Name: isolation, culture, and characterization of primary schwann cells, keratinocytes, and fibroblasts from human foreskin
Uploaded: 2022-03-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin at JoVE.com

Wir möchten uns bei Dr. Fadia Kamal und Dr. Reyad Elbarbary dafür bedanken, dass sie uns den Einsatz von Laborinstrumenten und technischem Support ermöglicht haben. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des NIH (K08 AR060164-01A) und des DOD (W81XWH-16-1-0725) an J. C. E. sowie durch institutionelle Unterstützung des Pennsylvania State University Hershey Medical Center unterstützt.

Der Erwerb und die Verwendung von de-identifiziertem menschlichem Vorhautgewebe für Forschungszwecke wurde überprüft und vom Penn State College of Medicine Institutional Review Board (IRB # 17574) als "nicht menschliche Forschung" eingestuft.
HINWEIS: Durch Befolgen des folgenden Protokolls werden 2,4 x 10 6 Keratinozyten, 4,4 x 10 6 Fibroblasten und 1,1 x 106 SCs aus einer einzigen Vorhaut gewonnen. Im Allgemeinen können diese Primärzellen für 3 Passagen...

<ol>
	<li>Hawksworth, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+disadvantages+of+using+human+cells+for+pharmacological+and+toxicological+studies.">Advantages and disadvantages of using human cells for pharmacological and toxicological studies.</a> Human &amp; Experimental Toxicology. 13 (8), 568-573 (1994).</li><li>Green, H., Kehinde, O., Thomas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+cultured+human+epidermal+cells+into+multiple+epithelia+suitable+for+grafting.">Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (11), 5665-5668 (1979).</li><li>Fuchs, E., Green, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+keratin+gene+expression+during+terminal+differentiation+of+the+keratinocyte.">Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocyte.</a> Cell. 19 (4), 1033-1042 (1980).</li><li>Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+cultivation+of+human+keratinocytes+from+skin+or+plucked+hair+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells.">Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).</li><li>Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+primary+adult+fibroblast+cultures+from+rodents.">Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2033 (2010).</li><li>Belviso, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+adult+human+dermal+fibroblasts+from+abdominal+skin+and+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+using+a+non-integrating+method.">Isolation of adult human dermal fibroblasts from abdominal skin and generation of induced pluripotent stem cells using a non-integrating method.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60629 (2020).</li><li>Silva, W. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Schwann+cells+in+cutaneous+wound+healing.">Role of Schwann cells in cutaneous wound healing.</a> Wound Repair and Regeneration. 26 (5), 392-397 (2018).</li><li>Bray, E. R., Cheret, J., Yosipovitch, G., Paus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cells+as+underestimated,+major+players+in+human+skin+physiology+and+pathology.">Schwann cells as underestimated, major players in human skin physiology and pathology.</a> Experimental Dermatology. 29 (1), 93-101 (2020).</li><li>Laverdet, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+innervation:+important+roles+during+normal+and+pathological+cutaneous+repair.">Skin innervation: important roles during normal and pathological cutaneous repair.</a> Histology and Histopathology. 30 (8), 875-892 (2015).</li><li>Jessen, K. R., Mirsky, R., Lloyd, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cells:+Development+and+role+in+nerve+repair.">Schwann cells: Development and role in nerve repair.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (7), 020487 (2015).</li><li>Bentley, C. A., Lee, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p75+is+important+for+axon+growth+and+Schwann+cell+migration+during+development.">p75 is important for axon growth and Schwann cell migration during development.</a> The Journal of Neuroscience. 20 (20), 7706-7715 (2000).</li><li>Rutkowski, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signals+for+proinflammatory+cytokine+secretion+by+human+Schwann+cells.">Signals for proinflammatory cytokine secretion by human Schwann cells.</a> Journal of Neuroimmunology. 101 (1), 47-60 (1999).</li><li>Kumar, A., Brockes, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+dependence+in+tissue,+organ,+and+appendage+regeneration.">Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration.</a> Trends in Neurosciences. 35 (11), 691-699 (2012).</li><li>Balakrishnan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+role+and+potential+of+Schwann+cells+for+peripheral+nerve+repair+from+studies+of+development+and+injury.">Insights into the role and potential of Schwann cells for peripheral nerve repair from studies of development and injury.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 608442 (2020).</li><li>Gresset, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boundary+caps+give+rise+to+neurogenic+stem+cells+and+terminal+glia+in+the+skin.">Boundary caps give rise to neurogenic stem cells and terminal glia in the skin.</a> Stem Cell Reports. 5 (2), 278-290 (2015).</li><li>Stratton, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+Schwann+cells+from+adult+human+skin+and+nerve.">Purification and characterization of Schwann cells from adult human skin and nerve.</a> eNeuro. 4 (3), (2017).</li></ol>

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um drei verschiedene Zellpopulationen aus einem einzigen Stück der Vorhaut zu isolieren, nämlich Keratinozyten, Fibroblasten und Schwann-Zellen. Es gibt einige Isolationsprotokolle, um Keratinozyten und Fibroblasten 2,3,5,6 zu isolieren, aber keines beschreibt die SC-Isolierung. Abgesehen von den wichtigsten Strukturzellen in Haut, Keratinozyten und ...

Primärzellen, die aus lebendem Gewebe gewonnen und unter In-vitro-Bedingungen kultiviert werden, ähneln stark dem physiologischen Zustand 1 und sind damit ein ideales Modell für die Untersuchung physiologischer und pathophysiologischer Prozesse. Die Haut enthält mehrere Zelltypen, darunter Keratinozyten, Fibroblasten, Sebozyten, Melanozyten und Schwann-Zellen (SCs), die für In-vitro-Experimente isoliert und kultiviert werden können. Methoden zur Isolierung und Kultivierung von Keratinozyten, Fibroblasten und SCs aus einem einzigen Stück Haut wurden nicht beschrieben. Das Ziel dieses Protokolls ist zweifach: 1) eine zuverlässige und reproduzierbare Methode zur Isolierung und Kultivierung von dermalen SCs zu etablieren und 2) eine effiziente, robuste Methode zur Isolierung von Keratinozyten, Fibroblasten und SCs aus einer einzigen menschlichen Vorhaut zu verwenden.
Derzeit gibt es etablierte Protokolle zur Isolierung der Hautkeratinozyten 2,3,4 und der Fibroblasten 5,6. Diese Studien beschreiben die Isolierung von Keratinozyten, Fibroblasten oder beiden aus der Haut, aber kein Protokoll befasst sich mit der Etablierung von Kulturen primärer SCs aus der menschlichen Haut. Neuere Studien deuten darauf hin, dass neuronale SCs Keratinozyten- und Fibroblastenzellprozesse modulieren und normale physiologische Hautfunktionen regulieren7. SCs sind daher entscheidend für die Hauthomöostase und tragen wesentlich zur regulierenden Physiologie bei, die das Verhalten benachbarter Hautzelltypen beeinflusst8. Daher ist ein Protokoll, das die Isolierung jedes dieser Zelltypen ermöglicht, ideal für In-vitro-Experimente mit Zell-Zell-Kommunikation oder Cross-Talk zwischen Zelltypen.
Dieses Protokoll beschreibt die Etablierung einzelner Zellkulturen von Primärzellen aus einem einzigen Stück Haut. Dieses Protokoll ist besonders nützlich, wenn die Menge an verfügbarem Gewebe begrenzt ist. Darüber hinaus ermöglicht die Isolierung aller drei Zelltypen von einem einzigen Spender robuste Vergleiche zwischen Zelltypen oder Kokulturexperimenten und mildert gleichzeitig den Einfluss der Genetik während des gewünschten Experiments.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;M sterile filters (Millex-GP Syringe Filter Unit,polyethersulfone)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SLGPR33RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;M cell strainers</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;M cell strainers</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL disposable syringes</td>
			<td>BD Luer-Lok</td>
			<td>BD-309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL disposable syringes (Syringe sterile, single use)</td>
			<td>BD Luer-Lok</td>
			<td>BD309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL disposable syringes</td>
			<td>BD Luer-Lok</td>
			<td>BD305462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% TritonX-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-1L</td>
			<td>Prepared at the time of use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>J19943.K2</td>
			<td>Ready to use and store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td>Prepared at the time of use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemometec Vial1-Cassette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1420193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17018-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12544D 22*50-1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D46693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM basal medium</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>9221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline free from Ca2+ and Mg2+ (DPBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;21-031-CV)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL micro-centrifuge tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-681-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast complete medium</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>2331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11032</td>
			<td>Dilution (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>Dilution (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Buffered Saline Solution (HBSS buffer)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human foreskin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>De-identified human foreskin tissue for research purposes (Institutional Review Board- IRB #17574).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KGM-GOLD keratinocyte medium (KGM gold and supplements)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>00192151 and 00192152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse alpha-smooth muscle actin antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-9760-82</td>
			<td>Dilution (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Cytokeratin14 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7800</td>
			<td>Dilution (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse S100 antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MA5-12969</td>
			<td>Dilution (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi chambered (4 well glass slide)</td>
			<td>Tab-Tek</td>
			<td>154526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoCounter -Via1-Cassette</td>
			<td>Chemometec</td>
			<td>941-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysisne (PLL)</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>32503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Anti-fade Mountant with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit K10 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB4501656</td>
			<td>Dilution (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit p75-NTR antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB1554</td>
			<td>Dilution (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit vimentin</td>
			<td>ProteinTech</td>
			<td>10366-1-AP</td>
			<td>Dilution (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schwann cell culture medium</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>1701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision tweezers DUMONT straight with extra fine tips Dumostar, 5</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>LH75.1</td>
			<td>Sterilize with 70% alcohol before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS Scissors, sharp/sharp. Length 4&#8211;3/8&#34;(111mm)</td>
			<td>Codman</td>
			<td>54-6500</td>
			<td>Sterilize with 70% alcohol before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized surgical - sharp blade (Duro Edge Economy Single Edge Blades)</td>
			<td>Razor blade company</td>
			<td>94-0120</td>
			<td>Sterilize with 70% alcohol before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin neutralization buffer (TNS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Axio Observer 7- Axiocam 506 mono &#8211; Apotome.2 microscope</td>
			<td>For immunofluorescence of chamber slide containing stained cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Primovert</td>
			<td>For visulaizing/observing cell attachment or detachment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and characterization of primary schwann cells, keratinocytes, and fibroblasts from human foreskin

Dieses Protokoll beschreibt Isolationsmethoden, Kultivierungsbedingungen und Charakterisierung menschlicher Primärzellen mit hoher Ausbeute und Lebensfähigkeit unter Verwendung einer schnellen enzymatischen Dissoziation der Haut. Primäre Keratinozyten, Fibroblasten und Schwann-Zellen werden alle aus der menschlichen neugeborenen Vorhaut gewonnen, die nach Standardbehandlungen verfügbar ist. Die entfernte Haut wird desinfiziert und das Unterhautfett und der Muskel werden mit einem Skalpell entfernt. Die Methode besteht aus einer enzymatischen und mechanischen Trennung von epidermalen und dermalen Schichten, gefolgt von einer zusätzlichen enzymatischen Verdauung, um Einzelzellsuspensionen aus jeder dieser Hautschichten zu erhalten. Schließlich werden einzelne Zellen in geeigneten Zellkulturmedien nach Standard-Zellkulturprotokollen gezüchtet, um das Wachstum und die Lebensfähigkeit über Wochen aufrechtzuerhalten. Zusammen ermöglicht dieses einfache Protokoll die Isolierung, Kultivierung und Charakterisierung aller drei Zelltypen aus einem einzigen Stück Haut für die In-vitro-Bewertung von Haut-Nerven-Modellen. Darüber hinaus können diese Zellen zusammen in Kokulturen verwendet werden, um ihre Auswirkungen aufeinander und ihre Reaktionen auf In-vitro-Traumata in Form von Kratzern, die roboterhaft in der mit der Wundheilung verbundenen Kultur durchgeführt werden, zu messen.

Normale neonatale Vorhaut wurde zur Isolierung von primären epidermalen Keratinozyten und dermalen SCs und Fibroblasten verwendet. Die isolierten Primärzellen wurden in entsprechenden Zellkulturmedien kultiviert, die Wachstumsfaktoren enthielten. Nach der Aussaat von SCs und Fibroblasten in Kulturflaschen haften die meisten Zellen innerhalb von 2 Stunden am Boden des Kolbens. Im Falle von Keratinozyten haften die meisten Keratinozyten bei 24 h. Isolierte epidermale primäre Keratinozyten erreichten am Tag 7 einen Zusam...

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Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin

Die Untersuchung der Wundheilung im Zusammenhang mit Muskel-Skelett-Verletzungen erfordert oft die Beurteilung von In-vitro-Interaktionen zwischen Schwann-Zellen (SCs), Keratinozyten und Fibroblasten. Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung, Kultivierung und Charakterisierung dieser Primärzellen aus der menschlichen Vorhaut.

Isolierung, Kultur und Charakterisierung von primären Schwann-Zellen, Keratinozyten und Fibroblasten aus der menschlichen Vorhaut

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid ...

Die Haut enthält mehrere Zelltypen, darunter Keratinozyten, Fibroblasten und Nervenschwann-Zellen. Dieses Protokoll ermöglicht die Isolierung jedes dieser Zelltypen für In-vitro-Experimente. Die Isolierung und Etablierung einzelner primärer Zellkulturen aus einem einzigen Spender ermöglicht robuste Vergleiche und Kokulturexperimente und mildert gleichzeitig die Auswirkungen genetischer Variationen.Mit diesem Protokoll ermöglicht die Analyse einzelner Zellen und ihrer Interaktionen die Analyse der Rolle von Schwann-Zellen in der Hauthomöostase und Pathophysiologie. Diese unterschiedlichen Zellpopulationen können verwendet werden, um Schwann-Zellen, Fibroblasten oder Keratinozyten entweder einzeln oder in Kombination in normaler Hautphysiologie, Wundheilung oder in hautkranken Zuständen zu untersuchen. Jagadeeshaprasad M G, ein Postdoktorand in meinem Labor, wird mich bei der Demonstration des Verfahrens unterstützen.Nachdem Sie die neonatale Vorhaut nach Standardbehandlungen erworben haben, legen Sie die ausgeschnittene Vorhaut in ein Mikrozentrifugenröhrchen, das acht bis 10 Milliliter eiskaltes DMEM-Basalmedium enthält, und transportieren Sie die Vorhaut sofort zur Zellkulturisolierung in das Zellkulturlabor. Spülen Sie die Vorhaut zweimal mit 20 bis 25 Millilitern Dulbecco's Phosphate Buffered Saline oder DPBS, enthalten Antibiotika und Antimykotikum. Dann tränken Sie die gewaschene Haut in 25 bis 30 Millilitern eiskaltem DMEM-Basalmedium in einer 10 Zentimeter großen Gewebekulturschale.Nach 15 Minuten die Vorhaut mit einem Skalpell aufschneiden, um die Dermis und das Unterhautfettgewebe freizulegen. Verwenden Sie eine Pinzette, eine Skalpellklinge und eine Schere, um das Unterhautfettgewebe zu entfernen und zu entsorgen. Anschließend die saubere Vorhaut in drei bis fünf kleinere Stücke schneiden und die Hautstücke in 16 bis 20 Milliliter Dispace one DMEM-Medium in einem sterilen konischen Schlauch inkubieren.Während der ersten 30 Minuten der Inkubation mit Dispace mischen Sie intermittierend die Hautstücke im konischen Schlauch durch Inversion. Legen Sie dann die konische Röhre für 16 bis 18 Stunden auf vier Grad Celsius. Am nächsten Tag entfernen Sie die Hautstücke und legen Sie sie auf eine trockene sterile Kulturschale und rollen Sie jedes Stück Haut aus, so dass die äußere Epidermisschicht die Kulturschale berührt.Beginnend am Rand des Gewebes schälen Sie die Epidermis mit zwei Pinzettensätzen von der Dermis weg. Fügen Sie die getrennten Epidermisfragmente zu fünf Millilitern HBS in einer 10 Zentimeter großen Kulturschale hinzu, um bei Raumtemperatur für 10 Minuten zu inkubieren. Dann sammeln Sie die HBS-Lösung in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie fünf Milliliter Trypsin-Neutralisationspuffer oder T und B in das konische Rohr hinzu.Stellen Sie die Röhre beiseite. Zu den epidermalen Fragmenten in der Kulturschale fügen Sie drei Milliliter Trypsinlösung hinzu, um bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten zu inkubieren. Nach der Inkubation die epidermalen Fragmente vorsichtig mit einer Pinzette aufrühren, bis die Trypsin-Keratinozytenlösung trüb wird.Als nächstes fügen Sie die Trypsin-Keratinozytenlösung zum HBS-T- und B-Röhrchen hinzu. Nachdem Sie unverdaute epidermale Fragmente mit Trypsin-EDTA-Lösung gelöst haben, fügen Sie zwei Milliliter FBS in das HBS-T- und B-Röhrchen mit Trypsin-EDTA-Lösung hinzu und zentrifugieren Sie die beiden etwa 870-mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Dann den Überstand absaugen und das Zellpellet in drei Milliliter Keratinozyten-Vollwachstumsmedium resuspendieren, gefolgt von der Filtration der Zellsuspension mit einem sterilen 100-Mikrometer-Filter in ein steriles 50-Milliliter-Konusröhrchen.Sobald die Zellzahl und die Zelllebensfähigkeit quantifiziert sind, säen Sie die Zellen in den Kulturplatten aus, um sie bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid in einen Inkubator zu legen. Nach zwei Tagen aspirieren Sie die nicht anhaftenden Zellen und aktualisieren Sie die Zellkulturmedien jeden zweiten Tag, bis die Keratinozyten einen Zusammenfluss von 50 bis 80% für das Passieren oder nachgeschaltete Experimente erreichen. T25-Flaschen mit Poly-L-Lysin oder PLL mit fünf Millilitern DPBS beschichten und die vorbeschichteten Kolben drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius platzieren.Später waschen Sie die PLL-Beschichtungsmatrix zweimal mit DPBS. Nachdem Sie die isolierten Stücke der Dermis mit fünf Millilitern DMEM-Basalmedium gewaschen haben, zerkleinern Sie die Dermis mit einer Schere in kleine Stücke. Verdauen Sie die gehackte Dermis mit fünf Millilitern Kollagenase bei 37 Grad Celsius für zweieinhalb Stunden, mit sanfter Titration mit einer Pipettenspitze alle 30 Minuten, bis sich die Dermis vollständig dissoziiert.Nach der Verdauung filtern Sie die Zellsuspension mit einem 70-Mikrometer-Zellsieb, gefolgt von einer Verdünnung der gefilterten Zellsuspension mit fünf Millilitern vollständigem DMEM-Medium, um die enzymatische Aktivität der Kollagenase zu stoppen. Als nächstes zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 870 mal G für fünf Minuten bei Raumtemperatur und suspendieren Sie den Zellstimmzettel in zwei Millilitern DMEM-Vollmedium, um die Zellen zu teilen. Nachdem Sie den Zentrifikationsprozess wie beschrieben wiederholt haben, aspirieren Sie den Überstand, um das Zellpellet zu verwenden, um die Schwann-Zellen oder Fibroblasten zu isolieren.Um die Schwan-Zellen zu isolieren, suspendieren Sie das Zellpellet in fünf Millilitern frischem DMEM-Vollmedium und quantifizieren Sie die Zellzahl und Lebensfähigkeit, bevor Sie fünf Milliliter der resuspendierten Zellen in vorcodierten T25-Kolben mit einer Dichte von 4,0 mal 10 zu den drei Zellen pro Milliliter aussäen. Inkubieren Sie den Kolben bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Nach 16 Stunden bestätigen Sie die Zelladhäsion durch Mikroskopie bei 10-facher Vergrößerung.Entfernen Sie dann die Nicht-Adhärenzzellen und waschen Sie den Kolben dreimal mit fünf Millilitern DPBS. Als nächstes inkubieren Sie die Zellen mit fünf Millilitern 10 mikromolaren Cytosin-Arabinosid in einem DMEM-Vollmedium. Nach 24 Stunden aspirieren Sie das Cytosin-Arabinosid-haltige Medium, bevor Sie den Kolben wie zuvor gezeigt spülen.Füllen Sie den Kulturkolben mit fünf Millilitern Schwann-Zellen komplettem Kulturmedium auf, um 48 Stunden zu inkubieren, während Sie das Medium jeden zweiten Tag erfrischen, bis die Schwann-Zellen eine Konfluenz von 80% erreichen. Um die Fibroblasten zu isolieren, resuspendieren Sie das gesammelte Pellet in fünf Milliliter Fibroblasten vollständiges Medium. Um die Zellen in nicht codierten T25-Kulturflaschen für 24 Stunden zu kultivieren, wie für die Schwann-Zellen demonstriert.Nach dem Absaugen der Nicht-Adhärenzzellen und dem Waschen des Kolbens inkubieren Sie die Zellen mit fünf Millilitern frischem Fibroblasten-Komplettmedium bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 48 Stunden. Da die isolierten Primärzellen in entsprechenden Zellkulturmedien kultiviert wurden, erreichten die primären Keratinozyten am siebten Tag eine Konfluenz von 85% und zeigten eine charakteristische Zellmorphologie mit einer Kopfsteinpflasterform. Die Schwann-Zellen erreichten am fünften Tag einen Zusammenfluss von 95% und schienen bipolar oder tripolar in der Form zu sein.Die Fibroblastenkulturen erreichten am vierten Tag einen Zusammenfluss von 95% und die meisten Zellen zeigten eine Spindelformmorphologie. Die Immunfluoreszenzfärbung bestätigte die zelltypspezifische Proteinexpression in den Zellkulturen. Die Keratinozyten waren positiv auf K10- und K14-Protein.Die zusammengeführten Bilder der Keratin-Immunfluoreszenz und der DAPI-Kernfärbung zeigten eine Reinheit der Zellkulturen von 97,8%. In ähnlicher Weise waren die Schwann-Zellen positiv für S100 und P75 NTR und hatten eine Reinheit von 95,2% in der Kultur. Die Fibroblasten exprimierten positiv Vimentin, exprimierten aber nicht alpha glatte Muskulatur Actin, einen Myofibroblastenmarker.Die Reinheit der Kultur betrug etwa 97,2%Um Shanses Beweise zu verbessern, kann eine vorbeschichtete Poly-L-Lysin-Schale verwendet werden. Und um die fibröse Kontamination weiter zu mildern, wurde Cytosin-Arabinosid und Antimykotikum hinzugefügt, nachdem Zellen für kurze Zeit hinzugefügt worden waren. Dies ist ein einfaches, kostengünstiges experimentelles Verfahren, um die drei Primärzellen, wie Schwannzellen, Keratinozyten und Fibroblasten, aus einer einzigen menschlichen Vorhaut zu gewinnen.Dieses Protokoll ist ideal für In-vitro-Experimente mit Zellzellkommunikation oder Übersprechen zwischen Zelltypen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

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Forschung

Neurowissenschaften

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Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

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Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

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Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

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Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

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Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

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Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

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Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Dorsal Root Ganglien Isolation und Primärkultur Neurotransmitter-Freisetzung zu studieren

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Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

Primäre Kultur der Neuronen isoliert von Embryonal Mouse Cerebellum

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