Name: isolation, culture, and characterization of primary schwann cells, keratinocytes, and fibroblasts from human foreskin
Uploaded: 2022-03-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin at JoVE.com

Vi vil takke Dr. Fadia Kamal, og Dr. Reyad Elbarbary for at vi kunne bruke laboratorieinstrumenter og teknisk støtte. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra NIH (K08 AR060164-01A) og DOD (W81XWH-16-1-0725) til J. C. E. i tillegg til institusjonell støtte fra Pennsylvania State University Hershey Medical Center.

Oppkjøp og bruk av av-identifisert humant forhudsvev til forskningsformål ble gjennomgått og fikk bestemmelsen om "ikke menneskelig forskning" av Penn State College of Medicine Institutional Review Board (IRB #17574).
MERK: Ved å følge protokollen nedenfor oppnås 2,4 x 106 keratinocytter, 4,4 x 106 fibroblaster og 1,1 x 106 SCer fra et enkelt forhud. Generelt kan disse primære cellene brukes til 3 passasjer, avhengig av de eksperimentelle forholdene....

<ol>
	<li>Hawksworth, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+disadvantages+of+using+human+cells+for+pharmacological+and+toxicological+studies.">Advantages and disadvantages of using human cells for pharmacological and toxicological studies.</a> Human &amp; Experimental Toxicology. 13 (8), 568-573 (1994).</li><li>Green, H., Kehinde, O., Thomas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+cultured+human+epidermal+cells+into+multiple+epithelia+suitable+for+grafting.">Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (11), 5665-5668 (1979).</li><li>Fuchs, E., Green, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+keratin+gene+expression+during+terminal+differentiation+of+the+keratinocyte.">Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocyte.</a> Cell. 19 (4), 1033-1042 (1980).</li><li>Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+cultivation+of+human+keratinocytes+from+skin+or+plucked+hair+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells.">Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).</li><li>Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+primary+adult+fibroblast+cultures+from+rodents.">Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2033 (2010).</li><li>Belviso, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+adult+human+dermal+fibroblasts+from+abdominal+skin+and+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+using+a+non-integrating+method.">Isolation of adult human dermal fibroblasts from abdominal skin and generation of induced pluripotent stem cells using a non-integrating method.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60629 (2020).</li><li>Silva, W. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Schwann+cells+in+cutaneous+wound+healing.">Role of Schwann cells in cutaneous wound healing.</a> Wound Repair and Regeneration. 26 (5), 392-397 (2018).</li><li>Bray, E. R., Cheret, J., Yosipovitch, G., Paus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cells+as+underestimated,+major+players+in+human+skin+physiology+and+pathology.">Schwann cells as underestimated, major players in human skin physiology and pathology.</a> Experimental Dermatology. 29 (1), 93-101 (2020).</li><li>Laverdet, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+innervation:+important+roles+during+normal+and+pathological+cutaneous+repair.">Skin innervation: important roles during normal and pathological cutaneous repair.</a> Histology and Histopathology. 30 (8), 875-892 (2015).</li><li>Jessen, K. R., Mirsky, R., Lloyd, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cells:+Development+and+role+in+nerve+repair.">Schwann cells: Development and role in nerve repair.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (7), 020487 (2015).</li><li>Bentley, C. A., Lee, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p75+is+important+for+axon+growth+and+Schwann+cell+migration+during+development.">p75 is important for axon growth and Schwann cell migration during development.</a> The Journal of Neuroscience. 20 (20), 7706-7715 (2000).</li><li>Rutkowski, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signals+for+proinflammatory+cytokine+secretion+by+human+Schwann+cells.">Signals for proinflammatory cytokine secretion by human Schwann cells.</a> Journal of Neuroimmunology. 101 (1), 47-60 (1999).</li><li>Kumar, A., Brockes, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+dependence+in+tissue,+organ,+and+appendage+regeneration.">Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration.</a> Trends in Neurosciences. 35 (11), 691-699 (2012).</li><li>Balakrishnan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+role+and+potential+of+Schwann+cells+for+peripheral+nerve+repair+from+studies+of+development+and+injury.">Insights into the role and potential of Schwann cells for peripheral nerve repair from studies of development and injury.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 608442 (2020).</li><li>Gresset, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boundary+caps+give+rise+to+neurogenic+stem+cells+and+terminal+glia+in+the+skin.">Boundary caps give rise to neurogenic stem cells and terminal glia in the skin.</a> Stem Cell Reports. 5 (2), 278-290 (2015).</li><li>Stratton, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+Schwann+cells+from+adult+human+skin+and+nerve.">Purification and characterization of Schwann cells from adult human skin and nerve.</a> eNeuro. 4 (3), (2017).</li></ol>

Denne protokollen beskriver en metode for å isolere tre forskjellige cellepopulasjoner fra en enkelt del av forhuden, nemlig keratinocytter, fibroblaster og Schwann-celler. Det er noen få isolasjonsprotokoller tilgjengelig for å isolere keratinocytter og fibroblaster 2,3,5,6, men ingen beskriver SC-isolasjon. Bortsett fra de viktigste strukturelle cellene i huden, keratinocytter og fibroblas...

Primærceller avledet fra levende vev og dyrket under in vitro-forhold ligner nært på den fysiologiske tilstanden1, noe som gjør dem til en ideell modell for å undersøke fysiologiske og patofysiologiske prosesser. Huden inneholder flere celletyper, inkludert keratinocytter, fibroblaster, sebocytter, melanocytter og Schwann-celler (SCer), som kan isoleres og dyrkes for in vitro-eksperimenter . Metoder for å isolere og dyrke keratinocytter, fibroblaster og SCer, fra et enkelt stykke hud, har ikke blitt beskrevet. Målet med denne protokollen er todelt: 1) å etablere en pålitelig og reproduserbar metode for isolering og dyrking av dermale SCer og 2) å bruke en effektiv, robust metode for isolering av keratinocytter, fibroblaster og SCer fra et enkelt menneskelig forhud.
For tiden er det etablerte protokoller for å isolere hud keratinocytter 2,3,4 og fibroblaster 5,6. Disse studiene beskriver isolasjonen av enten keratinocytter, fibroblaster eller begge deler fra huden, men ingen protokoll tar for seg hvordan man etablerer kulturer av primære SCer fra menneskelig hud. Nyere studier tyder på at nevronale SCs modulerer keratinocytt og fibroblast cellulære prosesser og regulerer normale hudfysiologiske funksjoner7. SCs er dermed kritiske for huden homeostase og bidrar vesentlig til regulere fysiologi som påvirker oppførselen til nærliggende hudcelletyper tilstede8. Derfor er en protokoll som tillater isolering av hver av disse celletypene, ideell for in vitro-eksperimenter som involverer cellecellekommunikasjon eller kryssprat mellom celletyper.
Denne protokollen beskriver etableringen av individuelle cellekulturer av primærceller fra et enkelt stykke hud. Denne protokollen er spesielt nyttig når mengden vev som er tilgjengelig er begrenset. Videre tillater isolasjon av alle tre celletyper fra en enkelt donor robuste sammenligninger mellom celletyper eller samkultureksperimenter samtidig som genetikken reduseres under ønsket eksperiment.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;M sterile filters (Millex-GP Syringe Filter Unit,polyethersulfone)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SLGPR33RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;M cell strainers</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;M cell strainers</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL disposable syringes</td>
			<td>BD Luer-Lok</td>
			<td>BD-309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL disposable syringes (Syringe sterile, single use)</td>
			<td>BD Luer-Lok</td>
			<td>BD309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL disposable syringes</td>
			<td>BD Luer-Lok</td>
			<td>BD305462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% TritonX-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-1L</td>
			<td>Prepared at the time of use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>J19943.K2</td>
			<td>Ready to use and store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td>Prepared at the time of use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemometec Vial1-Cassette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1420193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17018-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12544D 22*50-1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D46693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM basal medium</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>9221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline free from Ca2+ and Mg2+ (DPBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;21-031-CV)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL micro-centrifuge tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-681-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast complete medium</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>2331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11032</td>
			<td>Dilution (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>Dilution (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Buffered Saline Solution (HBSS buffer)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human foreskin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>De-identified human foreskin tissue for research purposes (Institutional Review Board- IRB #17574).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KGM-GOLD keratinocyte medium (KGM gold and supplements)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>00192151 and 00192152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse alpha-smooth muscle actin antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-9760-82</td>
			<td>Dilution (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Cytokeratin14 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7800</td>
			<td>Dilution (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse S100 antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MA5-12969</td>
			<td>Dilution (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi chambered (4 well glass slide)</td>
			<td>Tab-Tek</td>
			<td>154526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoCounter -Via1-Cassette</td>
			<td>Chemometec</td>
			<td>941-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysisne (PLL)</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>32503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Anti-fade Mountant with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit K10 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB4501656</td>
			<td>Dilution (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit p75-NTR antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB1554</td>
			<td>Dilution (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit vimentin</td>
			<td>ProteinTech</td>
			<td>10366-1-AP</td>
			<td>Dilution (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schwann cell culture medium</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>1701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision tweezers DUMONT straight with extra fine tips Dumostar, 5</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>LH75.1</td>
			<td>Sterilize with 70% alcohol before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS Scissors, sharp/sharp. Length 4&#8211;3/8&#34;(111mm)</td>
			<td>Codman</td>
			<td>54-6500</td>
			<td>Sterilize with 70% alcohol before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized surgical - sharp blade (Duro Edge Economy Single Edge Blades)</td>
			<td>Razor blade company</td>
			<td>94-0120</td>
			<td>Sterilize with 70% alcohol before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin neutralization buffer (TNS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Axio Observer 7- Axiocam 506 mono &#8211; Apotome.2 microscope</td>
			<td>For immunofluorescence of chamber slide containing stained cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Primovert</td>
			<td>For visulaizing/observing cell attachment or detachment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and characterization of primary schwann cells, keratinocytes, and fibroblasts from human foreskin

Denne protokollen beskriver isolasjonsmetoder, fortykningsforhold og karakterisering av menneskelige primærceller med høyt utbytte og levedyktighet ved hjelp av rask enzymatisk dissosiasjon av huden. Primære keratinocytter, fibroblaster og Schwann-celler høstes alle fra det nyfødte forhuden, som er tilgjengelig etter standard omsorgsprosedyrer. Den fjernede huden desinfiseres, og det subkutane fettet og muskelen fjernes ved hjelp av en skalpell. Metoden består av enzymatisk og mekanisk separasjon av epidermale og dermale lag, etterfulgt av ytterligere enzymatisk fordøyelse for å oppnå encellede suspensjoner fra hvert av disse hudlagene. Til slutt vokser enkeltceller i passende cellekulturmedier etter standard cellekulturprotokoller for å opprettholde vekst og levedyktighet over uker. Sammen tillater denne enkle protokollen isolasjon, culturing og karakterisering av alle tre celletyper fra et enkelt stykke hud for in vitro-evaluering av hudnervemodeller. I tillegg kan disse cellene brukes sammen i samkulturer for å måle deres effekter på hverandre og deres respons på in vitro traumer i form av riper utført robotisert i kulturen forbundet med sårheling.

Normal neonatal forhud ble brukt til isolering av primære epidermale keratinocytter og dermale SCer og fibroblaster. De isolerte primærcellene ble dyrket i respektive cellekulturmedier som inneholdt vekstfaktorer. Etter sådd av SCs og fibroblast i kulturflasker, festet de fleste cellene seg til bunnen av kolben innen 2 timer. Når det gjelder keratinocytter, ble de fleste keratinocytter festet med 24 timer. Isolerte epidermale primære keratinocytter nådde 85% samløp etter dag 7 og viste karakteristisk cellemorfolog...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin at JoVE.com

Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin

Studien av sårheling forbundet med muskel- og skjelettskader krever ofte vurdering av in vitro interaksjoner mellom Schwann-celler (SCer), keratinocytter og fibroblaster. Denne protokollen beskriver isolasjon, dyrking og karakterisering av disse primære cellene fra den menneskelige forhuden.

Isolasjon, kultur og karakterisering av primære Schwann-celler, Keratinocytter og Fibroblaster fra Human Foreskin

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid ...

Huden inneholder flere celletyper, inkludert keratinocytter, fibroblaster og nerve Schwann-celler. Denne protokollen tillater isolering av hver av disse celletypene for in vitro-eksperimenter. Isolasjon og etablering av individuelle primærcellekulturer fra en enkelt donor muliggjør robuste sammenligninger og samkultureksperimenter, samtidig som effekten av genetisk variasjon reduseres.Med denne protokollen tillater analysen av individuelle celler og deres interaksjoner analysen av Schwann-cellenes rolle i hud homeostase og patofysiologi. Disse distinkte cellepopulasjonene kan brukes til å studere Schwann-celler, fibroblaster eller keratinocytter enten individuelt eller i kombinasjon i normal hudfysiologi, sårheling eller i hudsykdommer. Jagadeeshaprasad M G, postdoktor i laboratoriet mitt, vil hjelpe meg med å demonstrere prosedyren.Etter å ha anskaffet neonatal forhuden etter standard for omsorgsprosedyrer, plasser det utskilte forhuden i et mikrosentrifugerør som inneholder åtte til 10 milliliter iskaldt DMEM basalmedium, og transport straks forhuden til cellekulturlaboratoriet for celleisolering. Skyll forhuden to ganger med 20 til 25 milliliter dulbeccos fosfat bufret saltvann eller DPBS, som inneholder antibiotika og antimykotisk. Bløtlegg deretter den vaskede huden i 25 til 30 milliliter iskaldt DMEM basalmedium i en 10 centimeter vevskulturrett.Etter 15 minutter skjær forhuden opp med en skalpell for å eksponere dermis og subkutant fettvev. Bruk tang, et skalpellblad og saks for å fjerne og kaste det subkutane fettvevet. Klipp deretter det rene forhuden i tre til fem mindre stykker og inkuber hudstykkene i 16 til 20 milliliter Dispace ett DMEM-medium i et sterilt konisk rør.I løpet av de første 30 minuttene av inkubasjon med Dispace blander man periodisk hudstykkene i det koniske røret ved inversjon. Plasser deretter konisk rør ved fire grader Celsius i 16 til 18 timer. Neste dag fjerner du hudstykkene og legger dem på en tørr steril kulturrett og ruller ut hvert stykke hud slik at det ytre epidermislaget berører kulturretten.Fra kanten av vevet skrell epidermis bort fra dermis ved hjelp av to sett med tang. Tilsett de separerte epidermisfragmentene til fem milliliter HBS i en 10 centimeter kulturrett for å inkubere ved romtemperatur i 10 minutter. Samle deretter HBS-løsningen i et 50 milliliter konisk rør og tilsett fem milliliter trypsinnøytraliseringsbuffer eller T og B i det koniske røret.Sett røret til side. Til de epidermale fragmentene i kulturretten legger du til tre milliliter Trypsin-løsning for å inkubere ved 37 grader Celsius i 10 minutter. Etter inkubasjonen rører forsiktig de epidermale fragmentene med tang til trypsin keratinocytter-løsningen blir uklar.Deretter legger du til trypsin keratinocyttløsningen i HBS T- og B-røret. Etter å ha oppløst ufordøyde epidermale fragmenter med trypsin EDTA-løsning, tilsett to milliliter FBS til HBS T- og B-røret som inneholder trypsin EDTA-løsning, og sentrifuger de to omtrent 870 ganger G i fem minutter ved fire grader Celsius. Aspirer deretter supernatanten og resuspend cellepelleten i tre milliliter keratinocytt komplett vekstmedium, etterfulgt av filtrering av cellefjæringen med et sterilt 100 mikrometer filter i et sterilt 50 milliliter konisk rør.Når cellenummeret og celle levedyktigheten er kvantifisert, frø cellene i kulturplatene for å plassere i en inkubator ved 37 grader Celsius i 5% karbondioksid. Etter to dager aspirerer de ikke-tilholdte cellene, og oppdaterer cellekulturmediene annenhver dag til keratinocytter når 50 til 80% sammenløp for passiviserende eller nedstrøms eksperimenter. Precoat T25 kolber med poly-l-lysin eller PLL, ved hjelp av fem milliliter DPBS og plasser de forhåndsbelagte kolber på 37 grader Celsius i tre timer.Vask senere PLL-beleggmatrisen to ganger med DPBS. Etter å ha vasket de isolerte delene av dermis med fem milliliter DMEM basal medium, hakk dermis i små biter med saks. Fordøy hakket dermis med fem milliliter kollagenaler ved 37 grader Celsius i to og en halv time, med mild titrering ved hjelp av en pipettespiss hvert 30.Når den er fordøyd, filtrer cellefjæringen med en 70 mikrometer cellesil, etterfulgt av fortynning av den filtrerte cellefjæringen med fem milliliter komplett DMEM-medium for å stoppe den enzymatiske aktiviteten til kollagenalus. Deretter sentrifugerer cellesuspensjonen ved 870 ganger G i fem minutter ved romtemperatur og bruker cellestemmen på nytt i to milliliter DMEM komplett medium for å dele cellene. Etter å ha gjentatt sentrifiseringsprosessen som beskrevet, aspirer supernatanten til å bruke cellepellet for å isolere Schwann-cellene eller fibroblaster.For å isolere Schwan-cellene, resuspenderer cellepellet i fem milliliter fersk DMEM komplett medium og kvantifisere cellenummeret og levedyktigheten før du sår fem milliliter av de resuspenderte cellene i forhåndskodede T25-kolber med en tetthet på 4,0 ganger 10 til de tre cellene per milliliter. Inkuber kolben ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid. Etter 16 timer bekrefte celleadhesjon ved mikroskopi ved 10X forstørrelse.Fjern deretter ikke-tilslutningscellene og vask kolbe tre ganger med fem milliliter DPBS. Deretter inkuberer cellene med fem milliliter av 10 mikromolar cytosine arabinoside i et DMEM komplett medium. Etter 24 timer aspirerer cytosin arabinosiden som inneholder medium før du skyller kolben som vist før.Fyll kulturflasken med fem milliliter Schwann-celler komplett kulturmedium for å inkubere 48 timer, mens du oppdaterer mediet annenhver dag til Schwann-cellene når 80% samløp. For å isolere fibroblaster, resuspender den oppsamlede pellet i fem milliliter fibroblaster komplett medium. For å dyrke cellene i ikke-kodede T25-kulturflasker i 24 timer som demonstrert for Schwann-cellene.Etter å ha aspirert ikke-tilslutningscellene og vasket kolben, inkuber cellene med fem milliliter friske fibroblaster komplett medium ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid i 48 timer. Ettersom de isolerte primærcellene ble dyrket i respektive cellekulturmedier, nådde de primære keratinocyttene 85% samløp etter dag syv og viste karakteristisk cellemorfologi med brosteinsform. Schwann-cellene nådde 95% samløp ved dag fem og dukket opp bipolar eller tripolar i form.Fibroblasterkulturene nådde 95% samløp etter dag fire, og de fleste celler viste en spindelformmorfologi. Immunfluorescensfarging bekreftet celletype spesifikt proteinuttrykk i cellekulturene. Keratinocyttene var positive for K10 og K14 protein.De sammenslåtte bildene av keratinimmunofluorescence og DAPI kjernefysisk farging indikerte 97,8% renhet av cellekulturene. På samme måte var Schwann-cellene positive for S100 og P75 NTR og hadde en renhet på 95,2% i kulturen. Fibroblaster uttrykte positivt vimentin, men uttrykte ikke alfa glatt muskel Actin, en myofibroblast markør.Renheten av kulturen var rundt 97,2%For å forbedre Shanses bevis, kan forhåndsbelagt poly-l-lysinrett brukes. Og for ytterligere å redusere fibrøst forurensning ble cytosin arabinoside og antimykotisk middel tilsatt etter at cellene hadde lagt til i kort tid. Dette er en enkel billig eksperimentell prosedyre for å etablere de tre primære cellene, for eksempel shwannceller, keratinocytter og fibroblaster, fra en enkelt menneskelig forhud.Denne protokollen er ideell for in vitro-eksperimenter som involverer cellecellekommunikasjon eller krysstale mellom celletyper.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

Isolasjon og kultur av neural crest stamceller fra Human Hair Follikler

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

Isolation and Culture of Human Fungiform Taste Papillae Cells

Isolering og kultur for Human Fungiform Taste papillae Cells

Taste cells are highly specialized, with unique histological, molecular and physiological characteristics that permit detection of a wide range of simple ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Isolering og kultur neural crest Celler fra Embryonic murin Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Isolasjon og kultur av endotelceller fra Embryonale brain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Isolasjon, Kultur og langsiktig vedlikehold av Primary mesencefalisk dopaminerge nevroner Fra Embryonic Gnagere Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Isolasjon og Culture of Adult Neural stamceller fra mus Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Enkel generasjon av en høy avkastning kultur indusert neurons fra menneskelige voksne huden fibroblaster

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Karakterisering og isolering av musen primære Microglia av tetthet gradert sentrifugering

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Dorsal Root Ganglion isolasjon og primære kultur for å studere nevrotransmitter-løslate

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

Primær kultur neurons isolert fra embryonale mus lillehjernen

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...