Name: isolation, culture, and characterization of primary schwann cells, keratinocytes, and fibroblasts from human foreskin
Uploaded: 2022-03-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin at JoVE.com

Vi vil gerne takke Dr. Fadia Kamal og Dr. Reyad Elbarbary for at give os mulighed for at bruge laboratorieinstrumenter og teknisk support. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra NIH (K08 AR060164-01A) og DOD (W81XWH-16-1-0725) til J. C. E. ud over institutionel støtte fra Pennsylvania State University Hershey Medical Center.

Erhvervelse og anvendelse af afidentificeret humant forhudsvæv til forskningsformål blev gennemgået og modtaget bestemmelsen af "ikke menneskelig forskning" af Penn State College of Medicine Institutional Review Board (IRB # 17574).
BEMÆRK: Ved at følge nedenstående protokol opnås 2,4 x 106 keratinocytter, 4,4 x 106 fibroblaster og 1,1 x 106 SO'er fra en enkelt forhud. Generelt kan disse primære celler anvendes til 3 passager afhængigt af forsøgsbetin...

<ol>
	<li>Hawksworth, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+disadvantages+of+using+human+cells+for+pharmacological+and+toxicological+studies.">Advantages and disadvantages of using human cells for pharmacological and toxicological studies.</a> Human &amp; Experimental Toxicology. 13 (8), 568-573 (1994).</li><li>Green, H., Kehinde, O., Thomas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+cultured+human+epidermal+cells+into+multiple+epithelia+suitable+for+grafting.">Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (11), 5665-5668 (1979).</li><li>Fuchs, E., Green, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+keratin+gene+expression+during+terminal+differentiation+of+the+keratinocyte.">Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocyte.</a> Cell. 19 (4), 1033-1042 (1980).</li><li>Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+cultivation+of+human+keratinocytes+from+skin+or+plucked+hair+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells.">Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).</li><li>Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+primary+adult+fibroblast+cultures+from+rodents.">Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2033 (2010).</li><li>Belviso, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+adult+human+dermal+fibroblasts+from+abdominal+skin+and+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+using+a+non-integrating+method.">Isolation of adult human dermal fibroblasts from abdominal skin and generation of induced pluripotent stem cells using a non-integrating method.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60629 (2020).</li><li>Silva, W. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Schwann+cells+in+cutaneous+wound+healing.">Role of Schwann cells in cutaneous wound healing.</a> Wound Repair and Regeneration. 26 (5), 392-397 (2018).</li><li>Bray, E. R., Cheret, J., Yosipovitch, G., Paus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cells+as+underestimated,+major+players+in+human+skin+physiology+and+pathology.">Schwann cells as underestimated, major players in human skin physiology and pathology.</a> Experimental Dermatology. 29 (1), 93-101 (2020).</li><li>Laverdet, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+innervation:+important+roles+during+normal+and+pathological+cutaneous+repair.">Skin innervation: important roles during normal and pathological cutaneous repair.</a> Histology and Histopathology. 30 (8), 875-892 (2015).</li><li>Jessen, K. R., Mirsky, R., Lloyd, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cells:+Development+and+role+in+nerve+repair.">Schwann cells: Development and role in nerve repair.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (7), 020487 (2015).</li><li>Bentley, C. A., Lee, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p75+is+important+for+axon+growth+and+Schwann+cell+migration+during+development.">p75 is important for axon growth and Schwann cell migration during development.</a> The Journal of Neuroscience. 20 (20), 7706-7715 (2000).</li><li>Rutkowski, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signals+for+proinflammatory+cytokine+secretion+by+human+Schwann+cells.">Signals for proinflammatory cytokine secretion by human Schwann cells.</a> Journal of Neuroimmunology. 101 (1), 47-60 (1999).</li><li>Kumar, A., Brockes, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+dependence+in+tissue,+organ,+and+appendage+regeneration.">Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration.</a> Trends in Neurosciences. 35 (11), 691-699 (2012).</li><li>Balakrishnan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+role+and+potential+of+Schwann+cells+for+peripheral+nerve+repair+from+studies+of+development+and+injury.">Insights into the role and potential of Schwann cells for peripheral nerve repair from studies of development and injury.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 608442 (2020).</li><li>Gresset, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boundary+caps+give+rise+to+neurogenic+stem+cells+and+terminal+glia+in+the+skin.">Boundary caps give rise to neurogenic stem cells and terminal glia in the skin.</a> Stem Cell Reports. 5 (2), 278-290 (2015).</li><li>Stratton, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+Schwann+cells+from+adult+human+skin+and+nerve.">Purification and characterization of Schwann cells from adult human skin and nerve.</a> eNeuro. 4 (3), (2017).</li></ol>

Denne protokol beskriver en metode til at isolere tre forskellige cellepopulationer fra et enkelt stykke af forhuden, nemlig keratinocytter, fibroblaster og Schwann-celler. Der er et par isolationsprotokoller til rådighed for at isolere keratinocytter og fibroblaster 2,3,5,6, men ingen beskriver SC-isolering. Bortset fra de vigtigste strukturelle celler i hud, keratinocytter og fibroblaster er...

Primære celler afledt af levende væv og dyrket under in vitro-forhold ligner meget den fysiologiske tilstand1, hvilket gør dem til en ideel model til undersøgelse af fysiologiske og patofysiologiske processer. Huden indeholder flere celletyper, herunder keratinocytter, fibroblaster, sebocytter, melanocytter og Schwann-celler (SC'er), som kan isoleres og dyrkes til in vitro-eksperimenter . Metoder til at isolere og dyrke keratinocytter, fibroblaster og SC'er fra et enkelt stykke hud er ikke beskrevet. Målet med denne protokol er todelt: 1) at etablere en pålidelig og reproducerbar metode til isolering og dyrkning af dermaleSC'er og 2) at anvende en effektiv, robust metode til isolering af keratinocytter, fibroblaster og SC'er fra en enkelt menneskelig forhud.
På nuværende tidspunkt er der etablerede protokoller til isolering af hudkeratinocytter 2,3,4 og fibroblaster 5,6. Disse undersøgelser beskriver isoleringen af enten keratinocytter, fibroblaster eller begge dele fra huden, men ingen protokol omhandler, hvordan man etablerer kulturer af primære SC'er fra menneskelig hud. Nylige undersøgelser tyder på, at neuronale SC'er modulerer keratinocyt- og fibroblastcellulære processer og regulerer normale hudfysiologiske funktioner7. SC'er er således kritiske for hudens homeostase og bidrager væsentligt til den regulerende fysiologi, der påvirker adfærden hos de nærliggende hudcelletyper, der er til stede8. Derfor er en protokol, der muliggør isolering af hver af disse celletyper, ideel til in vitro-eksperimenter, der involverer celle-cellekommunikation eller krydstale mellem celletyper.
Denne protokol beskriver etableringen af individuelle cellekulturer af primære celler fra et enkelt stykke hud. Denne protokol er især nyttig, når mængden af tilgængeligt væv er begrænset. Desuden giver isolering af alle tre celletyper fra en enkelt donor mulighed for robuste sammenligninger mellem celletyper eller co-kulturforsøg, samtidig med at genetikkens indflydelse mindskes under det ønskede eksperiment.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;M sterile filters (Millex-GP Syringe Filter Unit,polyethersulfone)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SLGPR33RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;M cell strainers</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;M cell strainers</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL disposable syringes</td>
			<td>BD Luer-Lok</td>
			<td>BD-309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL disposable syringes (Syringe sterile, single use)</td>
			<td>BD Luer-Lok</td>
			<td>BD309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL disposable syringes</td>
			<td>BD Luer-Lok</td>
			<td>BD305462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% TritonX-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-1L</td>
			<td>Prepared at the time of use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>J19943.K2</td>
			<td>Ready to use and store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td>Prepared at the time of use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemometec Vial1-Cassette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1420193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17018-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12544D 22*50-1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D46693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM basal medium</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>9221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline free from Ca2+ and Mg2+ (DPBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;21-031-CV)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL micro-centrifuge tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-681-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast complete medium</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>2331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11032</td>
			<td>Dilution (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>Dilution (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Buffered Saline Solution (HBSS buffer)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human foreskin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>De-identified human foreskin tissue for research purposes (Institutional Review Board- IRB #17574).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KGM-GOLD keratinocyte medium (KGM gold and supplements)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>00192151 and 00192152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse alpha-smooth muscle actin antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-9760-82</td>
			<td>Dilution (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Cytokeratin14 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7800</td>
			<td>Dilution (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse S100 antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MA5-12969</td>
			<td>Dilution (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi chambered (4 well glass slide)</td>
			<td>Tab-Tek</td>
			<td>154526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoCounter -Via1-Cassette</td>
			<td>Chemometec</td>
			<td>941-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysisne (PLL)</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>32503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Anti-fade Mountant with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit K10 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB4501656</td>
			<td>Dilution (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit p75-NTR antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB1554</td>
			<td>Dilution (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit vimentin</td>
			<td>ProteinTech</td>
			<td>10366-1-AP</td>
			<td>Dilution (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schwann cell culture medium</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>1701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision tweezers DUMONT straight with extra fine tips Dumostar, 5</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>LH75.1</td>
			<td>Sterilize with 70% alcohol before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS Scissors, sharp/sharp. Length 4&#8211;3/8&#34;(111mm)</td>
			<td>Codman</td>
			<td>54-6500</td>
			<td>Sterilize with 70% alcohol before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized surgical - sharp blade (Duro Edge Economy Single Edge Blades)</td>
			<td>Razor blade company</td>
			<td>94-0120</td>
			<td>Sterilize with 70% alcohol before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin neutralization buffer (TNS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Axio Observer 7- Axiocam 506 mono &#8211; Apotome.2 microscope</td>
			<td>For immunofluorescence of chamber slide containing stained cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Primovert</td>
			<td>For visulaizing/observing cell attachment or detachment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and characterization of primary schwann cells, keratinocytes, and fibroblasts from human foreskin

Denne protokol beskriver isolationsmetoder, dyrkningsbetingelser og karakterisering af humane primære celler med højt udbytte og levedygtighed ved hjælp af hurtig enzymatisk dissociation af huden. Primære keratinocytter, fibroblaster og Schwann-celler høstes alle fra den menneskelige nyfødte forhud, som er tilgængelig efter standardplejeprocedurer. Den fjernede hud desinficeres, og det subkutane fedt og muskler fjernes ved hjælp af en skalpel. Metoden består af enzymatisk og mekanisk adskillelse af epidermale og dermale lag efterfulgt af yderligere enzymatisk fordøjelse for at opnå enkeltcellesuspensioner fra hvert af disse hudlag. Endelig dyrkes enkeltceller i passende cellekulturmedier efter standard cellekulturprotokoller for at opretholde vækst og levedygtighed over uger. Sammen tillader denne enkle protokol isolering, dyrkning og karakterisering af alle tre celletyper fra et enkelt stykke hud til in vitro-evaluering af hudnervemodeller. Derudover kan disse celler bruges sammen i co-kulturer til at måle deres virkninger på hinanden og deres reaktioner på in vitro-traumer i form af ridser udført robotisk i kulturen forbundet med sårheling.

Normal neonatal forhud blev anvendt til isolering af primære epidermale keratinocytter og dermale SC'er og fibroblaster. De isolerede primære celler blev dyrket i respektive cellekulturmedier indeholdende vækstfaktorer. Efter såning af SC'er og fibroblast i dyrkningskolber klæbede de fleste celler til bunden af kolben inden for 2 timer. I tilfælde af keratinocytter klæbede de fleste keratinocytter med 24 timer. Isolerede epidermale primære keratinocytter nåede 85% sammenløb på dag 7 og udviste karakteristisk c...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin at JoVE.com

Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin

Undersøgelsen af sårheling forbundet med muskuloskeletal skade kræver ofte vurdering af in vitro-interaktioner mellem Schwann-celler (SC'er), keratinocytter og fibroblaster. Denne protokol beskriver isolering, dyrkning og karakterisering af disse primære celler fra den menneskelige forhud.

Isolering, kultur og karakterisering af primære Schwann-celler, keratinocytter og fibroblaster fra human forhud

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid ...

Huden indeholder flere celletyper, herunder keratinocytter, fibroblaster og nerve Schwann-celler. Denne protokol tillader isolering af hver af disse celletyper til in vitro-eksperimenter. Isolering og etablering af individuelle primære cellekulturer fra en enkelt donor giver mulighed for robuste sammenligninger og co-kulturforsøg, samtidig med at virkningerne af genetisk variation afbødes.Med denne protokol tillader analysen af individuelle celler og deres interaktioner analysen af Schwann-cellernes rolle i hudhomeostase og patofysiologi. Disse forskellige cellepopulationer kan bruges til at studere Schwann-celler, fibroblaster eller keratinocytter enten individuelt eller i kombination i normal hudfysiologi, sårheling eller i hudsygdomme tilstande. Jagadeeshaprasad M G, en postdoktoral forsker i mit laboratorium, vil hjælpe mig med at demonstrere proceduren.Efter at have erhvervet den neonatale forhud efter standardplejeprocedurer, anbringes den udskårne forhud i et mikrocentrifugerør indeholdende otte til 10 ml iskoldt DMEM-basalmedium og transporterer straks forhuden til cellekulturlaboratoriet for celleisolering. Skyl forhuden to gange med 20 til 25 ml Dulbeccos fosfatbufrede saltvand eller DPBS, der indeholder antibiotika og antimykotisk. Sug derefter den vaskede hud i blød i 25 til 30 ml iskoldt DMEM basalmedium i en 10 centimeter vævskulturskål.Efter 15 minutter skæres forhuden op ved hjælp af en skalpel for at udsætte dermis og subkutant fedtvæv. Brug tang, et skalpelblad og en saks til at fjerne og kassere det subkutane fedtvæv. Skær derefter den rene forhud i tre til fem mindre stykker og inkuber hudstykkerne i 16 til 20 ml Dispace et DMEM-medium i et sterilt konisk rør.I løbet af de første 30 minutters inkubation med Dispace blandes med mellemrum hudstykkerne i det koniske rør ved inversion. Placer derefter det koniske rør ved fire grader Celsius i 16 til 18 timer. Den næste dag skal du fjerne hudstykkerne og placere dem på en tør steril kulturskål og rulle hvert stykke hud ud, så det ydre epidermislag rører ved kulturskålen.Begyndende på kanten af vævet skræl epidermis væk fra dermis ved hjælp af to sæt tang. Tilsæt de adskilte epidermisfragmenter til fem milliliter HBS i en 10 centimeter kulturskål for at inkubere ved stuetemperatur i 10 minutter. Opsaml derefter HBS-opløsningen i et 50 ml konisk rør og tilsæt fem milliliter trypsinneutraliseringsbuffer eller T og B i det koniske rør.Sæt røret til side. Til de epidermale fragmenter i kulturskålen tilsættes tre milliliter Trypsin-opløsning for at inkubere ved 37 grader Celsius i 10 minutter. Efter inkubationen omrøres forsigtigt de epidermale fragmenter med tang, indtil trypsinkeratinocytopløsningen bliver uklar.Tilsæt derefter trypsinkeratinocytopløsningen til HBS T- og B-røret. Efter opløsning af ufordøjede epidermale fragmenter med trypsin EDTA-opløsning tilsættes to milliliter FBS til HBS T- og B-røret indeholdende trypsin EDTA-opløsning og centrifugeres de to ca. 870 gange G i fem minutter ved fire grader Celsius. Derefter aspirerer supernatanten og resuspender cellepillen i tre milliliter keratinocyt komplet vækstmedium efterfulgt af filtrering af cellesuspensionen med et sterilt 100 mikrometer filter i et sterilt 50 ml konisk rør.Når celletallet og cellelevedygtigheden er kvantificeret, frø cellerne i kulturpladerne til at placere i en inkubator ved 37 grader Celsius i 5% kuldioxid. Efter to dage aspirerer de ikke-klæbede celler, og opdater cellekulturmedierne hver anden dag, indtil keratinocytter når 50 til 80% sammenløb til passaging eller downstream eksperimenter. Forcoat T25-kolber med poly-l-lysin eller PLL ved hjælp af fem milliliter DPBS og anbringes de forbelagte kolber ved 37 grader Celsius i tre timer.Senere vaskes PLL-belægningsmatrixen to gange med DPBS. Efter vask af de isolerede stykker dermis med fem milliliter DMEM basal medium, hakkes dermis i små stykker med en saks. Fordøje hakket dermis med fem milliliter kollagenase ved 37 grader Celsius i to og en halv time, med blid titrering ved hjælp af en pipettespids hvert 30. minut, indtil dermis dissocieres fuldstændigt.Når den er fordøjet, filtreres cellesuspensionen med en 70 mikrometer cellesil efterfulgt af fortynding af den filtrerede cellesuspension med fem ml komplet DMEM-medium for at stoppe kollagenasens enzymatiske aktivitet. Derefter centrifugeres cellesuspensionen ved 870 gange G i fem minutter ved stuetemperatur og resuspender cellestemmesedlen i to milliliter DMEM komplet medium for at opdele cellerne. Efter at have gentaget centrifikationsprocessen som beskrevet, aspirerer supernatanten til at bruge cellepillen til at isolere Schwann-cellerne eller fibroblasterne.For at isolere Schwan-cellerne skal cellepillen genanvendes i fem milliliter frisk DMEM komplet medium og kvantificere celleantallet og levedygtigheden, inden fem milliliter af de resuspenderede celler i forkodede T25-kolber med en densitet på 4,0 gange 10 til de tre celler pr. Milliliter. Inkuber kolben ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid. Efter 16 timer bekræftes celleadhæsion ved mikroskopi ved 10X forstørrelse.Fjern derefter de ikke-adseksionceller, og kolben vaskes tre gange med fem milliliter DPBS. Derefter inkuberes cellerne med fem milliliter 10 mikromolære cytosin arabinosid i et DMEM komplet medium. Efter 24 timer aspirerer cytosinabbinosidet indeholdende medium, inden kolben skylles som påvist før.Genopfyld kulturkolben med fem milliliter Schwann-celler fuldender kulturmediet for at inkubere 48 timer, mens mediet opdateres hver anden dag, indtil Schwann-cellerne når 80% sammenløb. For at isolere fibroblasterne skal du resuspend den opsamlede pellet i fem milliliter fibroblaster komplet medium. Til dyrkning af cellerne i ikke-kodede T25-dyrkningskolber i 24 timer som påvist for Schwann-cellerne.Efter at have aspireret de ikke-adsekserende celler og vasket kolben, inkuberes cellerne med fem milliliter friske fibroblaster komplet medium ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i 48 timer. Da de isolerede primære celler blev dyrket i respektive cellekulturmedier, nåede de primære keratinocytter 85% sammenflydende på dag syv og udviste karakteristisk cellemorfologi med en brostensform. Schwann-cellerne nåede 95% sammenløb på dag fem og syntes bipolære eller tripolære i form.Fibroblastkulturerne nåede 95% sammenløb på dag fire, og de fleste celler udviste en spindelformet morfologi. Immunofluorescensfarvningen bekræftede celletypespecifik proteinekspression i cellekulturerne. Keratinocytterne var positive for K10- og K14-protein.De fusionerede billeder af keratinimmunfluorescens og DAPI-nuklear farvning indikerede 97,8% renhed af cellekulturerne. Tilsvarende var Schwann-cellerne positive for S100 og P75 NTR og havde en renhed på 95,2% i kulturen. Fibroblasterne udtrykte positivt vimentin, men udtrykte ikke alfa glat muskel Actin, en myofibroblastmarkør.Kulturens renhed var omkring 97,2%For at forbedre Shanses beviser kan præ-coated poly-l-lysinskål anvendes. Og for yderligere at afbøde fibrøs forurening blev cytosin arabinosid og antimykotisk middel tilsat, efter at celler var tilsat i kort tid. Dette er en simpel billig eksperimentel procedure til at etablere de tre primære celler, såsom shwannceller, keratinocytter og fibroblaster, fra en enkelt menneskelig forhud.Denne protokol er ideel til in vitro-eksperimenter, der involverer cellecellekommunikation eller krydstale mellem celletyper.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

Isolering og Kultur neuralkam stamceller fra menneskelige hårsække

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

Isolation and Culture of Human Fungiform Taste Papillae Cells

Isolering og dyrkning af humane Fungiform Taste papiller Celler

Taste cells are highly specialized, with unique histological, molecular and physiological characteristics that permit detection of a wide range of simple ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Isolering og dyrkning af neurale kamceller fra embryonale Murin Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Isolering og dyrkning af endotelceller fra embryonale forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Isolation, Kultur og opretholdelse på lang sigt af Primary mesencephaliske dopaminerge neuroner af embryonale Gnavere Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Isolering og dyrkning af Voksen neurale stamceller fra mus Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Simpel Generation af højtydende kultur af inducerede neuroner fra menneskelige voksen hud fibroblaster

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Karakterisering og Isolation af musen primære mikroglia ved tæthed Gradient centrifugering

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Dorsalrodsganglier Isolation og primære kultur at studere Neurotransmitter frigivelse

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

Primær kultur af neuroner isoleret fra embryonale mus cerebellum

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...