEM البارد ، وانقل القلفة على الفور إلى مختبر زراعة الخلايا لعزل الخلايا. شطف القلفة مرتين مع 20 إلى 25 ملليلتر من دولبيكو الفوسفات المخزنة مؤقتا المالحة أو DPBS ، التي تحتوي على المضادات الحيوية ومضادات الفطريات. ثم انقع الجلد المغسول في 25 إلى 30 ملليلتر من وسط DMEM القاعدي البارد في طبق زراعة الأنسجة 10 سم.بعد 15 دقيقة ، افتح القلفة باستخدام مشرط لفضح الأدمة والأنسجة الدهنية تحت الجلد. استخدم الملقط وشفرة المشرط والمقص لإزالة الأنسجة الدهنية تحت الجلد والتخلص منها. ثم قطع القلفة النظيفة إلى ثلاث إلى خمس قطع أصغر واحتضن قطع الجلد في 16 إلى 20 ملليلتر من Dispace one DMEM الوسط في أنبوب مخروطي معقم.خلال أول 30 دقيقة من الحضانة مع Dispace ، امزج المرء بشكل متقطع قطع الجلد في الأنبوب المخروطي عن طريق الانعكاس. ثم ضع الأنبوب المخروطي عند أربع درجات مئوية لمدة 16 إلى 18 ساعة. في اليوم التالي ، قم بإزالة قطع الجلد ووضعها على طبق ثقافة معقم جاف وقم بفتح كل قطعة من الجلد بحيث تلامس طبقة البشرة الخارجية طبق الثقافة.بدءا من حافة الأنسجة قشر البشرة بعيدا عن الأدمة باستخدام مجموعتين من الملقط. أضف شظايا البشرة المنفصلة إلى خمسة ملليلترات من HBS في طبق استزراع طوله 10 سنتيمترات لتحضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. ثم جمع محلول HBS في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر وإضافة خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت لتحييد التربسين أو T و B في الأنبوب المخروطي.ضع الأنبوب جانبا. إلى شظايا البشرة في طبق الثقافة أضف ثلاثة ملليلترات من محلول التربسين لاحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد الحضانة ، قم بتحريك شظايا البشرة بلطف باستخدام ملقط حتى يصبح محلول الخلايا الكيراتينية التربسين عكرا.بعد ذلك أضف محلول الخلايا الكيراتينية التربسين إلى أنبوب HBS T و B. بعد إذابة شظايا البشرة غير المهضومة بمحلول التربسين EDTA ، أضف ملليلترين من FBS إلى أنبوب HBS T و B الذي يحتوي على محلول التربسين EDTA ، وقم بالطرد المركزي للاثنين حوالي 870 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. ثم قم بشفط السوبرناتانت وإعادة تعليق حبيبات الخلية في ثلاثة ملليلتر من وسط النمو الكامل للخلايا الكيراتينية ، يليه ترشيح تعليق الخلية بمرشح معقم 100 ميكرومتر في أنبوب مخروطي معقم 50 ملليلتر.بمجرد تحديد عدد الخلايا وصلاحية الخلية كميا ، قم بزرع الخلايا في ألواح الزراعة لوضعها في حاضنة عند 37 درجة مئوية في 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. بعد يومين ، قم بشفط الخلايا غير الملتصقة ، وقم بتحديث وسائط زراعة الخلايا كل يومين حتى تصل الخلايا الكيراتينية إلى التقاء 50 إلى 80٪ للتجارب العابرة أو النهائية. قم بتغطية قوارير T25 بالبولي إل ليسين أو PLL ، باستخدام خمسة ملليلترات من DPBS ووضع القوارير المطلية مسبقا عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات.في وقت لاحق غسل مصفوفة طلاء PLL مرتين مع DPBS. بعد غسل القطع المعزولة من الأدمة بخمسة ملليلتر من الوسط القاعدي DMEM ، قم بتقطيع الأدمة إلى قطع صغيرة باستخدام مقص. هضم الأدمة المفرومة مع خمسة ملليلتر من الكولاجيناز عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين ونصف ، مع معايرة لطيفة باستخدام طرف ماصة كل 30 دقيقة حتى تنفصل الأدمة تماما.بمجرد هضمه ، قم بتصفية تعليق الخلية باستخدام مصفاة خلية 70 ميكرومتر ، تليها تخفيف تعليق الخلية المصفى بخمسة ملليلترات من وسط DMEM الكامل لوقف النشاط الأنزيمي للكولاجيناز. بعد ذلك ، يقوم الطرد المركزي بتعليق الخلية عند 870 مرة G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ويعيد تعليق اقتراع الخلية في ملليلترين من DMEM وسط كامل لتقسيم الخلايا. بعد تكرار عملية التمركز كما هو موضح ، قم بشفط supernatant لاستخدام بيليه الخلية لعزل خلايا Schwann أو الخلايا الليفية.لعزل خلايا شوان ، أعد تعليق حبيبات الخلية في خمسة ملليلترات من متوسط DMEM الكامل الطازج وحدد عدد الخلايا وقابليتها للحياة قبل بذر خمسة ملليلترات من الخلايا المعاد تعليقها في قوارير T25 المشفرة مسبقا بكثافة 4.0 في 10 إلى الخلايا الثلاث لكل ملليلتر. احتضن القارورة عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. بعد 16 ساعة تأكد من التصاق الخلايا عن طريق الفحص المجهري عند تكبير 10X.ثم قم بإزالة الخلايا غير الملتصقة واغسل القارورة ثلاث مرات بخمسة ملليلتر من DPBS. بعد ذلك احتضان الخلايا مع خمسة ملليلتر من 10 ميكرومولار سيتوسين أرابينوسيد في وسط DMEM كامل. بعد 24 ساعة ، قم بشفط أرابينوسيد السيتوزين الذي يحتوي على وسط قبل شطف القارورة كما هو موضح من قبل.أعد ملء قارورة الزرع بخمسة ملليلترات من خلايا شوان لإكمال وسط الزرع لاحتضان 48 ساعة ، مع تحديث الوسط كل يومين حتى تصل خلايا شوان إلى 80٪ من التقاء. لعزل الخلايا الليفية ، أعد تعليق الكريات المجمعة في خمسة ملليلترات من الخلايا الليفية الكاملة المتوسطة. لزراعة الخلايا في قوارير ثقافة T25 غير المشفرة لمدة 24 ساعة كما هو موضح لخلايا شوان.بعد شفط الخلايا غير الملتزمة وغسل القارورة ، احتضن الخلايا بخمسة ملليلترات من الخلايا الليفية الطازجة متوسطة كاملة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 ساعة. عندما تم استزراع الخلايا الأولية المعزولة في وسائط زراعة الخلايا المعنية ، وصلت الخلايا الكيراتينية الأولية إلى 85٪ من الالتقاء بحلول اليوم السابع وأظهرت مورفولوجيا خلوية مميزة ذات شكل مرصوف بالحصى. وصلت خلايا شوان إلى 95٪ من الالتقاء بحلول اليوم الخامس وظهرت ثنائية القطب أو ثلاثية القطب في الشكل.وصلت مزارع الخلايا الليفية إلى 95٪ من الالتقاء بحلول اليوم الرابع وأظهرت معظم الخلايا مورفولوجيا شكل المغزل. أكد تلطيخ التألق المناعي تعبير البروتين المحدد لنوع الخلية في مزارع الخلايا. كانت الخلايا الكيراتينية إيجابية لبروتين K10 و K14.أشارت الصور المدمجة للتألق المناعي للكيراتين والتلطيخ النووي DAPI إلى نقاء 97.8٪ من مزارع الخلايا. وبالمثل ، كانت خلايا شوان إيجابية ل S100 و P75 NTR وكان لها نقاء بنسبة 95.2٪ في الثقافة. عبرت الخلايا الليفية بشكل إيجابي عن vimentin ، ولكنها لم تعبر عن عضلة ألفا الملساء Actin ، وهي علامة myofibroblast.كانت نقاء الثقافة حوالي 97.2٪ لتعزيز أدلة شانس ، يمكن استخدام طبق بولي إل ليسين المطلي مسبقا. ولزيادة التخفيف من التلوث الليفي ، تمت إضافة أرابينوسيد السيتوزين والعامل المضاد للفطريات بعد إضافة الخلايا لفترة قصيرة. هذا إجراء تجريبي بسيط غير مكلف لإنشاء الخلايا الأولية الثلاث ، مثل خلايا شوان ، والخلايا الكيراتينية ، والخلايا الليفية ، من جلد قلفة بشري واحد.هذا البروتوكول مثالي للتجارب في المختبر التي تنطوي على اتصال الخلايا الخلوية أو الحديث المتبادل بين أنواع الخلايا.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

العزلة وثقافة العصبية الخلايا الجذعية من بصيلات الشعر كريست الإنسان

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

Isolation and Culture of Human Fungiform Taste Papillae Cells

العزلة والثقافة من خلايا الإنسان حليمات كمئية طعم

Taste cells are highly specialized, with unique histological, molecular and physiological characteristics that permit detection of a wide range of simple ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

العزلة والثقافة من الخلايا العصبية كريست من الأنبوبة العصبية الجنينية الفئران

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

العزلة والثقافة من الخلايا البطانية من الجنينية الدماغ المقدم

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

العزلة والثقافة وطويل الأجل صيانة الابتدائية الدماغ المتوسط ​​الدوبامين العصبية من المخ الجنينية القوارض

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

العزلة والثقافة من الخلايا الجذعية البالغة العصبية من المنطقة تحت الثفني ماوس

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

جيل بسيطة من ثقافة عالية الغلة المستحث الخلايا العصبية من الخلايا الليفية الجلد الكبار البشرية

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

توصيف والعزلة للماوس Microglia الأولية بكثافة التدرج الطرد المركزي

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

عزل العقد الجذرية الظهرية والثقافة الأولية لدراسة الإفراج عن ناقل عصبي

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

الثقافة الاساسيه للخلايا العصبية معزولة عن المخيخ الفئران الجنينية

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...