Name: isolation, culture, and characterization of primary schwann cells, keratinocytes, and fibroblasts from human foreskin
Uploaded: 2022-03-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin at JoVE.com

ברצוננו להודות לד"ר פאדיה כמאל ולד"ר ריאד אלברברי על שאפשרו לנו להשתמש במכשירי מעבדה ובתמיכה טכנית. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מה- NIH (K08 AR060164-01A) ו- DOD (W81XWH-16-1-0725) ל- J. C. E. בנוסף לתמיכה מוסדית מהמרכז הרפואי הרשי של אוניברסיטת פנסילבניה.

רכישה ושימוש ברקמת עורלה אנושית לא מזוהה למטרות מחקר נבדקה וקיבלה את הקביעה של "מחקר לא אנושי" על ידי מועצת הביקורת המוסדית של המכללה לרפואה של פן סטייט (IRB #17574).
הערה: על ידי ביצוע הפרוטוקול שלהלן, 2.4 x 106 קרטינוציטים, 4.4 x 106 פיברובלסטים ו 1.1 x 106 SCs מתקבלים מעורלה...

<ol>
	<li>Hawksworth, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+disadvantages+of+using+human+cells+for+pharmacological+and+toxicological+studies.">Advantages and disadvantages of using human cells for pharmacological and toxicological studies.</a> Human &amp; Experimental Toxicology. 13 (8), 568-573 (1994).</li><li>Green, H., Kehinde, O., Thomas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+cultured+human+epidermal+cells+into+multiple+epithelia+suitable+for+grafting.">Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (11), 5665-5668 (1979).</li><li>Fuchs, E., Green, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+keratin+gene+expression+during+terminal+differentiation+of+the+keratinocyte.">Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocyte.</a> Cell. 19 (4), 1033-1042 (1980).</li><li>Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+cultivation+of+human+keratinocytes+from+skin+or+plucked+hair+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells.">Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).</li><li>Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+primary+adult+fibroblast+cultures+from+rodents.">Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2033 (2010).</li><li>Belviso, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+adult+human+dermal+fibroblasts+from+abdominal+skin+and+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+using+a+non-integrating+method.">Isolation of adult human dermal fibroblasts from abdominal skin and generation of induced pluripotent stem cells using a non-integrating method.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60629 (2020).</li><li>Silva, W. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Schwann+cells+in+cutaneous+wound+healing.">Role of Schwann cells in cutaneous wound healing.</a> Wound Repair and Regeneration. 26 (5), 392-397 (2018).</li><li>Bray, E. R., Cheret, J., Yosipovitch, G., Paus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cells+as+underestimated,+major+players+in+human+skin+physiology+and+pathology.">Schwann cells as underestimated, major players in human skin physiology and pathology.</a> Experimental Dermatology. 29 (1), 93-101 (2020).</li><li>Laverdet, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+innervation:+important+roles+during+normal+and+pathological+cutaneous+repair.">Skin innervation: important roles during normal and pathological cutaneous repair.</a> Histology and Histopathology. 30 (8), 875-892 (2015).</li><li>Jessen, K. R., Mirsky, R., Lloyd, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cells:+Development+and+role+in+nerve+repair.">Schwann cells: Development and role in nerve repair.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (7), 020487 (2015).</li><li>Bentley, C. A., Lee, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p75+is+important+for+axon+growth+and+Schwann+cell+migration+during+development.">p75 is important for axon growth and Schwann cell migration during development.</a> The Journal of Neuroscience. 20 (20), 7706-7715 (2000).</li><li>Rutkowski, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signals+for+proinflammatory+cytokine+secretion+by+human+Schwann+cells.">Signals for proinflammatory cytokine secretion by human Schwann cells.</a> Journal of Neuroimmunology. 101 (1), 47-60 (1999).</li><li>Kumar, A., Brockes, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+dependence+in+tissue,+organ,+and+appendage+regeneration.">Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration.</a> Trends in Neurosciences. 35 (11), 691-699 (2012).</li><li>Balakrishnan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+role+and+potential+of+Schwann+cells+for+peripheral+nerve+repair+from+studies+of+development+and+injury.">Insights into the role and potential of Schwann cells for peripheral nerve repair from studies of development and injury.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 608442 (2020).</li><li>Gresset, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boundary+caps+give+rise+to+neurogenic+stem+cells+and+terminal+glia+in+the+skin.">Boundary caps give rise to neurogenic stem cells and terminal glia in the skin.</a> Stem Cell Reports. 5 (2), 278-290 (2015).</li><li>Stratton, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+Schwann+cells+from+adult+human+skin+and+nerve.">Purification and characterization of Schwann cells from adult human skin and nerve.</a> eNeuro. 4 (3), (2017).</li></ol>

פרוטוקול זה מתאר שיטה לבודד שלוש אוכלוסיות תאים נפרדות מחתיכה אחת של העורלה, כלומר קרטינוציטים, פיברובלסטים ותאי שוואן. ישנם מספר פרוטוקולי בידוד זמינים לבידוד קרטינוציטים ופיברובלסטים 2,3,5,6, אך אף אחד מהם אינו מתאר בידוד SC.<sup class="xr...

תאים ראשוניים שמקורם ברקמות חיות ובתרבית בתנאי מבחנה דומים מאוד למצב הפיזיולוגי1, מה שהופך אותם למודל אידיאלי לחקר תהליכים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים. העור מכיל סוגי תאים מרובים, כולל קרטינוציטים, פיברובלסטים, סבוציטים, מלנוציטים ותאי שוואן (SCs), אותם ניתן לבודד ולתרבת אותם לניסויים במבחנה . שיטות לבידוד ותרבית קרטינוציטים, פיברובלסטים ו-SCs, מפיסת עור אחת, לא תוארו. מטרתו של פרוטוקול זה היא כפולה: 1) לבסס שיטה אמינה וניתנת לשחזור לבידוד וגידול של מעגלים עוריים ו-2) להשתמש בשיטה יעילה וחזקה לבידוד של קרטינוציטים, פיברובלסטים ו-SCs מעורלה אנושית אחת.
כיום, ישנם פרוטוקולים מבוססים לבידוד קרטינוציטים בעור 2,3,4 ופיברובלסטים 5,6. מחקרים אלה מתארים את הבידוד של קרטינוציטים, פיברובלסטים או שניהם מהעור, אך אין פרוטוקול המתייחס לאופן שבו ניתן ליצור תרביות של SCs ראשוניים מעור האדם. מחקרים אחרונים מצביעים על כך ש-SCs עצביים מווסתים תהליכים תאיים של קרטינוציטים ופיברובלסטים ומווסתים תפקודים פיזיולוגיים תקינים בעור7. לפיכך, SCs הם קריטיים להומאוסטזיס של העור ותורמים באופן משמעותי לפיזיולוגיה של הוויסות המשפיעה על התנהגותם של סוגי תאי עור שכנים הנמצאים8. לכן, פרוטוקול המאפשר בידוד של כל אחד מסוגי התאים הללו הוא אידיאלי לניסויים במבחנה הכוללים תקשורת בין תאים לתאים או לשיחה צולבת בין סוגי תאים.
פרוטוקול זה מתאר את הקמתן של תרביות תאים בודדות של תאים ראשוניים מפיסת עור אחת. פרוטוקול זה שימושי במיוחד כאשר כמות הרקמה הזמינה מוגבלת. יתר על כן, בידוד של כל שלושת סוגי התאים מתורם יחיד מאפשר השוואות חזקות בין סוגי תאים או ניסויים בתרבית משותפת תוך הפחתת השפעת הגנטיקה במהלך הניסוי הרצוי.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;M sterile filters (Millex-GP Syringe Filter Unit,polyethersulfone)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SLGPR33RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;M cell strainers</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;M cell strainers</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL disposable syringes</td>
			<td>BD Luer-Lok</td>
			<td>BD-309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL disposable syringes (Syringe sterile, single use)</td>
			<td>BD Luer-Lok</td>
			<td>BD309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL disposable syringes</td>
			<td>BD Luer-Lok</td>
			<td>BD305462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% TritonX-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-1L</td>
			<td>Prepared at the time of use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>J19943.K2</td>
			<td>Ready to use and store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td>Prepared at the time of use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemometec Vial1-Cassette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1420193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17018-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12544D 22*50-1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D46693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM basal medium</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>9221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline free from Ca2+ and Mg2+ (DPBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;21-031-CV)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL micro-centrifuge tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-681-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast complete medium</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>2331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11032</td>
			<td>Dilution (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>Dilution (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Buffered Saline Solution (HBSS buffer)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human foreskin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>De-identified human foreskin tissue for research purposes (Institutional Review Board- IRB #17574).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KGM-GOLD keratinocyte medium (KGM gold and supplements)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>00192151 and 00192152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse alpha-smooth muscle actin antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-9760-82</td>
			<td>Dilution (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Cytokeratin14 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7800</td>
			<td>Dilution (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse S100 antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MA5-12969</td>
			<td>Dilution (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi chambered (4 well glass slide)</td>
			<td>Tab-Tek</td>
			<td>154526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoCounter -Via1-Cassette</td>
			<td>Chemometec</td>
			<td>941-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysisne (PLL)</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>32503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Anti-fade Mountant with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit K10 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB4501656</td>
			<td>Dilution (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit p75-NTR antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB1554</td>
			<td>Dilution (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit vimentin</td>
			<td>ProteinTech</td>
			<td>10366-1-AP</td>
			<td>Dilution (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schwann cell culture medium</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>1701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision tweezers DUMONT straight with extra fine tips Dumostar, 5</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>LH75.1</td>
			<td>Sterilize with 70% alcohol before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS Scissors, sharp/sharp. Length 4&#8211;3/8&#34;(111mm)</td>
			<td>Codman</td>
			<td>54-6500</td>
			<td>Sterilize with 70% alcohol before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized surgical - sharp blade (Duro Edge Economy Single Edge Blades)</td>
			<td>Razor blade company</td>
			<td>94-0120</td>
			<td>Sterilize with 70% alcohol before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin neutralization buffer (TNS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Axio Observer 7- Axiocam 506 mono &#8211; Apotome.2 microscope</td>
			<td>For immunofluorescence of chamber slide containing stained cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Primovert</td>
			<td>For visulaizing/observing cell attachment or detachment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and characterization of primary schwann cells, keratinocytes, and fibroblasts from human foreskin

פרוטוקול זה מתאר שיטות בידוד, תנאי גידול ואפיון של תאים ראשוניים אנושיים בעלי תפוקה גבוהה וכדאיות באמצעות דיסוציאציה אנזימטית מהירה של העור. קרטינוציטים ראשוניים, פיברובלסטים ותאי שוואן נקטפים כולם מעורלת היילוד האנושית, הזמינה בהתאם להליכי הטיפול הסטנדרטיים. העור שהוסר מחוטא, והשומן והשרירים התת עוריים מוסרים באמצעות אזמל. השיטה מורכבת מהפרדה אנזימטית ומכנית של שכבות אפידרמיס ודרמליות, ואחריה עיכול אנזימטי נוסף לקבלת תרחיפים חד-תאיים מכל אחת משכבות העור הללו. לבסוף, תאים בודדים גדלים במדיה מתאימה של תרביות תאים בהתאם לפרוטוקולים סטנדרטיים של תרביות תאים כדי לשמור על גדילה וכדאיות במשך שבועות. יחד, פרוטוקול פשוט זה מאפשר בידוד, התרבות ואפיון של כל שלושת סוגי התאים מפיסת עור אחת לצורך הערכה חוץ גופית של מודלים של עור-עצבים. בנוסף, ניתן להשתמש בתאים אלה יחד בתרביות משותפות כדי לאמוד את השפעתם זה על זה ואת תגובותיהם לטראומה במבחנה בצורה של שריטות המבוצעות באופן רובוטי בתרבית הקשורה לריפוי פצעים.

עורלה יילודית תקינה שימשה לבידוד של קרטינוציטים אפידרמליים ראשוניים ו-SCs עוריים ופיברובלסטים. התאים הראשוניים המבודדים עברו תרבית במדיה המתאימה של תרביות תאים שהכילו גורמי גדילה. לאחר זריעה של SCs ופיברובלסט בצלוחיות תרבית, רוב התאים דבקו בתחתית הבקבוקון תוך 2 שעות. במקרה של קרטינוציטים, ר...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin at JoVE.com

Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin

המחקר של ריפוי פצעים הקשורים לפגיעה בשרירים-שלד דורש לעתים קרובות הערכה של אינטראקציות במבחנה בין תאי שוואן (SCs), קרטינוציטים ופיברובלסטים. פרוטוקול זה מתאר את הבידוד, התרבות והאפיון של תאים ראשוניים אלה מהעורלה האנושית.

בידוד, תרבית ואפיון של תאי שוואן ראשוניים, קרטינוציטים ופיברובלסטים מעורלה אנושית

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid ...

העור מכיל סוגי תאים מרובים כולל, קרטינוציטים, פיברובלסטים ותאי שוואן עצביים. פרוטוקול זה מאפשר בידוד של כל אחד מסוגי התאים הללו לניסויים במבחנה. בידוד והקמת תרביות תאים ראשוניות בודדות מתורם יחיד מאפשרת השוואות חזקות וניסויים בתרבית משותפת, תוך צמצום ההשפעות של שונות גנטית.עם פרוטוקול זה, ניתוח של תאים בודדים ואת האינטראקציות שלהם מאפשר את הניתוח של התפקיד של תאי שוואן בהומאוסטזיס של העור ובפתופיזיולוגיה. אוכלוסיות תאים מובחנות אלה יכולות לשמש לחקר תאי שוואן, פיברובלסטים או קרטינוציטים בנפרד או בשילוב בפיזיולוגיה של העור, ריפוי פצעים או במצבים של מחלות עור. Jagadeeshaprasad M G, פוסט-דוקטורנט במעבדה שלי יסייע לי להדגים את ההליך.לאחר רכישת העורלה היילודית בעקבות נהלי הטיפול הסטנדרטיים, מניחים את העורלה הנכריתה בצינור מיקרו צנטריפוגה המכיל שמונה עד 10 מיליליטרים של מדיום בסיסי DMEM קר כקרח, ומעבירים מיד את העורלה למעבדת תרביות התאים לבידוד תאים. יש לשטוף את העורלה פעמיים עם 20 עד 25 מיליליטרים של Dulbecco's Phosphate Buffered Saline או DPBS, המכילים אנטיביוטיקה ואנטי-מיקוטית. לאחר מכן השרו את העור השטופ ב-25 עד 30 מיליליטרים של מדיום בסיסי DMEM קר כקרח בצלחת תרבית רקמה של 10 ס"מ.לאחר 15 דקות פורסים את העורלה הפתוחה באמצעות אזמל כדי לחשוף את הדרמיס ואת רקמת השומן התת עורית. השתמש במלקחיים, להב אזמל ומספריים כדי להסיר ולהשליך את רקמת השומן התת עורית. לאחר מכן חותכים את העורלה הנקייה לשלוש עד חמש חתיכות קטנות יותר ומדגרים את חתיכות העור ב-16 עד 20 מיליליטרים של דיספייס מדיום DMEM אחד בצינור חרוטי סטרילי.במהלך 30 הדקות הראשונות של הדגירה עם Dispace מערבבים לסירוגין את פיסות העור בצינור החרוטי על ידי היפוך. לאחר מכן מניחים את הצינור החרוטי בארבע מעלות צלזיוס למשך 16 עד 18 שעות. למחרת מסירים את פיסות העור ומניחים אותן על צלחת תרבית סטרילית יבשה ופותחים כל פיסת עור כך ששכבת האפידרמיס החיצונית נוגעת בצלחת התרבית.החל מקצה הרקמה מקלפים את האפידרמיס מהדרמיס באמצעות שתי קבוצות של מלקחיים. הוסיפו את שברי האפידרמיס המופרדים לחמישה מיליליטרים של HBS בצלחת תרבית של 10 ס"מ כדי לדגור בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. לאחר מכן לאסוף את תמיסת HBS בצינור חרוטי 50 מיליליטר ולהוסיף חמישה מיליליטרים של חיץ נטרול טריפסין או T ו- B בצינור החרוטי.הניחו את הצינור בצד. לקטעי האפידרמיס בצלחת התרבית מוסיפים שלושה מיליליטרים של תמיסת טריפסין כדי לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר הדגירה מתסיסים בעדינות את שברי האפידרמיס עם מלקחיים עד שתמיסת הטריפסין קרטינוציטים הופכת עכורה.לאחר מכן הוסף את תמיסת הקרטינוציטים של טריפסין לצינור HBS T ו- B. לאחר המסת שברי אפידרמיסה לא מעוכלים עם תמיסת טריפסין EDTA, הוסיפו שני מיליליטרים של FBS לצינור HBS T ו-B המכיל תמיסת טריפסין EDTA, וצנטריפוגה של השניים בערך 870 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן שאפו את הסופרנטנט והחזירו את כדור התא בשלושה מיליליטרים של מדיום גדילה מלא של קרטינוציטים, ולאחר מכן סינון של תרחיף התא עם מסנן סטרילי של 100 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי סטרילי של 50 מיליליטר.לאחר כימות מספר התאים וכדאיות התאים, זרעו את התאים בלוחות התרבית כדי להניחם באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו-חמצני. לאחר יומיים שואפים לתאים שאינם דבקים, ומרעננים את המדיה של תרביות התאים מדי יום ביומיים עד שהקרטינוציטים מגיעים ל-50%-80% מפגש לניסויים חולפים או במורד הזרם. צלוחיות T25 Precoat עם פולי-l-ליזין או PLL, תוך שימוש בחמישה מיליליטרים של DPBS ומניחות את הצלוחיות המוכנות מראש בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות.מאוחר יותר לשטוף את מטריצת ציפוי PLL פעמיים עם DPBS. לאחר שטיפת החלקים המבודדים של הדרמיס עם חמישה מיליליטרים של מדיום בסיסי DMEM, טחנו את הדרמיס לחתיכות קטנות עם מספריים. מעכלים את הדרמיס הטחון עם חמישה מיליליטרים של קולגן ב-37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים וחצי, עם טיטרציה עדינה באמצעות קצה פיפטה כל 30 דקות עד שהדרמיס מתנתק לחלוטין.לאחר העיכול, מסננים את תרחיף התא עם מסננת תאים של 70 מיקרומטר, ולאחר מכן דילול של תרחיף התא המסונן עם חמישה מיליליטרים של מדיום DMEM שלם כדי לעצור את הפעילות האנזימטית של קולגןאז. לאחר מכן צנטריפוגה את ההשעיה של התא ב-870 פעמים G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר והחזרת פתק ההצבעה של התא בשני מיליליטרים של מדיום מלא של DMEM כדי לחלק את התאים. לאחר חזרה על תהליך הצנטרפיקציה כמתואר, שאפו לסופרנטנט להשתמש בכדור התא כדי לבודד את תאי שוואן או את הפיברובלסטים.כדי לבודד את תאי שוואן, יש לבצע החייאה של כדורי התא בחמישה מיליליטרים של מדיום DMEM מלא טרי ולכמת את מספר התא ואת יכולת הקיום לפני זריעת חמישה מיליליטרים של התאים המוחזרים בצלוחיות T25 מקודדות מראש בצפיפות של פי 4.0 10 לשלושת התאים למיליליטר. הדגירה של הבקבוקון בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני. לאחר 16 שעות לאשר הידבקות תאים על ידי מיקרוסקופיה בהגדלה של פי 10.לאחר מכן הסר את התאים שאינם דבקים ושטוף את הבקבוקון שלוש פעמים עם חמישה מיליליטרים של DPBS. לאחר מכן הדגירה של התאים עם חמישה מיליליטרים של 10 מיקרומולר ציטוזין ארבינוזיד במדיום שלם של DMEM. לאחר 24 שעות לשאוף את הציטוזין ארבינוזיד המכיל מדיום לפני שטיפת הבקבוקון כפי שהוכח קודם לכן.מלאו מחדש את בקבוק התרבית בחמישה מיליליטרים של תאי שוואן שלמים את מדיום התרבית כדי לדגור 48 שעות, תוך רענון המדיום כל יומיים עד שתאי שוואן מגיעים ל-80% מפגש. כדי לבודד את הפיברובלסטים, יש להחיות את הכדור שנאסף בחמישה מיליליטרים של פיברובלסטים במדיום שלם. כדי לתרבת את התאים בבקבוקי תרבית T25 שאינם מקודדים במשך 24 שעות כפי שהודגם עבור תאי שוואן.לאחר שאיפת התאים שאינם דבקים ושטיפת הבקבוקון, דגירו את התאים עם חמישה מיליליטרים של פיברובלסטים טריים בעלי מדיום מלא ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני במשך 48 שעות. מכיוון שהתאים הראשוניים המבודדים עברו תרבית במדיה המתאימה לתרבית תאים, הקרטינוציטים הראשוניים הגיעו ל-85% מפגש ביום השביעי והפגינו מורפולוגיה אופיינית של תאים עם צורת אבן מרוצפת. תאי שוואן הגיעו ל-95% מפגש ביום החמישי ונראו דו קוטביים או בצורת טריפולאר.תרביות הפיברובלסטים הגיעו למפגש של 95% ביום הרביעי ורוב התאים הציגו מורפולוגיה של צורת ציר. הכתם האימונופלואורסצנטי אישר את ביטוי החלבון הספציפי של סוג התא בתרביות התאים. הקרטינוציטים היו חיוביים לחלבון K10 ו-K14.התמונות הממוזגות של אימונופלואורסצנציה של קרטין וכתמים גרעיניים של DAPI הצביעו על טוהר של 97.8% מתרביות התאים. באופן דומה, תאי שוואן היו חיוביים ל-S100 ול-P75 NTR והיה להם טוהר של 95.2% בתרבית. הפיברובלסטים ביטאו באופן חיובי את הווימנטין, אך לא ביטאו את השריר החלק אלפא אקטין, סמן מיופיברובלסט.טוהר התרבית היה סביב 97.2% כדי להעצים את הראיות של שאנסה, ניתן להשתמש במנה פולי-ל-ליזין מצופה מראש. וכדי למתן עוד יותר את הזיהום הסיבי, נוספו ציטוזין ארבינוזיד וחומר אנטי-מיקוטי לאחר שהתאים הוסיפו לזמן קצר. זהו הליך ניסיוני פשוט וזול כדי לבסס את שלושת התאים העיקריים, כגון תאי שוואן, קרטינוציטים ופיברובלסטים, מעור קדמי אנושי יחיד.פרוטוקול זה אידיאלי לניסויים במבחנה הכוללים תקשורת תאית או הצלבה בין סוגי תאים.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

בידוד ותרבות של תאי גזע עצביים קרסט מזקיקי שיער אנושיים

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

Isolation and Culture of Human Fungiform Taste Papillae Cells

בידוד והתרבות של האדם בחוש הטעם תאים Fungiform גבשושיות

Taste cells are highly specialized, with unique histological, molecular and physiological characteristics that permit detection of a wide range of simple ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

בידוד והתרבות של תאים עצביים לפסגה מהצינור עובריים עצבית Murine

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

בידוד והתרבות של תאי האנדותל מהמוח הקדמי עוברי

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

בידוד, תרבות והטווח ארוך תחזוקה של יסודיים mesencephalic דופאמין נוירונים ממוח עוברי מכרסם

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

בידוד והתרבות של תאי גזע בוגרים עצביים מאזור העכבר Subcallosal

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

דור פשוטה של תרבות תשואה גבוהה של נוירונים המושרה מ Fibroblasts עור מבוגר

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

אפיון ובידוד של העכבר מיקרוגלייה העיקרי על ידי צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

בידוד גרעיני הבסיס העזוב והתרבות העיקריים ללמוד שחרור נוירוטרנסמיטר

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

התרבות הראשית של הנוירונים מבודדים מתוך עכבר ממוח עובריים

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...