Name: isolation, culture, and characterization of primary schwann cells, keratinocytes, and fibroblasts from human foreskin
Uploaded: 2022-03-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin at JoVE.com

Vorremmo ringraziare la Dott.ssa Fadia Kamal e la Dott.ssa Reyad Elbarbary per averci permesso di utilizzare strumenti di laboratorio e supporto tecnico. Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni del NIH (K08 AR060164-01A) e DOD (W81XWH-16-1-0725) a J. C. E. oltre al supporto istituzionale della Pennsylvania State University Hershey Medical Center.

L'acquisizione e l'uso di tessuto del prepuzio umano de-identificato a fini di ricerca è stato esaminato e ha ricevuto la determinazione di "ricerca non umana" dal Penn State College of Medicine Institutional Review Board (IRB # 17574).
NOTA: Seguendo il protocollo riportato di seguito, 2,4 x 106 cheratinociti, 4,4 x 106 fibroblasti e 1,1 x 106 SC sono ottenuti da un singolo prepuzio. In generale, queste cellule primarie possono essere utilizzate per 3 passagg...

<ol>
	<li>Hawksworth, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+disadvantages+of+using+human+cells+for+pharmacological+and+toxicological+studies.">Advantages and disadvantages of using human cells for pharmacological and toxicological studies.</a> Human &amp; Experimental Toxicology. 13 (8), 568-573 (1994).</li><li>Green, H., Kehinde, O., Thomas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+cultured+human+epidermal+cells+into+multiple+epithelia+suitable+for+grafting.">Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (11), 5665-5668 (1979).</li><li>Fuchs, E., Green, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+keratin+gene+expression+during+terminal+differentiation+of+the+keratinocyte.">Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocyte.</a> Cell. 19 (4), 1033-1042 (1980).</li><li>Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+cultivation+of+human+keratinocytes+from+skin+or+plucked+hair+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells.">Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).</li><li>Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+primary+adult+fibroblast+cultures+from+rodents.">Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2033 (2010).</li><li>Belviso, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+adult+human+dermal+fibroblasts+from+abdominal+skin+and+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+using+a+non-integrating+method.">Isolation of adult human dermal fibroblasts from abdominal skin and generation of induced pluripotent stem cells using a non-integrating method.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60629 (2020).</li><li>Silva, W. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Schwann+cells+in+cutaneous+wound+healing.">Role of Schwann cells in cutaneous wound healing.</a> Wound Repair and Regeneration. 26 (5), 392-397 (2018).</li><li>Bray, E. R., Cheret, J., Yosipovitch, G., Paus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cells+as+underestimated,+major+players+in+human+skin+physiology+and+pathology.">Schwann cells as underestimated, major players in human skin physiology and pathology.</a> Experimental Dermatology. 29 (1), 93-101 (2020).</li><li>Laverdet, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+innervation:+important+roles+during+normal+and+pathological+cutaneous+repair.">Skin innervation: important roles during normal and pathological cutaneous repair.</a> Histology and Histopathology. 30 (8), 875-892 (2015).</li><li>Jessen, K. R., Mirsky, R., Lloyd, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cells:+Development+and+role+in+nerve+repair.">Schwann cells: Development and role in nerve repair.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (7), 020487 (2015).</li><li>Bentley, C. A., Lee, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p75+is+important+for+axon+growth+and+Schwann+cell+migration+during+development.">p75 is important for axon growth and Schwann cell migration during development.</a> The Journal of Neuroscience. 20 (20), 7706-7715 (2000).</li><li>Rutkowski, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signals+for+proinflammatory+cytokine+secretion+by+human+Schwann+cells.">Signals for proinflammatory cytokine secretion by human Schwann cells.</a> Journal of Neuroimmunology. 101 (1), 47-60 (1999).</li><li>Kumar, A., Brockes, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+dependence+in+tissue,+organ,+and+appendage+regeneration.">Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration.</a> Trends in Neurosciences. 35 (11), 691-699 (2012).</li><li>Balakrishnan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+role+and+potential+of+Schwann+cells+for+peripheral+nerve+repair+from+studies+of+development+and+injury.">Insights into the role and potential of Schwann cells for peripheral nerve repair from studies of development and injury.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 608442 (2020).</li><li>Gresset, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boundary+caps+give+rise+to+neurogenic+stem+cells+and+terminal+glia+in+the+skin.">Boundary caps give rise to neurogenic stem cells and terminal glia in the skin.</a> Stem Cell Reports. 5 (2), 278-290 (2015).</li><li>Stratton, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+Schwann+cells+from+adult+human+skin+and+nerve.">Purification and characterization of Schwann cells from adult human skin and nerve.</a> eNeuro. 4 (3), (2017).</li></ol>

Questo protocollo descrive un metodo per isolare tre distinte popolazioni cellulari da un singolo pezzo del prepuzio, vale a dire cheratinociti, fibroblasti e cellule di Schwann. Sono disponibili alcuni protocolli di isolamento per isolare cheratinociti e fibroblasti 2,3,5,6, ma nessuno descrive l'isolamento SC. Oltre alle cellule strutturali chiave della pelle, dei cheratinociti e dei fibrobla...

Le cellule primarie derivate da tessuto vivente e coltivate in condizioni in vitro assomigliano molto allo stato fisiologico1, rendendole un modello ideale per indagare i processi fisiologici e fisiopatologici. La pelle contiene più tipi di cellule, tra cui cheratinociti, fibroblasti, sebociti, melanociti e cellule di Schwann (SC), che possono essere isolate e coltivate per esperimenti in vitro . Non sono stati descritti metodi per isolare e coltivare cheratinociti, fibroblasti e SC, da un singolo pezzo di pelle. L'obiettivo di questo protocollo è duplice: 1) stabilire un metodo affidabile e riproducibile per l'isolamento e la coltura di SC dermiche e 2) utilizzare un metodo efficiente e robusto per l'isolamento di cheratinociti, fibroblasti e SC da un singolo prepuzio umano.
Attualmente esistono protocolli consolidati per isolare i cheratinociti cutanei 2,3,4 e i fibroblasti 5,6. Questi studi descrivono l'isolamento di cheratinociti, fibroblasti o entrambi dalla pelle, ma nessun protocollo affronta come stabilire colture di SC primarie dalla pelle umana. Studi recenti suggeriscono che le SC neuronali modulano i processi cellulari dei cheratinociti e dei fibroblasti e regolano le normali funzioni fisiologiche della pelle7. Le SC sono quindi fondamentali per l'omeostasi cutanea e contribuiscono in modo sostanziale alla fisiologia regolata che influenza il comportamento dei tipi di cellule cutanee vicinepresenti 8. Pertanto, un protocollo che consente l'isolamento di ciascuno di questi tipi di cellule è ideale per esperimenti in vitro che coinvolgono la comunicazione cellula-cellula o cross-talk tra tipi di cellule.
Questo protocollo descrive la creazione di singole colture cellulari di cellule primarie da un singolo pezzo di pelle. Questo protocollo è particolarmente utile quando la quantità di tessuto disponibile è limitata. Inoltre, l'isolamento di tutti e tre i tipi di cellule da un singolo donatore consente solidi confronti tra tipi di cellule o esperimenti di co-coltura, mitigando al contempo l'influenza della genetica durante l'esperimento desiderato.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;M sterile filters (Millex-GP Syringe Filter Unit,polyethersulfone)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SLGPR33RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;M cell strainers</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;M cell strainers</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL disposable syringes</td>
			<td>BD Luer-Lok</td>
			<td>BD-309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL disposable syringes (Syringe sterile, single use)</td>
			<td>BD Luer-Lok</td>
			<td>BD309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL disposable syringes</td>
			<td>BD Luer-Lok</td>
			<td>BD305462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% TritonX-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-1L</td>
			<td>Prepared at the time of use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>J19943.K2</td>
			<td>Ready to use and store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td>Prepared at the time of use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemometec Vial1-Cassette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1420193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17018-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12544D 22*50-1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D46693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM basal medium</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>9221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline free from Ca2+ and Mg2+ (DPBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;21-031-CV)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL micro-centrifuge tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-681-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast complete medium</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>2331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11032</td>
			<td>Dilution (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>Dilution (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Buffered Saline Solution (HBSS buffer)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human foreskin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>De-identified human foreskin tissue for research purposes (Institutional Review Board- IRB #17574).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KGM-GOLD keratinocyte medium (KGM gold and supplements)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>00192151 and 00192152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse alpha-smooth muscle actin antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-9760-82</td>
			<td>Dilution (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Cytokeratin14 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7800</td>
			<td>Dilution (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse S100 antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MA5-12969</td>
			<td>Dilution (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi chambered (4 well glass slide)</td>
			<td>Tab-Tek</td>
			<td>154526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoCounter -Via1-Cassette</td>
			<td>Chemometec</td>
			<td>941-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysisne (PLL)</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>32503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Anti-fade Mountant with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit K10 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB4501656</td>
			<td>Dilution (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit p75-NTR antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB1554</td>
			<td>Dilution (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit vimentin</td>
			<td>ProteinTech</td>
			<td>10366-1-AP</td>
			<td>Dilution (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schwann cell culture medium</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>1701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision tweezers DUMONT straight with extra fine tips Dumostar, 5</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>LH75.1</td>
			<td>Sterilize with 70% alcohol before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS Scissors, sharp/sharp. Length 4&#8211;3/8&#34;(111mm)</td>
			<td>Codman</td>
			<td>54-6500</td>
			<td>Sterilize with 70% alcohol before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized surgical - sharp blade (Duro Edge Economy Single Edge Blades)</td>
			<td>Razor blade company</td>
			<td>94-0120</td>
			<td>Sterilize with 70% alcohol before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin neutralization buffer (TNS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Axio Observer 7- Axiocam 506 mono &#8211; Apotome.2 microscope</td>
			<td>For immunofluorescence of chamber slide containing stained cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Primovert</td>
			<td>For visulaizing/observing cell attachment or detachment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and characterization of primary schwann cells, keratinocytes, and fibroblasts from human foreskin

Questo protocollo descrive i metodi di isolamento, le condizioni di coltura e la caratterizzazione delle cellule primarie umane con alta resa e vitalità utilizzando una rapida dissociazione enzimatica della pelle. I cheratinociti primari, i fibroblasti e le cellule di Schwann sono tutti raccolti dal prepuzio neonato umano, che è disponibile seguendo le procedure standard di cura. La pelle rimossa viene disinfettata e il grasso sottocutaneo e il muscolo vengono rimossi usando un bisturi. Il metodo consiste nella separazione enzimatica e meccanica degli strati epidermico e dermico, seguita da un'ulteriore digestione enzimatica per ottenere sospensioni unicellulari da ciascuno di questi strati cutanei. Infine, le singole cellule vengono coltivate in terreni di coltura cellulare appropriati seguendo protocolli di coltura cellulare standard per mantenere la crescita e la vitalità per settimane. Insieme, questo semplice protocollo consente l'isolamento, la coltivazione e la caratterizzazione di tutti e tre i tipi di cellule da un singolo pezzo di pelle per la valutazione in vitro di modelli pelle-nervo. Inoltre, queste cellule possono essere utilizzate insieme in co-colture per valutare i loro effetti l'una sull'altra e le loro risposte al trauma in vitro sotto forma di graffi eseguiti roboticamente nella coltura associata alla guarigione delle ferite.

Il prepuzio neonatale normale è stato utilizzato per l'isolamento dei cheratinociti epidermici primari e delle SC e dei fibroblasti dermici. Le cellule primarie isolate sono state coltivate in rispettivi terreni di coltura cellulare contenenti fattori di crescita. Dopo la semina di SC e fibroblasti in palloni di coltura, la maggior parte delle cellule ha aderito al fondo del pallone entro 2 ore. Nel caso dei cheratinociti, la maggior parte dei cheratinociti ha aderito entro 24 ore. I cheratinociti primari epidermici iso...

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Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin

Lo studio della guarigione delle ferite associata a lesioni muscoloscheletriche richiede spesso la valutazione delle interazioni in vitro tra cellule di Schwann (SC), cheratinociti e fibroblasti. Questo protocollo descrive l'isolamento, la coltura e la caratterizzazione di queste cellule primarie dal prepuzio umano.

Isolamento, coltura e caratterizzazione di cellule primarie di Schwann, cheratinociti e fibroblasti dal prepuzio umano

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid ...

La pelle contiene più tipi di cellule tra cui cheratinociti, fibroblasti e cellule nervose di Schwann. Questo protocollo consente l'isolamento di ciascuno di questi tipi di cellule per esperimenti in vitro. L'isolamento e la creazione di singole colture cellulari primarie da un singolo donatore consente solidi confronti ed esperimenti di co-coltura, mitigando al contempo gli effetti della variazione genetica.Con questo protocollo, l'analisi delle singole cellule e delle loro interazioni consente l'analisi del ruolo delle cellule di Schwann nell'omeostasi cutanea e nella fisiopatologia. Queste distinte popolazioni cellulari possono essere utilizzate per studiare le cellule di Schwann, i fibroblasti o i cheratinociti singolarmente o in combinazione nella normale fisiologia della pelle, nella guarigione delle ferite o negli stati patologici della pelle. Jagadeeshaprasad M G, uno studioso post-dottorato nel mio laboratorio, mi assisterà nella dimostrazione della procedura.Dopo aver acquisito il prepuzio neonatale seguendo procedure standard di cura, posizionare il prepuzio asportato in un tubo di micro centrifuga contenente da otto a 10 millilitri di mezzo basale DMEM ghiacciato e trasportare immediatamente il prepuzio al laboratorio di coltura cellulare per l'isolamento cellulare. Risciacquare il prepuzio due volte con 20-25 millilitri di Dulbecco Fosfato Tamponato Soluzione Salina o DPBS, contenente antibiotici e antimicotici. Quindi immergere la pelle lavata in 25-30 millilitri di mezzo basale DMEM ghiacciato in un piatto di coltura tissutale di 10 centimetri.Dopo 15 minuti affettare il prepuzio aperto usando un bisturi per esporre il derma e il tessuto adiposo sottocutaneo. Utilizzare pinze, una lama di bisturi e forbici per rimuovere e scartare il tessuto adiposo sottocutaneo. Quindi tagliare il prepuzio pulito in tre o cinque pezzi più piccoli e incubare i pezzi di pelle in 16-20 millilitri di Dispace un mezzo DMEM in un tubo conico sterile.Durante i primi 30 minuti di incubazione con Dispace si mescolano a intermittenza i pezzi di pelle nel tubo conico per inversione. Quindi posizionare il tubo conico a quattro gradi Celsius per 16-18 ore. Il giorno dopo rimuovere i pezzi di pelle e metterli su un piatto di coltura sterile asciutto e srotolare ogni pezzo di pelle in modo che lo strato esterno dell'epidermide stia toccando il piatto di coltura.Partendo dal bordo del tessuto staccare l'epidermide dal derma usando due serie di pinze. Aggiungere i frammenti di epidermide separati a cinque millilitri di HBS in un piatto di coltura di 10 centimetri per incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. Quindi raccogliere la soluzione HBS in un tubo conico da 50 millilitri e aggiungere cinque millilitri di tampone di neutralizzazione della tripsina o T e B nel tubo conico.Mettere da parte il tubo. Ai frammenti epidermici nel piatto di coltura aggiungere tre millilitri di soluzione di tripsina per incubare a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Dopo l'incubazione agitare delicatamente i frammenti epidermici con una pinza fino a quando la soluzione di cheratinociti di tripsina diventa torbida.Quindi aggiungere la soluzione di cheratinociti di tripsina al tubo HBS T e B. Dopo aver sciolto frammenti epidermici non digeriti con soluzione di TRIPSINA EDTA, aggiungere due millilitri di FBS al tubo HBS T e B contenente tripsina EDTA e centrifugare i due circa 870 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Quindi aspirare il surnatante e risospese il pellet cellulare in tre millilitri di cheratinociti mezzo di crescita completo, seguito dalla filtrazione della sospensione cellulare con un filtro sterile da 100 micrometri in un tubo conico sterile da 50 millilitri.Una volta quantificati il numero di cellule e la vitalità cellulare, seminare le cellule nelle piastre di coltura per metterle in un incubatore a 37 gradi Celsius nel 5% di anidride carbonica. Dopo due giorni aspirare le cellule non aderenti e aggiornare i terreni di coltura cellulare a giorni alterni fino a quando i cheratinociti raggiungono il 50-80% di confluenza per esperimenti di passaggio o a valle. Preverminare i palloni T25 con poli-l-lisina o PLL, utilizzando cinque millilitri di DPBS e posizionare i palloni precoati a 37 gradi Celsius per tre ore.Successivamente lavare la matrice di rivestimento PLL due volte con DPBS. Dopo aver lavato i pezzi isolati del derma con cinque millilitri di mezzo basale DMEM, tritare il derma in piccoli pezzi con le forbici. Digerire il derma tritato con cinque millilitri di collagenasi a 37 gradi Celsius per due ore e mezza, con una titolazione delicata usando una punta di pipetta ogni 30 minuti fino a quando il derma si dissocia completamente.Una volta digerito, filtrare la sospensione cellulare con un filtro cellulare da 70 micrometri, seguito dalla diluizione della sospensione cellulare filtrata con cinque millilitri di mezzo DMEM completo per fermare l'attività enzimatica della collagenasi. Successivamente centrifugare la sospensione cellulare a 870 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente e risospesere il voto cellulare in due millilitri di mezzo completo DMEM per dividere le cellule. Dopo aver ripetuto il processo di centrificazione come descritto, aspirare il surnatante per utilizzare il pellet cellulare per isolare le cellule di Schwann o i fibroblasti.Per isolare le cellule di Schwan, risospese il pellet cellulare in cinque millilitri di mezzo completo DMEM fresco e quantificare il numero di cellule e la vitalità prima di seminare cinque millilitri delle celle risospese in palloni T25 precodificati ad una densità di 4,0 volte 10 alle tre celle per millilitro. Incubare il pallone a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Dopo 16 ore confermare l'adesione cellulare al microscopio con ingrandimento 10X.Quindi rimuovere le cellule non aderenza e lavare il pallone tre volte con cinque millilitri di DPBS. Successivamente incubare le cellule con cinque millilitri di 10 citosina arabinoside micromolare in un mezzo completo DMEM. Dopo 24 ore aspirare il mezzo contenente citosina arabinoside prima di risciacquare il matraccio come dimostrato in precedenza.Riempire il pallone di coltura con cinque millilitri di cellule schwann completa il terreno di coltura per incubare 48 ore, mentre rinfrescare il mezzo a giorni alterni fino a quando le cellule di Schwann raggiungono l'80% di confluenza. Per isolare i fibroblasti, risospesso il pellet raccolto in cinque millilitri di fibroblasti mezzo completo. Coltivare le cellule in palloni di coltura T25 non codificati per 24 ore, come dimostrato per le cellule di Schwann.Dopo aver aspirato le cellule non aderenza e lavato il pallone, incubare le cellule con cinque millilitri di fibroblasti freschi mezzo completo a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 48 ore. Poiché le cellule primarie isolate sono state coltivate nei rispettivi terreni di coltura cellulare, i cheratinociti primari hanno raggiunto l'85% di confluenza entro il settimo giorno e hanno mostrato una morfologia cellulare caratteristica con una forma di ciottoli. Le cellule di Schwann hanno raggiunto il 95% di confluenza entro il quinto giorno e sono apparse di forma bipolare o tripolare.Le colture di fibroblasti hanno raggiunto il 95% di confluenza entro il quarto giorno e la maggior parte delle cellule ha mostrato una morfologia a forma di fuso. La colorazione di immunofluorescenza ha confermato l'espressione proteica specifica del tipo cellulare nelle colture cellulari. I cheratinociti erano positivi per le proteine K10 e K14.Le immagini unite dell'immunofluorescenza della cheratina e della colorazione nucleare DAPI indicavano una purezza del 97,8% delle colture cellulari. Allo stesso modo, le cellule di Schwann erano positive per S100 e P75 NTR e avevano una purezza del 95,2% nella coltura. I fibroblasti hanno espresso positivamente la vimentina, ma non hanno espresso l'actina alfa della muscolatura liscia, un marcatore di miofibroblasti.La purezza della cultura era di circa il 97,2% Per migliorare le prove di Shanse, è possibile utilizzare un piatto di poli-l-lisina pre-rivestito. E per mitigare ulteriormente la contaminazione fibrosa, la citosina arabinoside e l'agente antimicotico sono stati aggiunti dopo che le cellule avevano aggiunto per un breve periodo. Questa è una semplice procedura sperimentale economica per stabilire le tre cellule primarie, come le cellule shwann, i cheratinociti e i fibroblasti, da una singola pelle anteriore umana.Questo protocollo è ideale per esperimenti in vitro che coinvolgono la comunicazione cellulare o crosstalk tra tipi di cellule.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Ricerca

Neuroscienze

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