Name: isolation, culture, and characterization of primary schwann cells, keratinocytes, and fibroblasts from human foreskin
Uploaded: 2022-03-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin at JoVE.com

We willen Dr. Fadia Kamal en Dr. Reyad Elbarbary bedanken voor het feit dat ze ons in staat hebben gesteld om laboratoriuminstrumenten en technische ondersteuning te gebruiken. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de NIH (K08 AR060164-01A) en DOD (W81XWH-16-1-0725) aan J. C. E. naast institutionele ondersteuning van het Pennsylvania State University Hershey Medical Center.

Acquisitie en gebruik van gedeïdentificeerd menselijk voorhuidweefsel voor onderzoeksdoeleinden werd beoordeeld en ontving de bepaling van "niet menselijk onderzoek" door de Penn State College of Medicine Institutional Review Board (IRB # 17574).
OPMERKING: Door het onderstaande protocol te volgen, worden 2,4 x 106 keratinocyten, 4,4 x 106 fibroblasten en 1,1 x 106 SC's verkregen uit een enkele voorhuid. Over het algemeen kunnen deze primaire cellen worden geb...

<ol>
	<li>Hawksworth, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+disadvantages+of+using+human+cells+for+pharmacological+and+toxicological+studies.">Advantages and disadvantages of using human cells for pharmacological and toxicological studies.</a> Human &amp; Experimental Toxicology. 13 (8), 568-573 (1994).</li><li>Green, H., Kehinde, O., Thomas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+cultured+human+epidermal+cells+into+multiple+epithelia+suitable+for+grafting.">Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (11), 5665-5668 (1979).</li><li>Fuchs, E., Green, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+keratin+gene+expression+during+terminal+differentiation+of+the+keratinocyte.">Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocyte.</a> Cell. 19 (4), 1033-1042 (1980).</li><li>Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+cultivation+of+human+keratinocytes+from+skin+or+plucked+hair+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells.">Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).</li><li>Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+primary+adult+fibroblast+cultures+from+rodents.">Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2033 (2010).</li><li>Belviso, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+adult+human+dermal+fibroblasts+from+abdominal+skin+and+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+using+a+non-integrating+method.">Isolation of adult human dermal fibroblasts from abdominal skin and generation of induced pluripotent stem cells using a non-integrating method.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60629 (2020).</li><li>Silva, W. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Schwann+cells+in+cutaneous+wound+healing.">Role of Schwann cells in cutaneous wound healing.</a> Wound Repair and Regeneration. 26 (5), 392-397 (2018).</li><li>Bray, E. R., Cheret, J., Yosipovitch, G., Paus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cells+as+underestimated,+major+players+in+human+skin+physiology+and+pathology.">Schwann cells as underestimated, major players in human skin physiology and pathology.</a> Experimental Dermatology. 29 (1), 93-101 (2020).</li><li>Laverdet, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+innervation:+important+roles+during+normal+and+pathological+cutaneous+repair.">Skin innervation: important roles during normal and pathological cutaneous repair.</a> Histology and Histopathology. 30 (8), 875-892 (2015).</li><li>Jessen, K. R., Mirsky, R., Lloyd, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cells:+Development+and+role+in+nerve+repair.">Schwann cells: Development and role in nerve repair.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (7), 020487 (2015).</li><li>Bentley, C. A., Lee, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p75+is+important+for+axon+growth+and+Schwann+cell+migration+during+development.">p75 is important for axon growth and Schwann cell migration during development.</a> The Journal of Neuroscience. 20 (20), 7706-7715 (2000).</li><li>Rutkowski, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signals+for+proinflammatory+cytokine+secretion+by+human+Schwann+cells.">Signals for proinflammatory cytokine secretion by human Schwann cells.</a> Journal of Neuroimmunology. 101 (1), 47-60 (1999).</li><li>Kumar, A., Brockes, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+dependence+in+tissue,+organ,+and+appendage+regeneration.">Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration.</a> Trends in Neurosciences. 35 (11), 691-699 (2012).</li><li>Balakrishnan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+role+and+potential+of+Schwann+cells+for+peripheral+nerve+repair+from+studies+of+development+and+injury.">Insights into the role and potential of Schwann cells for peripheral nerve repair from studies of development and injury.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 608442 (2020).</li><li>Gresset, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boundary+caps+give+rise+to+neurogenic+stem+cells+and+terminal+glia+in+the+skin.">Boundary caps give rise to neurogenic stem cells and terminal glia in the skin.</a> Stem Cell Reports. 5 (2), 278-290 (2015).</li><li>Stratton, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+Schwann+cells+from+adult+human+skin+and+nerve.">Purification and characterization of Schwann cells from adult human skin and nerve.</a> eNeuro. 4 (3), (2017).</li></ol>

Dit protocol beschrijft een methode om drie verschillende celpopulaties te isoleren uit een enkel stuk van de voorhuid, namelijk keratinocyten, fibroblasten en Schwann-cellen. Er zijn een paar isolatieprotocollen beschikbaar om keratinocyten en fibroblasten 2,3,5,6 te isoleren, maar geen enkele beschrijft SC-isolatie. Afgezien van de belangrijkste structurele cellen in de huid, keratinocyten en...

Primaire cellen afgeleid van levend weefsel en gekweekt onder in vitro omstandigheden lijken sterk op de fysiologische toestand1, waardoor ze een ideaal model zijn voor het onderzoeken van fysiologische en pathofysiologische processen. De huid bevat meerdere celtypen, waaronder keratinocyten, fibroblasten, sebocyten, melanocyten en Schwann-cellen (SC's), die kunnen worden geïsoleerd en gekweekt voor in vitro experimenten. Methoden om keratinocyten, fibroblasten en SC's te isoleren en te kweken, uit een enkel stuk huid, zijn niet beschreven. Het doel van dit protocol is tweeledig: 1) het vaststellen van een betrouwbare en reproduceerbare methode voor het isoleren en kweken van dermale SC's en 2) het gebruik van een efficiënte, robuuste methode voor de isolatie van keratinocyten, fibroblasten en SC's van een enkele menselijke voorhuid.
Op dit moment zijn er vastgestelde protocollen om huidkeratocyten 2,3,4 en fibroblasten 5,6 te isoleren. Deze studies beschrijven de isolatie van keratinocyten, fibroblasten of beide van de huid, maar geen protocol gaat in op het vaststellen van culturen van primaire SC's uit de menselijke huid. Recente studies suggereren dat neuronale SC's keratinocyten en fibroblast cellulaire processen moduleren en normale huidfysiologische functies reguleren7. SC's zijn dus van cruciaal belang voor de homeostase van de huid en dragen substantieel bij aan de regulerende fysiologie die het gedrag van naburige huidceltypen beïnvloedt8. Daarom is een protocol dat de isolatie van elk van deze celtypen mogelijk maakt, ideaal voor in vitro experimenten met cel-celcommunicatie of cross-talk tussen celtypen.
Dit protocol beschrijft de vaststelling van individuele celculturen van primaire cellen uit een enkel stuk huid. Dit protocol is vooral handig wanneer de hoeveelheid beschikbaar weefsel beperkt is. Bovendien maakt isolatie van alle drie de celtypen van een enkele donor robuuste vergelijkingen tussen celtypen of co-kweekexperimenten mogelijk, terwijl de invloed van genetica tijdens het gewenste experiment wordt beperkt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;M sterile filters (Millex-GP Syringe Filter Unit,polyethersulfone)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SLGPR33RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;M cell strainers</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;M cell strainers</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL disposable syringes</td>
			<td>BD Luer-Lok</td>
			<td>BD-309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL disposable syringes (Syringe sterile, single use)</td>
			<td>BD Luer-Lok</td>
			<td>BD309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL disposable syringes</td>
			<td>BD Luer-Lok</td>
			<td>BD305462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% TritonX-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-1L</td>
			<td>Prepared at the time of use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>J19943.K2</td>
			<td>Ready to use and store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td>Prepared at the time of use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemometec Vial1-Cassette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1420193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17018-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12544D 22*50-1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D46693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM basal medium</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>9221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline free from Ca2+ and Mg2+ (DPBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;21-031-CV)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL micro-centrifuge tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-681-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast complete medium</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>2331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11032</td>
			<td>Dilution (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>Dilution (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Buffered Saline Solution (HBSS buffer)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human foreskin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>De-identified human foreskin tissue for research purposes (Institutional Review Board- IRB #17574).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KGM-GOLD keratinocyte medium (KGM gold and supplements)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>00192151 and 00192152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse alpha-smooth muscle actin antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-9760-82</td>
			<td>Dilution (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Cytokeratin14 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7800</td>
			<td>Dilution (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse S100 antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MA5-12969</td>
			<td>Dilution (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi chambered (4 well glass slide)</td>
			<td>Tab-Tek</td>
			<td>154526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoCounter -Via1-Cassette</td>
			<td>Chemometec</td>
			<td>941-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysisne (PLL)</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>32503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Anti-fade Mountant with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit K10 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB4501656</td>
			<td>Dilution (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit p75-NTR antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB1554</td>
			<td>Dilution (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit vimentin</td>
			<td>ProteinTech</td>
			<td>10366-1-AP</td>
			<td>Dilution (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schwann cell culture medium</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>1701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision tweezers DUMONT straight with extra fine tips Dumostar, 5</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>LH75.1</td>
			<td>Sterilize with 70% alcohol before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS Scissors, sharp/sharp. Length 4&#8211;3/8&#34;(111mm)</td>
			<td>Codman</td>
			<td>54-6500</td>
			<td>Sterilize with 70% alcohol before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized surgical - sharp blade (Duro Edge Economy Single Edge Blades)</td>
			<td>Razor blade company</td>
			<td>94-0120</td>
			<td>Sterilize with 70% alcohol before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin neutralization buffer (TNS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Axio Observer 7- Axiocam 506 mono &#8211; Apotome.2 microscope</td>
			<td>For immunofluorescence of chamber slide containing stained cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Primovert</td>
			<td>For visulaizing/observing cell attachment or detachment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and characterization of primary schwann cells, keratinocytes, and fibroblasts from human foreskin

Dit protocol beschrijft isolatiemethoden, kweekomstandigheden en karakterisering van menselijke primaire cellen met een hoge opbrengst en levensvatbaarheid met behulp van snelle enzymatische dissociatie van de huid. Primaire keratinocyten, fibroblasten en Schwann-cellen worden allemaal geoogst uit de menselijke pasgeboren voorhuid, die beschikbaar is volgens standaardzorgprocedures. De verwijderde huid wordt gedesinfecteerd en het onderhuidse vet en de spieren worden verwijderd met behulp van een scalpel. De methode bestaat uit enzymatische en mechanische scheiding van epidermale en dermale lagen, gevolgd door extra enzymatische spijsvertering om eencellige suspensies te verkrijgen van elk van deze huidlagen. Ten slotte worden afzonderlijke cellen gekweekt in geschikte celkweekmedia volgens standaard celkweekprotocollen om de groei en levensvatbaarheid gedurende weken te behouden. Samen maakt dit eenvoudige protocol isolatie, kweek en karakterisering van alle drie de celtypen uit één stuk huid mogelijk voor in vitro evaluatie van huid-zenuwmodellen. Bovendien kunnen deze cellen samen in coculturen worden gebruikt om hun effecten op elkaar en hun reacties op in vitro trauma te meten in de vorm van krassen die robotisch worden uitgevoerd in de cultuur die verband houdt met wondgenezing.

Normale neonatale voorhuid werd gebruikt voor de isolatie van primaire epidermale keratinocyten en dermale SC's en fibroblasten. De geïsoleerde primaire cellen werden gekweekt in respectievelijke celkweekmedia die groeifactoren bevatten. Na het zaaien van SC's en fibroblast in kweekkolven kleefden de meeste cellen binnen 2 uur aan de bodem van de kolf. In het geval van keratinocyten hechten de meeste keratinocyten 24 uur. Geïsoleerde epidermale primaire keratinocyten bereikten 85% confluentie op dag 7 en vertoonden kar...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin at JoVE.com

Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin

De studie van wondgenezing geassocieerd met musculoskeletale schade vereist vaak de beoordeling van in vitro interacties tussen Schwann-cellen (SC's), keratinocyten en fibroblasten. Dit protocol beschrijft de isolatie, kweek en karakterisering van deze primaire cellen uit de menselijke voorhuid.

Isolatie, kweek en karakterisering van primaire Schwann-cellen, keratinocyten en fibroblasten uit menselijke voorhuid

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid ...

De huid bevat meerdere celtypen, waaronder keratinocyten, fibroblasten en zenuw Schwann-cellen. Dit protocol maakt isolatie van elk van deze celtypen mogelijk voor in vitro experimenten. Isolatie en vestiging van individuele primaire celculturen van een enkele donor maakt robuuste vergelijkingen en co-kweekexperimenten mogelijk, terwijl de effecten van genetische variatie worden beperkt.Met dit protocol maakt de analyse van individuele cellen en hun interacties de analyse van de rol van Schwann-cellen in de homeostase van de huid en pathofysiologie mogelijk. Deze verschillende celpopulaties kunnen worden gebruikt om Schwann-cellen, fibroblasten of keratinocyten individueel of in combinatie te bestuderen in normale huidfysiologie, wondgenezing of in huidziektetoestanden. Jagadeeshaprasad M G, een postdoctoraal onderzoeker in mijn laboratorium, zal me helpen bij het demonstreren van de procedure.Na het verkrijgen van de neonatale voorhuid volgens standaardzorgprocedures, plaatst u de weggesneden voorhuid in een microcentrifugebuis met acht tot 10 milliliter ijskoud DMEM-basaal medium en transporteert u de voorhuid onmiddellijk naar het celkweeklaboratorium voor celisolatie. Spoel de voorhuid tweemaal met 20 tot 25 milliliter Dulbecco's Phosphate Buffered Saline of DPBS, met antibiotica en antimycotica. Week vervolgens de gewassen huid in 25 tot 30 milliliter ijskoud DMEM basaal medium in een 10 centimeter weefselkweekschaal.Snijd na 15 minuten de voorhuid open met een scalpel om de dermis en het onderhuidse vetweefsel bloot te leggen. Gebruik een tang, een scalpelmes en een schaar om het onderhuidse vetweefsel te verwijderen en weg te gooien. Snijd vervolgens de schone voorhuid in drie tot vijf kleinere stukken en incubeer de huidstukken in 16 tot 20 milliliter Dispace één DMEM-medium in een steriele conische buis.Tijdens de eerste 30 minuten incubatie met Dispace mengt men met tussenpozen de huidstukken in de conische buis door inversie. Plaats vervolgens de conische buis gedurende 16 tot 18 uur op vier graden Celsius. Verwijder de volgende dag de huidstukken en leg ze op een droge steriele kweekschaal en rol elk stukje huid uit zodat de buitenste opperhuidlaag de kweekschaal raakt.Beginnend op de rand van het weefsel pelt u de opperhuid weg van de dermis met behulp van twee sets tangen. Voeg de afgescheiden epidermisfragmenten toe aan vijf milliliter HBS in een kweekschaal van 10 centimeter om gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur te incuberen. Verzamel vervolgens de HBS-oplossing in een conische buis van 50 milliliter en voeg vijf milliliter trypsineneutralisatiebuffer of T en B toe aan de conische buis.Zet de buis apart. Voeg aan de epidermale fragmenten in de kweekschaal drie milliliter Trypsin-oplossing toe om gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius te incuberen. Na de incubatie roert u de epidermale fragmenten voorzichtig met een tang totdat de trypsine keratinocytenoplossing troebel wordt.Voeg vervolgens de trypsine keratinocytenoplossing toe aan de HBS T- en B-buis. Voeg na het oplossen van onverteerde epidermale fragmenten met trypsine EDTA-oplossing twee milliliter FBS toe aan de HBS T- en B-buis met trypsine EDTA-oplossing en centrifugeer de twee ongeveer 870 keer G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Adem vervolgens het supernatant op en resuspend de celkorrel in drie milliliter keratinocyten, compleet groeimedium, gevolgd door filtratie van de celsuspensie met een steriel filter van 100 micrometer in een steriele conische buis van 50 milliliter.Zodra het celnummer en de levensvatbaarheid van de cel zijn gekwantificeerd, zaait u de cellen in de kweekplaten om in een incubator bij 37 graden Celsius in 5% koolstofdioxide te plaatsen. Na twee dagen aspiraat de niet-gehechte cellen en ververs de celkweekmedia om de andere dag totdat keratinocyten 50 tot 80% confluentie bereiken voor passaging of downstream experimenten. Bestrijk T25-kolven met poly-l-lysine of PLL met vijf milliliter DPBS en plaats de voorgecoate kolven gedurende drie uur op 37 graden Celsius.Was de PLL-coatingmatrix later tweemaal met DPBS. Na het wassen van de geïsoleerde stukken van de dermis met vijf milliliter DMEM basaal medium, hak de dermis in kleine stukjes met een schaar. Verteer de gehakte dermis met vijf milliliter collagenase bij 37 graden Celsius gedurende twee en een half uur, met zachte titratie met een pipetpunt om de 30 minuten totdat de dermis volledig dissociëert.Eenmaal verteerd, filtert u de celsuspensie met een celzeef van 70 micrometer, gevolgd door verdunning van de gefilterde celsuspensie met vijf milliliter volledig DMEM-medium om de enzymatische activiteit van collagenase te stoppen. Centrifugeer vervolgens de celsuspensie op 870 keer G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur en resuspend de celstem in twee milliliter DMEM compleet medium om de cellen te delen. Na het herhalen van het centrificatieproces zoals beschreven, aspirateer je het supernatant om de celkorrel te gebruiken om de Schwann-cellen of fibroblasten te isoleren.Om de Schwan-cellen te isoleren, resuspendeert u de celkorrel in vijf milliliter vers DMEM-volledig medium en kwantificeert u het celnummer en de levensvatbaarheid voordat vijf milliliter van de geresuspendeerde cellen in voorgecodeerde T25-kolven met een dichtheid van 4,0 maal 10 tot de drie cellen per milliliter worden gezaaid. Incubeer de kolf bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Bevestig na 16 uur de celhechting door microscopie bij 10X vergroting.Verwijder vervolgens de niet-hechtende cellen en was de kolf driemaal met vijf milliliter DPBS. Incubateer vervolgens de cellen met vijf milliliter 10 micromolair cytosine arabinoside in een DMEM compleet medium. Na 24 uur aspiraleer het cytosine arabinoside bevattende medium voordat u de kolf spoelt zoals eerder aangetoond.Vul de kweekkolf met vijf milliliter Schwann-cellen volledig kweekmedium om 48 uur te incuberen, terwijl het medium om de andere dag wordt ververst tot schwanncellen 80% confluentie bereiken. Om de fibroblasten te isoleren, resuspend de verzamelde pellet in vijf milliliter fibroblasten volledig medium. Het kweken van de cellen in niet-gecodeerde T25-kweekkolven gedurende 24 uur, zoals aangetoond voor de Schwann-cellen.Na het aanzuigen van de niet-hechtende cellen en het wassen van de kolf, incubeer de cellen met vijf milliliter verse fibroblasten volledig medium bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende 48 uur. Aangezien de geïsoleerde primaire cellen werden gekweekt in de respectieve celkweekmedia, bereikten de primaire keratinocyten op dag zeven 85% confluïteit en vertoonden ze een karakteristieke celmorfologie met een geplaveide vorm. De Schwann-cellen bereikten 95% confluentie op dag vijf en leken bipolair of tripolair van vorm.De fibroblastenculturen bereikten 95% confluentie op dag vier en de meeste cellen vertoonden een spindelvormige morfologie. De immunofluorescentiekleuring bevestigde celtypespecifieke eiwitexpressie in de celculturen. De keratinocyten waren positief voor K10- en K14-eiwit.De samengevoegde beelden van keratine immunofluorescentie en DAPI nucleaire kleuring gaven 97,8% zuiverheid van de celculturen aan. Evenzo waren de Schwann-cellen positief voor S100 en P75 NTR en hadden ze een zuiverheid van 95,2% in de cultuur. De fibroblasten drukten vimentine positief uit, maar drukten geen alfa-gladde spier Actine, een myofibroblastmarker, tot expressie.De zuiverheid van de cultuur was ongeveer 97,2% Om Shanse's bewijs te verbeteren, kan een voorgecoat poly-l-lysine-gerecht worden gebruikt. En om vezelige besmetting verder te verminderen, werden cytosine arabinoside en antimycotisch middel toegevoegd nadat cellen gedurende een korte tijd waren toegevoegd. Dit is een eenvoudige goedkope experimentele procedure om de drie primaire cellen, zoals shwann-cellen, keratinocyten en fibroblasten, vast te stellen uit een enkele menselijke voorhuid.Dit protocol is ideaal voor in vitro experimenten met celcelcommunicatie of kruisverwijzing tussen celtypen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

Isolatie en Cultuur van neurale stamcellen uit menselijke haarzakjes

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

Isolation and Culture of Human Fungiform Taste Papillae Cells

Isolatie en Cultuur van de Mens Fungiform Smaak papillen Cellen

Taste cells are highly specialized, with unique histological, molecular and physiological characteristics that permit detection of a wide range of simple ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Isolatie en Cultuur van neurale lijst cellen van embryonale Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Isolatie en Cultuur van de endotheelcellen van de embryonale voorhersenen

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Isolatie, Cultuur en onderhoud op lange termijn van de Primary mesencefale dopaminerge neuronen uit embryonale knaagdieren Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Isolatie en cultuur van de volwassen neurale stamcellen van de muis Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Eenvoudige generatie van de cultuur van een hoog rendement van geïnduceerde neuronen van menselijke volwassen huid fibroblasten

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Karakterisering en isolatie van de primaire Microglia muis door dichtheid kleurovergang centrifugeren

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Dorsal Root Ganglia isolatie en primaire cultuur te bestuderen van de Neurotransmitter Release

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

Primaire cultuur van neuronen geïsoleerd van embryonale muis cerebellum

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...