Name: isolation, culture, and characterization of primary schwann cells, keratinocytes, and fibroblasts from human foreskin
Uploaded: 2022-03-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin at JoVE.com

우리는 Fadia Kamal 박사와 실험실 장비 및 기술 지원을 사용할 수있게 해준 Reyad Elbarbary 박사에게 감사드립니다. 이 작업은 펜실베니아 주립 대학 허쉬 메디컬 센터의 기관 지원 외에도 NIH (K08 AR060164-01A) 및 DOD (W81XWH-16-1-0725)의 보조금으로 J. C. E.에 지원되었습니다.

연구 목적으로 비확인 된 인간 포피 조직의 획득 및 사용은 Penn State College of Medicine Institutional Review Board (IRB #17574)에 의해 "인간이 아닌 연구"의 결정을 검토하고 받았다.
참고: 아래의 프로토콜에 따라, 2.4 x 10 6 각질세포, 4.4 x 10 6 섬유아세포 및 1.1 x 106 SCs가 단일 포피로부터 수득된다. 일반적으로, 이들 일차 세포는 실험 조건에 따라 3계대 동안 사용될 ...

<ol>
	<li>Hawksworth, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+disadvantages+of+using+human+cells+for+pharmacological+and+toxicological+studies.">Advantages and disadvantages of using human cells for pharmacological and toxicological studies.</a> Human &amp; Experimental Toxicology. 13 (8), 568-573 (1994).</li><li>Green, H., Kehinde, O., Thomas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+cultured+human+epidermal+cells+into+multiple+epithelia+suitable+for+grafting.">Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (11), 5665-5668 (1979).</li><li>Fuchs, E., Green, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+keratin+gene+expression+during+terminal+differentiation+of+the+keratinocyte.">Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocyte.</a> Cell. 19 (4), 1033-1042 (1980).</li><li>Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+cultivation+of+human+keratinocytes+from+skin+or+plucked+hair+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells.">Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).</li><li>Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+primary+adult+fibroblast+cultures+from+rodents.">Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2033 (2010).</li><li>Belviso, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+adult+human+dermal+fibroblasts+from+abdominal+skin+and+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+using+a+non-integrating+method.">Isolation of adult human dermal fibroblasts from abdominal skin and generation of induced pluripotent stem cells using a non-integrating method.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60629 (2020).</li><li>Silva, W. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Schwann+cells+in+cutaneous+wound+healing.">Role of Schwann cells in cutaneous wound healing.</a> Wound Repair and Regeneration. 26 (5), 392-397 (2018).</li><li>Bray, E. R., Cheret, J., Yosipovitch, G., Paus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cells+as+underestimated,+major+players+in+human+skin+physiology+and+pathology.">Schwann cells as underestimated, major players in human skin physiology and pathology.</a> Experimental Dermatology. 29 (1), 93-101 (2020).</li><li>Laverdet, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+innervation:+important+roles+during+normal+and+pathological+cutaneous+repair.">Skin innervation: important roles during normal and pathological cutaneous repair.</a> Histology and Histopathology. 30 (8), 875-892 (2015).</li><li>Jessen, K. R., Mirsky, R., Lloyd, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cells:+Development+and+role+in+nerve+repair.">Schwann cells: Development and role in nerve repair.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (7), 020487 (2015).</li><li>Bentley, C. A., Lee, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p75+is+important+for+axon+growth+and+Schwann+cell+migration+during+development.">p75 is important for axon growth and Schwann cell migration during development.</a> The Journal of Neuroscience. 20 (20), 7706-7715 (2000).</li><li>Rutkowski, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signals+for+proinflammatory+cytokine+secretion+by+human+Schwann+cells.">Signals for proinflammatory cytokine secretion by human Schwann cells.</a> Journal of Neuroimmunology. 101 (1), 47-60 (1999).</li><li>Kumar, A., Brockes, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+dependence+in+tissue,+organ,+and+appendage+regeneration.">Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration.</a> Trends in Neurosciences. 35 (11), 691-699 (2012).</li><li>Balakrishnan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+role+and+potential+of+Schwann+cells+for+peripheral+nerve+repair+from+studies+of+development+and+injury.">Insights into the role and potential of Schwann cells for peripheral nerve repair from studies of development and injury.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 608442 (2020).</li><li>Gresset, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boundary+caps+give+rise+to+neurogenic+stem+cells+and+terminal+glia+in+the+skin.">Boundary caps give rise to neurogenic stem cells and terminal glia in the skin.</a> Stem Cell Reports. 5 (2), 278-290 (2015).</li><li>Stratton, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+Schwann+cells+from+adult+human+skin+and+nerve.">Purification and characterization of Schwann cells from adult human skin and nerve.</a> eNeuro. 4 (3), (2017).</li></ol>

이 프로토콜은 포피의 단일 조각, 즉 각질세포, 섬유아세포 및 슈완 세포로부터 세 개의 별개의 세포 집단을 분리하는 방법을 기술한다. 각질세포 및 섬유아세포2,3,5,6을 분리하는데 이용가능한 몇 가지 분리 프로토콜이 있지만, SC 단리를 기술하는 것은 없다. 피부, 각질세포 및 섬유아세포의 주요 구...

생체 조직으로부터 유래되고 시험관내 조건 하에서 배양된 1차 세포는 생리학적 상태1과 매우 유사하여, 이들을 생리학적 및 병리생리학적 과정을 조사하기 위한 이상적인 모델이다. 피부는 각질세포, 섬유아세포, 세포세포, 멜라노사이트 및 슈완 세포(SCs)를 포함하는 다수의 세포 유형을 함유하며, 이는 시험관내 실험을 위해 단리되고 배양될 수 있다. 피부의 단일 조각으로부터 각질세포, 섬유아세포 및 SCs를 분리하고 배양하는 방법은 기술되지 않았다. 이 프로토콜의 목표는 두 가지입니다 : 1) 진피 SC의 분리 및 배양을위한 신뢰할 수 있고 재현 가능한 방법을 확립하고 2) 단일 인간 포피에서 각질 세포, 섬유 아세포 및 SC를 분리하기위한 효율적이고 강력한 방법을 사용하는 것입니다.
현재, 피부 각질세포 2,3,4 및 섬유아세포 5,6을 분리하기 위한 확립된 프로토콜이 있다. 이 연구는 피부로부터 각질세포, 섬유아세포 또는 둘 다의 분리를 기술하지만, 인간 피부로부터 일차 SC의 배양을 확립하는 방법을 다루는 프로토콜은 없다. 최근 연구에 따르면 뉴런 SC는 각질세포 및 섬유아세포 세포 과정을 조절하고 정상적인 피부 생리적 기능을 조절한다7. 따라서 SCs는 피부 항상성에 매우 중요하며, 존재하는 이웃 피부 세포 유형의 거동에 영향을 미치는 생리학을 조절하는데 실질적으로 기여한다8. 따라서, 이들 세포 유형 각각의 단리를 허용하는 프로토콜은 세포-세포 유형 간의 통신 또는 교차 대화를 포함하는 시험관내 실험에 이상적이다.
이 프로토콜은 피부의 단일 조각으로부터 일차 세포의 개별 세포 배양의 확립을 기술한다. 이러한 프로토콜은 사용 가능한 조직의 양이 제한될 때 특히 유용하다. 또한, 단일 공여체로부터 세 가지 세포 유형을 모두 분리하면 원하는 실험 중에 유전학의 영향을 완화하면서 세포 유형 또는 공동 배양 실험 간의 강력한 비교가 가능합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;M sterile filters (Millex-GP Syringe Filter Unit,polyethersulfone)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SLGPR33RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;M cell strainers</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;M cell strainers</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL disposable syringes</td>
			<td>BD Luer-Lok</td>
			<td>BD-309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL disposable syringes (Syringe sterile, single use)</td>
			<td>BD Luer-Lok</td>
			<td>BD309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL disposable syringes</td>
			<td>BD Luer-Lok</td>
			<td>BD305462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% TritonX-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-1L</td>
			<td>Prepared at the time of use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>J19943.K2</td>
			<td>Ready to use and store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td>Prepared at the time of use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemometec Vial1-Cassette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1420193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17018-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12544D 22*50-1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D46693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM basal medium</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>9221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline free from Ca2+ and Mg2+ (DPBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;21-031-CV)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL micro-centrifuge tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-681-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast complete medium</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>2331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11032</td>
			<td>Dilution (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>Dilution (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Buffered Saline Solution (HBSS buffer)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human foreskin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>De-identified human foreskin tissue for research purposes (Institutional Review Board- IRB #17574).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KGM-GOLD keratinocyte medium (KGM gold and supplements)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>00192151 and 00192152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse alpha-smooth muscle actin antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-9760-82</td>
			<td>Dilution (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Cytokeratin14 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7800</td>
			<td>Dilution (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse S100 antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MA5-12969</td>
			<td>Dilution (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi chambered (4 well glass slide)</td>
			<td>Tab-Tek</td>
			<td>154526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoCounter -Via1-Cassette</td>
			<td>Chemometec</td>
			<td>941-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysisne (PLL)</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>32503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Anti-fade Mountant with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit K10 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB4501656</td>
			<td>Dilution (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit p75-NTR antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB1554</td>
			<td>Dilution (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit vimentin</td>
			<td>ProteinTech</td>
			<td>10366-1-AP</td>
			<td>Dilution (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schwann cell culture medium</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>1701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision tweezers DUMONT straight with extra fine tips Dumostar, 5</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>LH75.1</td>
			<td>Sterilize with 70% alcohol before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS Scissors, sharp/sharp. Length 4&#8211;3/8&#34;(111mm)</td>
			<td>Codman</td>
			<td>54-6500</td>
			<td>Sterilize with 70% alcohol before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized surgical - sharp blade (Duro Edge Economy Single Edge Blades)</td>
			<td>Razor blade company</td>
			<td>94-0120</td>
			<td>Sterilize with 70% alcohol before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin neutralization buffer (TNS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Axio Observer 7- Axiocam 506 mono &#8211; Apotome.2 microscope</td>
			<td>For immunofluorescence of chamber slide containing stained cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Primovert</td>
			<td>For visulaizing/observing cell attachment or detachment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and characterization of primary schwann cells, keratinocytes, and fibroblasts from human foreskin

이 프로토콜은 피부의 신속한 효소 해리를 사용하여 높은 수율과 생존력을 가진 인간 일차 세포의 분리 방법, 배양 조건 및 특성화를 설명합니다. 일차 각질세포, 섬유아세포, 슈완 세포는 모두 인간 신생아 포피로부터 수확되며, 이는 표준 관리 절차에 따라 사용할 수 있습니다. 제거 된 피부는 소독되고 피하 지방과 근육은 메스를 사용하여 제거됩니다. 이 방법은 표피 및 진피 층의 효소 및 기계적 분리로 구성되며, 이어서 추가적인 효소 소화가 이뤄져 이들 피부 층 각각으로부터 단일 세포 현탁액을 얻는다. 마지막으로, 단일 세포는 표준 세포 배양 프로토콜에 따라 적절한 세포 배양 배지에서 성장하여 수주에 걸쳐 성장 및 생존력을 유지한다. 함께, 이 간단한 프로토콜은 피부-신경 모델의 시험관내 평가를 위해 단일 피부 조각으로부터 세 가지 세포 유형 모두를 분리, 배양 및 특성화할 수 있게 한다. 추가적으로, 이들 세포는 상처 치유와 관련된 배양물에서 로봇적으로 수행되는 스크래치의 형태로 서로에 대한 그들의 영향 및 시험관내 외상에 대한 그들의 반응을 측정하기 위해 공동 배양물에서 함께 사용될 수 있다.

정상 신생아 포피는 원발성 표피 각질세포 및 진피 SC 및 섬유아세포의 단리를 위해 사용되었다. 단리된 일차 세포를 성장 인자를 함유하는 각각의 세포 배양 배지에서 배양하였다. 배양 플라스크에서 SCs 및 섬유아세포를 시딩한 후, 대부분의 세포는 2시간 이내에 플라스크의 바닥에 부착되었다. 각질세포의 경우, 대부분의 각질세포는 24 h에 의해 부착되었다. 분리된 표피 일차 각질세포는 7일째까...

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Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin

근골격계 손상과 관련된 상처 치유에 대한 연구는 종종 슈완 세포 (SC), 각질 세포 및 섬유 아세포 간의 시험관 내 상호 작용의 평가를 필요로합니다. 이 프로토콜은 인간 포피로부터 이들 일차 세포의 분리, 배양 및 특성화를 기술한다.

인간 포피로부터의 일차 슈완 세포, 각질세포 및 섬유아세포의 분리, 배양 및 특성화

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid ...

피부에는 각질세포, 섬유아세포, 신경 슈완 세포를 포함한 여러 세포 유형이 포함되어 있습니다. 이 프로토콜은 시험관내 실험을 위해 이들 세포 유형 각각의 단리를 허용한다. 단일 기증자로부터 개별 일차 세포 배양물을 분리하고 확립하면 강력한 비교 및 공동 배양 실험이 가능하며 유전 적 변이의 영향을 완화 할 수 있습니다.이 프로토콜을 통해 개별 세포와 그 상호 작용의 분석은 피부 항상성 및 병리 생리학에서 Schwann 세포의 역할을 분석 할 수있게합니다. 이러한 별개의 세포 집단은 슈완 세포, 섬유아세포, 또는 각질세포를 정상 피부 생리학, 상처 치유 또는 피부 병든 상태에서 개별적으로 또는 조합하여 연구하는데 사용될 수 있다. Jagadeeshaprasad M G, 내 실험실의 박사 후 학자 인 Jagadeeshaprasad M G는 절차를 시연하는 데 도움을 줄 것입니다.표준 관리 절차에 따라 신생아 포피를 획득 한 후, 적출 된 포피를 8 ~ 10 밀리리터의 얼음 차가운 DMEM 기본 배지가 들어있는 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 즉시 포피를 세포 배양 실험실로 운반하여 세포를 분리하십시오. 항생제와 항균제가 들어있는 Dulbecco의 인산염 완충 식염수 또는 DPBS 20 ~ 25 밀리리터로 포피를 두 번 헹구십시오. 이어서, 세척된 피부를 25 내지 30 밀리리터의 얼음 차가운 DMEM 기초 배지에 10 센티미터 조직 배양 접시에 담그십시오.15분 후 포피를 얇게 썰어 메스를 이용하여 열어 진피와 피하 지방조직을 노출시킨다. 포셉, 메스 블레이드 및 가위를 사용하여 피하 지방 조직을 제거하고 버립니다. 그런 다음 깨끗한 포피를 세 개 내지 다섯 개의 작은 조각으로 자르고 멸균 원뿔형 튜브에서 16 내지 20 밀리리터의 Dispace 하나의 DMEM 배지에서 피부 조각을 인큐베이션한다.Dispace로 인큐베이션한 첫 30분 동안 간헐적으로 원뿔형 튜브의 피부 조각을 역전시켜 혼합한다. 그런 다음 원뿔형 튜브를 섭씨 4도에서 16 ~ 18 시간 동안 놓습니다. 다음날 피부 조각을 제거하고 건조한 멸균 배양 접시에 올려 놓고 피부의 각 조각을 풀어 바깥 표피층이 배양 접시에 닿도록 합니다.조직의 가장자리에서 시작하여 두 세트의 포셉을 사용하여 표피를 진피에서 멀리 떼어냅니다. 분리된 표피 단편을 10센티미터 배양 접시에 HBS 다섯 밀리리터에 첨가하여 실온에서 10분 동안 인큐베이션한다. 그런 다음 HBS 용액을 50 밀리리터 원뿔형 튜브에 모으고 5 밀리리터의 트립신 중화 버퍼 또는 T 및 B를 원뿔형 튜브에 첨가하십시오.튜브를 따로 두십시오. 배양 접시의 표피 절편에 트립신 용액 3 밀리리터를 첨가하여 섭씨 37도에서 10 분 동안 배양하십시오. 인큐베이션에 이어 트립신 각질세포 용액이 혼탁해질 때까지 포셉으로 표피 단편을 부드럽게 교반시킨다.다음으로 트립신 각질세포 용액을 HBS T 및 B 튜브에 첨가한다. 소화되지 않은 표피 절편을 트립신 EDTA 용액으로 용해시킨 후, 트립신 EDTA 용액을 함유하는 HBS T 및 B 튜브에 FBS 두 밀리리터를 첨가하고, 섭씨 네 도에서 5분 동안 약 870배 G를 원심분리한다. 이어서, 상청액을 흡인하고, 세포 펠릿을 3밀리리터의 케라티노사이트 완전 성장 배지에 재현탁시키고, 이어서 세포 현탁액을 멸균된 100 마이크로미터 필터로 멸균된 50 밀리리터 원뿔형 튜브 내로 여과하였다.일단 세포 수 및 세포 생존율이 정량화되면, 세포를 배양 플레이트에 시드하여 섭씨 37도의 인큐베이터에 5% 이산화탄소로 배치한다. 이틀 후 부착되지 않은 세포를 흡인하고, 각질형성세포가 계대 또는 하류 실험을 위해 50 내지 80%의 합류율에 도달할 때까지 격일로 세포 배양 배지를 새로 고친다. 5 밀리리터의 DPBS를 사용하여 폴리-l-라이신 또는 PLL로 T25 플라스크를 프리코트하고 예비코팅된 플라스크를 섭씨 37도에서 3시간 동안 놓습니다.나중에 PLL 코팅 매트릭스를 DPBS로 두 번 세척한다. 진피의 분리 된 조각을 다섯 밀리리터의 DMEM 기본 배지로 세척 한 후 진피를 가위로 작은 조각으로 다듬습니다. 다진 진피를 섭씨 37도에서 콜라게나제 5밀리리터로 두 시간 반 동안 소화하고, 진피가 완전히 해리될 때까지 30분마다 피펫 팁을 사용하여 부드럽게 적정합니다.일단 소화되면, 세포 현탁액을 70 마이크로미터 세포 스트레이너로 여과하고, 이어서 여과된 세포 현탁액을 5밀리리터의 완전한 DMEM 배지로 희석하여 콜라게나제의 효소 활성을 정지시킨다. 다음으로 세포 현탁액을 실온에서 5분 동안 870배 G에서 원심분리하고, 세포 투표용지를 두 밀리리터의 DMEM 완전 배지에 재현탁시켜 세포를 분할한다. 기재된 바와 같이 농축 과정을 반복한 후, 상청액을 흡인하여 세포 펠릿을 사용하여 슈완 세포 또는 섬유아세포를 분리한다.슈완 세포를 단리하기 위해, 세포 펠릿을 5밀리리터의 신선한 DMEM 완전 배지에 재현탁시키고, 미리 코딩된 T25 플라스크에 재현탁된 세포의 5밀리리터를 밀리리터당 3개의 세포에 4.0배 10배의 밀도로 시딩하기 전에 세포 수 및 생존율을 정량화한다. 플라스크를 섭씨 37도 및 5 % 이산화탄소에서 인큐베이션하십시오. 16시간 후 10X 배율에서 현미경으로 세포 부착을 확인하였다.그런 다음 부착되지 않은 세포를 제거하고 플라스크 세 번을 다섯 밀리리터의 DPBS로 세척하십시오. 다음으로 세포를 DMEM 완전 배지에서 10 마이크로몰 시토신 아라비노사이드의 다섯 밀리리터로 인큐베이션한다. 24시간 후 시토신 아라비노사이드 함유 배지를 흡인하여 이전에 입증된 바와 같이 플라스크를 헹구었다.배양 플라스크를 다섯 밀리리터의 슈완 세포 완전 배지로 리필하여 48시간 배양하고, 슈완 세포가 80%컨플루언시에 도달할 때까지 격일로 배지를 리프레시한다. 섬유아세포를 분리하기 위해, 수집된 펠렛을 섬유아세포 완전 배지의 다섯 밀리리터에 재현탁시킨다. 세포를 코딩되지 않은 T25 배양 플라스크에서 24시간 동안 슈완 세포에 대해 입증된 바와 같이 배양하였다.부착되지 않은 세포를 흡인하고 플라스크를 세척한 후, 세포를 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 5밀리리터의 신선한 섬유아세포 완전 배지로 48시간 동안 인큐베이션한다. 분리된 일차 세포를 각각의 세포 배양 배지에서 배양함에 따라, 일차 각질세포는 일곱째 날까지 85%컨플루언시에 도달하였고, 조약돌 모양의 특징적인 세포 형태를 나타내었다. 슈완 세포는 5일째까지 95%의 합류율에 도달했고, 양극성 또는 삼극성 모양으로 나타났다.섬유아세포 배양물은 넷째 날까지 95%의 합류율에 도달하였고, 대부분의 세포는 스핀들 형상 형태를 나타내었다. 면역형광염색을 통해 세포 배양물에서 세포형 특이적 단백질 발현을 확인하였다. 각질세포는 K10 및 K14 단백질에 대해 양성이었다.케라틴 면역형광 및 DAPI 핵 염색의 병합된 이미지는 세포 배양물의 97.8% 순도를 나타냈다. 유사하게, 슈완 세포는 S100 및 P75 NTR에 대해 양성이었고, 배양물에서 95.2%의 순도를 가졌다. 섬유아세포는 비멘틴을 긍정적으로 발현하였으나, 근섬유아세포 마커인 알파 평활근 액틴을 발현하지는 않았다.배양물의 순도는 약 97.2 %로 Shanse의 증거를 향상시키기 위해 사전 코팅 된 폴리 l- 라이신 접시를 사용할 수 있습니다. 섬유질 오염을 더욱 완화시키기 위해, 시토신 아라비노사이드 및 항균제를 세포가 짧은 시간 동안 첨가한 후에 첨가하였다. 이것은 단일 인간 포피로부터 송곳 세포, 각질 세포 및 섬유 아세포와 같은 세 가지 기본 세포를 확립하기위한 간단한 저렴한 실험 절차입니다.이 프로토콜은 세포 세포 통신 또는 세포 유형 간의 누화를 포함하는 시험관내 실험에 이상적입니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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인간의 모공에서 신경 크레스트 줄기 세포의 분리와 문화

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

연구

신경과학

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인간 Fungiform의 맛 용의자 전지의 분리 및 문화

Taste cells are highly specialized, with unique histological, molecular and physiological characteristics that permit detection of a wide range of simple ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

배아 Murine 신경 튜브에서 신경 크레스트 세포의 분리 및 문화

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Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

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배아 쥐의 뇌에서 차 중뇌 도파민 신경 세포의 분리, 문화 및 장기 유지 보수

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

마우스 뇌량 밑 영역에서의 분리 및 성인 신경 줄기 세포의 문화

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

성인 인간 피부 섬유 아 세포에서 유도 된 신경의 고수익 문화의 간단한 세대

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

특성화 및 조밀도 기온 변화도 원심 분리 하 여 마우스 기본 Microglia의 절연

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

신경 전달 물질 방출 공부 하 느 루트 중추 절연 및 주 문화

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...