Name: isolation, culture, and characterization of primary schwann cells, keratinocytes, and fibroblasts from human foreskin
Uploaded: 2022-03-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin at JoVE.com

Gostaríamos de agradecer ao Dr. Fadia Kamal e ao Dr. Reyad Elbarbary por nos permitir usar instrumentos de laboratório e suporte técnico. Este trabalho foi apoiado por subvenções do NIH (K08 AR060164-01A) e do DOD (W81XWH-16-1-0725) a J. C. E. além do apoio institucional do Centro Médico Hershey da Universidade Estadual da Pensilvânia.

A aquisição e o uso de tecido foreskin humano desidentificado para fins de pesquisa foram revisados e receberam a determinação de "não pesquisa humana" pelo Penn State College of Medicine Institutional Review Board (IRB #17574).
NOTA: Seguindo o protocolo abaixo, 2,4 x 106 queratinócitos, 4,4 x 106 fibroblastos e 1,1 x 106 SCs são obtidos de um único prepúcio. Em geral, essas células primárias podem ser usadas para 3 passagens, dependendo das condiç...

<ol>
	<li>Hawksworth, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+disadvantages+of+using+human+cells+for+pharmacological+and+toxicological+studies.">Advantages and disadvantages of using human cells for pharmacological and toxicological studies.</a> Human &amp; Experimental Toxicology. 13 (8), 568-573 (1994).</li><li>Green, H., Kehinde, O., Thomas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+cultured+human+epidermal+cells+into+multiple+epithelia+suitable+for+grafting.">Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (11), 5665-5668 (1979).</li><li>Fuchs, E., Green, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+keratin+gene+expression+during+terminal+differentiation+of+the+keratinocyte.">Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocyte.</a> Cell. 19 (4), 1033-1042 (1980).</li><li>Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+cultivation+of+human+keratinocytes+from+skin+or+plucked+hair+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells.">Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).</li><li>Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+primary+adult+fibroblast+cultures+from+rodents.">Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2033 (2010).</li><li>Belviso, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+adult+human+dermal+fibroblasts+from+abdominal+skin+and+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+using+a+non-integrating+method.">Isolation of adult human dermal fibroblasts from abdominal skin and generation of induced pluripotent stem cells using a non-integrating method.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60629 (2020).</li><li>Silva, W. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Schwann+cells+in+cutaneous+wound+healing.">Role of Schwann cells in cutaneous wound healing.</a> Wound Repair and Regeneration. 26 (5), 392-397 (2018).</li><li>Bray, E. R., Cheret, J., Yosipovitch, G., Paus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cells+as+underestimated,+major+players+in+human+skin+physiology+and+pathology.">Schwann cells as underestimated, major players in human skin physiology and pathology.</a> Experimental Dermatology. 29 (1), 93-101 (2020).</li><li>Laverdet, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+innervation:+important+roles+during+normal+and+pathological+cutaneous+repair.">Skin innervation: important roles during normal and pathological cutaneous repair.</a> Histology and Histopathology. 30 (8), 875-892 (2015).</li><li>Jessen, K. R., Mirsky, R., Lloyd, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cells:+Development+and+role+in+nerve+repair.">Schwann cells: Development and role in nerve repair.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (7), 020487 (2015).</li><li>Bentley, C. A., Lee, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p75+is+important+for+axon+growth+and+Schwann+cell+migration+during+development.">p75 is important for axon growth and Schwann cell migration during development.</a> The Journal of Neuroscience. 20 (20), 7706-7715 (2000).</li><li>Rutkowski, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signals+for+proinflammatory+cytokine+secretion+by+human+Schwann+cells.">Signals for proinflammatory cytokine secretion by human Schwann cells.</a> Journal of Neuroimmunology. 101 (1), 47-60 (1999).</li><li>Kumar, A., Brockes, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+dependence+in+tissue,+organ,+and+appendage+regeneration.">Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration.</a> Trends in Neurosciences. 35 (11), 691-699 (2012).</li><li>Balakrishnan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+role+and+potential+of+Schwann+cells+for+peripheral+nerve+repair+from+studies+of+development+and+injury.">Insights into the role and potential of Schwann cells for peripheral nerve repair from studies of development and injury.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 608442 (2020).</li><li>Gresset, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boundary+caps+give+rise+to+neurogenic+stem+cells+and+terminal+glia+in+the+skin.">Boundary caps give rise to neurogenic stem cells and terminal glia in the skin.</a> Stem Cell Reports. 5 (2), 278-290 (2015).</li><li>Stratton, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+Schwann+cells+from+adult+human+skin+and+nerve.">Purification and characterization of Schwann cells from adult human skin and nerve.</a> eNeuro. 4 (3), (2017).</li></ol>

Este protocolo descreve um método para isolar três populações de células distintas de um único pedaço do prepúcio, ou seja, queratinócitos, fibroblastos e células Schwann. Existem alguns protocolos de isolamento disponíveis para isolar queratinócitos e fibroblastos 2,3,5,6, mas nenhum descreve o isolamento de SC. Além das principais células estruturais da pele, queratinócitos e ...

As células primárias derivadas do tecido vivo e cultivadas sob condições in vitro se assemelham muito ao estado fisiológico1, tornando-as um modelo ideal para investigar processos fisiológicos e fisiofósicos. A pele contém vários tipos de células, incluindo queratinócitos, fibroblastos, sebocítos, melanócitos e células schwann (SCs), que podem ser isoladas e cultivadas para experimentos in vitro . Não foram descritos métodos para isolar e cultivar queratinócitos, fibroblastos e SCs, de um único pedaço de pele. O objetivo deste protocolo é duplo: 1) estabelecer um método confiável e reprodutível para o isolamento e cultivo de SCs dérmicas e 2) para utilizar um método eficiente e robusto para o isolamento de queratinócitos, fibroblastos e SCs de um único prepúcio humano.
Atualmente, existem protocolos estabelecidos para isolar os queratinócitosda pele 2,3,4 e os fibroblastos 5,6. Esses estudos descrevem o isolamento de queratinócitos, fibroblastos ou ambos da pele, mas nenhum protocolo aborda como estabelecer culturas de SCs primários da pele humana. Estudos recentes sugerem que as SCs neuronais modulam os processos celulares querat e fibroblasto e regulam as funções fisiológicas normais da pele7. As SCs são, portanto, críticas à homeostase da pele e contribuem substancialmente para a fisiologia regular que influencia o comportamento dos tipos de células da pele vizinhas presentes8. Portanto, um protocolo que permite o isolamento de cada um desses tipos de células é ideal para experimentos in vitro envolvendo comunicação celular-célula ou conversa cruzada entre tipos de células.
Este protocolo descreve o estabelecimento de culturas celulares individuais de células primárias a partir de um único pedaço de pele. Este protocolo é particularmente útil quando a quantidade de tecido disponível é limitada. Além disso, o isolamento de todos os três tipos de células de um único doador permite comparações robustas entre tipos de células ou experimentos de co-cultura, ao mesmo tempo em que mitiga a influência da genética durante o experimento desejado.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;M sterile filters (Millex-GP Syringe Filter Unit,polyethersulfone)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SLGPR33RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;M cell strainers</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;M cell strainers</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL disposable syringes</td>
			<td>BD Luer-Lok</td>
			<td>BD-309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL disposable syringes (Syringe sterile, single use)</td>
			<td>BD Luer-Lok</td>
			<td>BD309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL disposable syringes</td>
			<td>BD Luer-Lok</td>
			<td>BD305462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% TritonX-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-1L</td>
			<td>Prepared at the time of use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>J19943.K2</td>
			<td>Ready to use and store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td>Prepared at the time of use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemometec Vial1-Cassette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1420193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17018-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12544D 22*50-1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D46693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM basal medium</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>9221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline free from Ca2+ and Mg2+ (DPBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;21-031-CV)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL micro-centrifuge tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-681-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast complete medium</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>2331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11032</td>
			<td>Dilution (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>Dilution (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Buffered Saline Solution (HBSS buffer)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human foreskin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>De-identified human foreskin tissue for research purposes (Institutional Review Board- IRB #17574).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KGM-GOLD keratinocyte medium (KGM gold and supplements)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>00192151 and 00192152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse alpha-smooth muscle actin antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-9760-82</td>
			<td>Dilution (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Cytokeratin14 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7800</td>
			<td>Dilution (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse S100 antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MA5-12969</td>
			<td>Dilution (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi chambered (4 well glass slide)</td>
			<td>Tab-Tek</td>
			<td>154526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoCounter -Via1-Cassette</td>
			<td>Chemometec</td>
			<td>941-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysisne (PLL)</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>32503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Anti-fade Mountant with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit K10 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB4501656</td>
			<td>Dilution (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit p75-NTR antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB1554</td>
			<td>Dilution (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit vimentin</td>
			<td>ProteinTech</td>
			<td>10366-1-AP</td>
			<td>Dilution (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schwann cell culture medium</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>1701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision tweezers DUMONT straight with extra fine tips Dumostar, 5</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>LH75.1</td>
			<td>Sterilize with 70% alcohol before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS Scissors, sharp/sharp. Length 4&#8211;3/8&#34;(111mm)</td>
			<td>Codman</td>
			<td>54-6500</td>
			<td>Sterilize with 70% alcohol before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized surgical - sharp blade (Duro Edge Economy Single Edge Blades)</td>
			<td>Razor blade company</td>
			<td>94-0120</td>
			<td>Sterilize with 70% alcohol before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin neutralization buffer (TNS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Axio Observer 7- Axiocam 506 mono &#8211; Apotome.2 microscope</td>
			<td>For immunofluorescence of chamber slide containing stained cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Primovert</td>
			<td>For visulaizing/observing cell attachment or detachment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and characterization of primary schwann cells, keratinocytes, and fibroblasts from human foreskin

Este protocolo descreve métodos de isolamento, condições de cultivo e caracterização de células primárias humanas com alto rendimento e viabilidade usando rápida dissociação enzimática da pele. Queratinócitos primários, fibroblastos e células Schwann são todos colhidos do prepúcio de recém-nascido humano, que está disponível seguindo o padrão de procedimentos de cuidado. A pele removida é desinfetada, e a gordura subcutânea e músculo são removidos usando um bisturi. O método consiste na separação enzimática e mecânica de camadas epidérmicas e dérmicas, seguida de digestão enzimática adicional para obter suspensões unicelulares de cada uma dessas camadas de pele. Finalmente, as células únicas são cultivadas em meios de cultura celular apropriados seguindo protocolos padrão de cultura celular para manter o crescimento e a viabilidade ao longo de semanas. Em conjunto, este protocolo simples permite o isolamento, acultura e a caracterização dos três tipos de células a partir de um único pedaço de pele para avaliação in vitro de modelos de nervo da pele. Além disso, essas células podem ser usadas juntas em co-culturas para medir seus efeitos uns sobre os outros e suas respostas ao trauma in vitro na forma de arranhões realizados roboticamente na cultura associada à cicatrização de feridas.

O prepúcio neonatal normal foi utilizado para o isolamento de queratinócitos epidérmicos primários e SCs e fibroblastos dérmicos. As células primárias isoladas foram cultivadas em suas respectivas mídias de cultura celular contendo fatores de crescimento. Após a semeadura de SCs e fibroblasto em frascos de cultura, a maioria das células aderiu ao fundo do frasco dentro de 2 h. No caso dos queratinócitos, a maioria dos queratinócitos aderiu por 24h. Os queratinócitos primários epidérmicos isolados atingiram...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin at JoVE.com

Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin

O estudo da cicatrização de feridas associadas à lesão musculoesquelético muitas vezes requer a avaliação de interações in vitro entre células schwann (SCs), queratinócitos e fibroblastos. Este protocolo descreve o isolamento, acultura e a caracterização dessas células primárias do prepúcio humano.

Isolamento, cultura e caracterização de células primárias de schwann, queratinócitos e fibroblastos de Foreskin Humano

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid ...

A pele contém vários tipos de células, incluindo queratinócitos, fibroblastos e células de Schwann nervosas. Este protocolo permite o isolamento de cada um desses tipos de células para experimentos in vitro. O isolamento e o estabelecimento de culturas celulares primárias individuais de um único doador permitem comparações robustas e experimentos de cocultura, ao mesmo tempo em que mitigam os efeitos da variação genética.Com este protocolo, a análise das células individuais e suas interações permite a análise do papel das células schwann na homeostase da pele e na fisiopatologia. Essas populações de células distintas podem ser usadas para estudar células schwann, fibroblastos ou queratinócitos individualmente ou em combinação em fisiologia normal da pele, cicatrização de feridas ou em estados doentes da pele. Jagadeeshaprasad M G, um pós-doutorando no meu laboratório estará me ajudando a demonstrar o procedimento.Após a aquisição do prepúcio neonatal seguindo o padrão de procedimentos assistenciais, coloque o prepúcio excisado em um tubo de micro centrífuga contendo de oito a dez mililitros de meio basal DMEM gelado, e transporte imediatamente a prepúcio para o laboratório de cultura celular para isolamento de células. Enxágüe o prepúcio duas vezes com 20 a 25 mililitros de Salina Tamponada de Fosfato de Dulbecco ou DPBS, contendo antibióticos e antimícticos. Em seguida, mergulhe a pele lavada em 25 a 30 mililitros de meio basal DMEM gelado em um prato de cultura de tecido de 10 centímetros.Após 15 minutos corte o prepúcio aberto usando um bisturi para expor a dermis e o tecido adiposo subcutâneo. Use fórceps, uma lâmina de bisturi e uma tesoura para remover e descartar o tecido adiposo subcutâneo. Em seguida, corte o prepúcio limpo em três a cinco peças menores e incuba as peças de pele em 16 a 20 mililitros de Dispace um meio DMEM em um tubo cônico estéril.Durante os primeiros 30 minutos de incubação com Dispace, misture intermitentemente as peças da pele no tubo cônico por inversão. Em seguida, coloque o tubo cônico a quatro graus Celsius por 16 a 18 horas. No dia seguinte, remova os pedaços da pele e coloque-os em um prato de cultura estéril seco e desenrole cada pedaço de pele para que a camada externa de epiderme esteja tocando o prato de cultura.Começando na borda do tecido, retire a epiderme da derme usando dois conjuntos de fórceps. Adicione os fragmentos separados de epiderme a cinco mililitros de HBS em um prato de cultura de 10 centímetros para incubar à temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida, colete a solução HBS em um tubo cônico de 50 mililitros e adicione cinco mililitros de tampão de neutralização de trypsin ou T e B no tubo cônico.Coloque o tubo de lado. Aos fragmentos epidérmicos no prato de cultura adicione três mililitros de solução trypsin para incubar a 37 graus Celsius por 10 minutos. Após a incubação agitar suavemente os fragmentos epidérmicos com fórceps até que a solução de queratinócitos de trypsin se torne turva.Em seguida, adicione a solução de queratinócito de trypsin ao tubo HBS T e B. Depois de dissolver fragmentos epidérmicos não digdigestos com a solução EDTA trypsin, adicione dois mililitros de FBS ao tubo HBS T e B contendo solução EDTA de trippsina, e centrifugar os dois cerca de 870 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, aspire o supernascer e resuspenha a pelota celular em três mililitros de meio de crescimento completo queratinato, seguido de filtragem da suspensão celular com um filtro estéril de 100 micrômetros em um tubo cônico estéril de 50 mililitros.Uma vez quantificado o número celular e a viabilidade celular, semear as células nas placas de cultura para colocar em uma incubadora a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono. Depois de dois dias aspirar as células não aderidas, e atualizar a mídia de cultura celular a cada dois dias até que os queratinócitos atinjam 50 a 80% de confluência para experiências de passagem ou a jusante. Precoat T25 frascos com poli-l-lysine ou PLL, usando cinco mililitros de DPBS e coloque os frascos pré-revestidos a 37 graus Celsius por três horas.Depois lave a matriz de revestimento PLL duas vezes com DPBS. Depois de lavar os pedaços isolados da derme com cinco mililitros de meio basal DMEM, pique a derme em pequenos pedaços com tesouras. Digerir a dermis picada com cinco mililitros de colagemnase a 37 graus Celsius por duas horas e meia, com titulação suave usando uma ponta de pipeta a cada 30 minutos até que a dermis dissocia completamente.Uma vez digerido, filtre a suspensão celular com um coador de células de 70 micrômetros, seguido de diluição da suspensão celular filtrada com cinco mililitros de meio DMEM completo para parar a atividade enzimática da colagemnase. Em seguida, a centrifugação da suspensão celular a 870 vezes G por cinco minutos à temperatura ambiente e resuspensa a cédula de células em dois mililitros de MMEM meio completo para dividir as células. Depois de repetir o processo de centrificação como descrito, aspire o supernatante para usar a pelota celular para isolar as células ou fibroblastos schwann.Para isolar as células Schwan, resuspenque a pelota celular em cinco mililitros de médio médio fresco DMEM completo e quantifique o número celular e a viabilidade antes de semear cinco mililitros das células resuspended em frascos T25 pré-codificados a uma densidade de 4,0 vezes 10 às três células por mililitro. Incubar o frasco a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após 16 horas confirme a adesão celular por microscopia na ampliação de 10X.Em seguida, remova as células de não adesão e lave o frasco três vezes com cinco mililitros de DPBS. Em seguida, incubar as células com cinco mililitros de 10 arabinoside de citosina micromolar em um meio completo de DMEM. Após 24 horas aspirar a citosina arabinoside contendo meio antes de enxaguar o frasco como demonstrado anteriormente.Rechee o frasco de cultura com cinco mililitros de células Schwann completam o meio de cultura para incubar 48 horas, enquanto refresca o meio a cada dois dias até que as células Schwann atinjam 80% de confluência. Para isolar os fibroblastos, resuspensar a pelota coletada em cinco mililitros de fibroblastos completos. Para cultivar as células em frascos de cultura T25 não codificados por 24 horas, como demonstrado para as células Schwann.Depois de aspirar as células de não adesão e lavar o frasco, incubar as células com cinco mililitros de fibroblastos frescos completos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 48 horas. Como as células primárias isoladas foram cultivadas em suas respectivas mídias de cultura celular, os queratinócitos primários atingiram 85% de confluência no sétimo dia e apresentaram morfologia celular característica com forma de paralelepípedos. As células Schwann atingiram 95% de confluência no quinto dia e pareciam bipolares ou tripolares em forma.As culturas dos fibroblastos atingiram 95% de confluência até o quarto dia e a maioria das células exibiu uma morfologia em forma de fuso. A coloração da imunofluorescência confirmou a expressão proteica específica do tipo celular nas culturas celulares. Os queratinócitos deram positivo para a proteína K10 e K14.As imagens mescladas de imunofluorescência de queratina e coloração nuclear da DAPI indicaram 97,8% de pureza das culturas celulares. Da mesma forma, as células Schwann foram positivas para S100 e P75 NTR e tiveram uma pureza de 95,2% na cultura. Os fibroblastos expressaram positivamente a vimentina, mas não expressaram o músculo alfa liso Actin, um marcador de miofibroblast.A pureza da cultura foi em torno de 97,2% Para melhorar a evidência de Shanse, o prato poli-l-lysine pré-revestido pode ser usado. E para mitigar ainda mais a contaminação fibrosa, o arabinoside citosino e o agente antimíctico foram adicionados após as células terem sido adicionadas por um curto período de tempo. Este é um procedimento experimental simples e barato para estabelecer as três células primárias, como células shwann, queratinócitos e fibroblastos, a partir de uma única pele de fore humana.Este protocolo é ideal para experimentos in vitro envolvendo comunicação celular ou crosstalk entre tipos de células.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

Isolamento e Cultura de células da crista neural-tronco de folículos capilares humanos

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

Neurociência

Isolation and Culture of Human Fungiform Taste Papillae Cells

Isolamento e Cultura de Células Papila fungiforme Humanos Taste

Taste cells are highly specialized, with unique histological, molecular and physiological characteristics that permit detection of a wide range of simple ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Isolamento e cultivo de células da crista neural do tubo neural embrionário murino

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Isolamento e cultura de células endoteliais da Embryonic posencéfalo

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Isolamento, cultura e Long-Term Manutenção da Primária mesencefálico Dopaminergic neurônios dos cérebros de roedores Embryonic

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Isolamento e Cultura de células estaminais adultas neurais do Subcallosal Zona Rato

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Simples geração de uma cultura de alto rendimento de neurônios induzidas de fibroblastos de pele humana adulta

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Caracterização e isolamento de Mouse Microglia primária por centrifugação gradiente de densidade

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Isolamento de gânglios das raízes dorsais e cultura primária para estudar a liberação de neurotransmissores

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

Cultura primária de neurônios isolados do cerebelo embrionário do rato

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...