Name: isolation, culture, and characterization of primary schwann cells, keratinocytes, and fibroblasts from human foreskin
Uploaded: 2022-03-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить д-ра Фадию Камаль и д-ра Рейада Эльбарбари за то, что они позволили нам использовать лабораторные инструменты и техническую поддержку. Эта работа была поддержана грантами NIH (K08 AR060164-01A) и DOD (W81XWH-16-1-0725) J. C. E. в дополнение к институциональной поддержке со стороны Медицинского центра Херши Университета штата Пенсильвания.

Приобретение и использование деидентифицированной ткани крайней плоти человека в исследовательских целях было рассмотрено и получило определение «не человеческих исследований» Советом по институциональному обзору Медицинского колледжа штата Пенсильвания (IRB #17574).
П?...

<ol>
	<li>Hawksworth, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+disadvantages+of+using+human+cells+for+pharmacological+and+toxicological+studies.">Advantages and disadvantages of using human cells for pharmacological and toxicological studies.</a> Human &amp; Experimental Toxicology. 13 (8), 568-573 (1994).</li><li>Green, H., Kehinde, O., Thomas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+cultured+human+epidermal+cells+into+multiple+epithelia+suitable+for+grafting.">Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (11), 5665-5668 (1979).</li><li>Fuchs, E., Green, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+keratin+gene+expression+during+terminal+differentiation+of+the+keratinocyte.">Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocyte.</a> Cell. 19 (4), 1033-1042 (1980).</li><li>Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+cultivation+of+human+keratinocytes+from+skin+or+plucked+hair+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells.">Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).</li><li>Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+primary+adult+fibroblast+cultures+from+rodents.">Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2033 (2010).</li><li>Belviso, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+adult+human+dermal+fibroblasts+from+abdominal+skin+and+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+using+a+non-integrating+method.">Isolation of adult human dermal fibroblasts from abdominal skin and generation of induced pluripotent stem cells using a non-integrating method.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60629 (2020).</li><li>Silva, W. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Schwann+cells+in+cutaneous+wound+healing.">Role of Schwann cells in cutaneous wound healing.</a> Wound Repair and Regeneration. 26 (5), 392-397 (2018).</li><li>Bray, E. R., Cheret, J., Yosipovitch, G., Paus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cells+as+underestimated,+major+players+in+human+skin+physiology+and+pathology.">Schwann cells as underestimated, major players in human skin physiology and pathology.</a> Experimental Dermatology. 29 (1), 93-101 (2020).</li><li>Laverdet, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+innervation:+important+roles+during+normal+and+pathological+cutaneous+repair.">Skin innervation: important roles during normal and pathological cutaneous repair.</a> Histology and Histopathology. 30 (8), 875-892 (2015).</li><li>Jessen, K. R., Mirsky, R., Lloyd, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cells:+Development+and+role+in+nerve+repair.">Schwann cells: Development and role in nerve repair.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (7), 020487 (2015).</li><li>Bentley, C. A., Lee, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p75+is+important+for+axon+growth+and+Schwann+cell+migration+during+development.">p75 is important for axon growth and Schwann cell migration during development.</a> The Journal of Neuroscience. 20 (20), 7706-7715 (2000).</li><li>Rutkowski, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signals+for+proinflammatory+cytokine+secretion+by+human+Schwann+cells.">Signals for proinflammatory cytokine secretion by human Schwann cells.</a> Journal of Neuroimmunology. 101 (1), 47-60 (1999).</li><li>Kumar, A., Brockes, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+dependence+in+tissue,+organ,+and+appendage+regeneration.">Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration.</a> Trends in Neurosciences. 35 (11), 691-699 (2012).</li><li>Balakrishnan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+role+and+potential+of+Schwann+cells+for+peripheral+nerve+repair+from+studies+of+development+and+injury.">Insights into the role and potential of Schwann cells for peripheral nerve repair from studies of development and injury.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 608442 (2020).</li><li>Gresset, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boundary+caps+give+rise+to+neurogenic+stem+cells+and+terminal+glia+in+the+skin.">Boundary caps give rise to neurogenic stem cells and terminal glia in the skin.</a> Stem Cell Reports. 5 (2), 278-290 (2015).</li><li>Stratton, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+Schwann+cells+from+adult+human+skin+and+nerve.">Purification and characterization of Schwann cells from adult human skin and nerve.</a> eNeuro. 4 (3), (2017).</li></ol>

Этот протокол описывает метод выделения трех различных клеточных популяций из одного куска крайней плоти, а именно кератиноцитов, фибробластов и шванновских клеток. Существует несколько протоколов изоляции для выделения кератиноцитов и фибробластов 2,3,5,6<...

Первичные клетки, полученные из живой ткани и культивируемые в условиях in vitro , очень похожи на физиологическое состояние1, что делает их идеальной моделью для исследования физиологических и патофизиологических процессов. Кожа содержит несколько типов клеток, включая кератиноциты, фибробласты, себоциты, меланоциты и шванновские клетки (SCs), которые могут быть выделены и культивированы для экспериментов in vitro . Методы выделения и культивирования кератиноцитов, фибробластов и СК из одного куска кожи не были описаны. Цель этого протокола двояка: 1) установить надежный и воспроизводимый метод выделения и культивирования кожных СК и 2) использовать эффективный, надежный метод выделения кератиноцитов, фибробластов и СК из одной крайней плоти человека.
В настоящее время существуют установленные протоколы выделения кератиноцитов кожи 2,3,4 и фибробластов 5,6. Эти исследования описывают выделение кератиноцитов, фибробластов или обоих из кожи, но ни в одном протоколе не рассматривается, как создавать культуры первичных СК из кожи человека. Недавние исследования показывают, что нейронные СК модулируют клеточные процессы кератиноцитов и фибробластов и регулируют нормальные физиологические функции кожи7. Таким образом, SCs имеют решающее значение для гомеостаза кожи и вносят существенный вклад в физиологию регулирования, которая влияет на поведение соседних типов клеток кожи, присутствующих8. Поэтому протокол, который позволяет изолировать каждый из этих типов клеток, идеально подходит для экспериментов in vitro, включающих клеточную связь или перекрестные разговоры между типами клеток.
Этот протокол описывает создание отдельных клеточных культур первичных клеток из одного куска кожи. Этот протокол особенно полезен, когда количество доступной ткани ограничено. Кроме того, выделение всех трех типов клеток от одного донора позволяет проводить надежные сравнения между типами клеток или экспериментами с кокультурой, одновременно смягчая влияние генетики во время желаемого эксперимента.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;M sterile filters (Millex-GP Syringe Filter Unit,polyethersulfone)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SLGPR33RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;M cell strainers</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;M cell strainers</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL disposable syringes</td>
			<td>BD Luer-Lok</td>
			<td>BD-309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL disposable syringes (Syringe sterile, single use)</td>
			<td>BD Luer-Lok</td>
			<td>BD309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL disposable syringes</td>
			<td>BD Luer-Lok</td>
			<td>BD305462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% TritonX-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-1L</td>
			<td>Prepared at the time of use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>J19943.K2</td>
			<td>Ready to use and store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td>Prepared at the time of use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemometec Vial1-Cassette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1420193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17018-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12544D 22*50-1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D46693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM basal medium</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>9221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline free from Ca2+ and Mg2+ (DPBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;21-031-CV)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL micro-centrifuge tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-681-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast complete medium</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>2331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11032</td>
			<td>Dilution (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>Dilution (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Buffered Saline Solution (HBSS buffer)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human foreskin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>De-identified human foreskin tissue for research purposes (Institutional Review Board- IRB #17574).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KGM-GOLD keratinocyte medium (KGM gold and supplements)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>00192151 and 00192152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse alpha-smooth muscle actin antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-9760-82</td>
			<td>Dilution (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Cytokeratin14 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7800</td>
			<td>Dilution (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse S100 antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MA5-12969</td>
			<td>Dilution (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi chambered (4 well glass slide)</td>
			<td>Tab-Tek</td>
			<td>154526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoCounter -Via1-Cassette</td>
			<td>Chemometec</td>
			<td>941-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysisne (PLL)</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>32503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Anti-fade Mountant with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit K10 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB4501656</td>
			<td>Dilution (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit p75-NTR antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB1554</td>
			<td>Dilution (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit vimentin</td>
			<td>ProteinTech</td>
			<td>10366-1-AP</td>
			<td>Dilution (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schwann cell culture medium</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>1701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision tweezers DUMONT straight with extra fine tips Dumostar, 5</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>LH75.1</td>
			<td>Sterilize with 70% alcohol before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS Scissors, sharp/sharp. Length 4&#8211;3/8&#34;(111mm)</td>
			<td>Codman</td>
			<td>54-6500</td>
			<td>Sterilize with 70% alcohol before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized surgical - sharp blade (Duro Edge Economy Single Edge Blades)</td>
			<td>Razor blade company</td>
			<td>94-0120</td>
			<td>Sterilize with 70% alcohol before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin neutralization buffer (TNS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Axio Observer 7- Axiocam 506 mono &#8211; Apotome.2 microscope</td>
			<td>For immunofluorescence of chamber slide containing stained cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Primovert</td>
			<td>For visulaizing/observing cell attachment or detachment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and characterization of primary schwann cells, keratinocytes, and fibroblasts from human foreskin

Этот протокол описывает методы изоляции, условия культивирования и характеристику первичных клеток человека с высоким выходом и жизнеспособностью с использованием быстрой ферментативной диссоциации кожи. Первичные кератиноциты, фибробласты и шванновские клетки собираются из крайней плоти новорожденного человека, которая доступна в соответствии со стандартными процедурами ухода. Удаленная кожа дезинфицируется, а подкожный жир и мышцы удаляются с помощью скальпеля. Метод состоит из ферментативного и механического разделения эпидермального и дермального слоев с последующим дополнительным ферментативным перевариванием для получения одноклеточных суспензий из каждого из этих слоев кожи. Наконец, одиночные клетки выращиваются в соответствующих средах клеточных культур в соответствии со стандартными протоколами клеточной культуры для поддержания роста и жизнеспособности в течение нескольких недель. Вместе этот простой протокол позволяет выделять, культивировать и характеризовать все три типа клеток из одного куска кожи для оценки in vitro моделей кожи-нерва. Кроме того, эти клетки могут быть использованы вместе в кокультурах для оценки их воздействия друг на друга и их реакций на травму in vitro в виде царапин, выполненных роботизированно в культуре, связанной с заживлением ран.

Нормальная неонатальная крайняя плоть использовалась для выделения первичных эпидермальных кератиноцитов и кожных СК и фибробластов. Изолированные первичные клетки культивировали в соответствующих клеточных культуральных средах, содержащих факторы роста. После посева СК и фибробл...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin at JoVE.com

Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin

Изучение заживления ран, связанных с повреждением опорно-двигательного аппарата, часто требует оценки взаимодействий in vitro между шванновскими клетками (SCs), кератиноцитами и фибробластами. Этот протокол описывает выделение, культивирование и характеристику этих первичных клеток из крайней плоти человека.

Выделение, культивирование и характеристика первичных шванновских клеток, кератиноцитов и фибробластов из крайней плоти человека

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid ...

Кожа содержит несколько типов клеток, включая кератиноциты, фибробласты и нервные шванновские клетки. Этот протокол позволяет выделить каждый из этих типов клеток для экспериментов in vitro. Выделение и создание отдельных первичных клеточных культур от одного донора позволяет проводить надежные сравнения и эксперименты с кокультурами, одновременно смягчая последствия генетической изменчивости.С помощью этого протокола анализ отдельных клеток и их взаимодействий позволяет проанализировать роль шванновских клеток в гомеостазе кожи и патофизиологии. Эти различные клеточные популяции могут быть использованы для изучения шванновских клеток, фибробластов или кератиноцитов по отдельности или в комбинации в нормальной физиологии кожи, заживлении ран или в болезненных состояниях кожи. Jagadeeshaprasad M G, постдокторант в моей лаборатории, будет помогать мне в демонстрации процедуры.После приобретения крайней плоти новорожденного в соответствии со стандартными процедурами ухода поместите иссеченную крайнюю плоть в микроцентрифужную трубку, содержащую от восьми до 10 миллилитров ледяной базальной среды DMEM, и немедленно транспортируйте крайнюю плоть в лабораторию клеточной культуры для изоляции клеток. Дважды промойте крайнюю плоть 20-25 миллилитрами фосфатного буферного физиологического раствора Dulbecco или DPBS, содержащего антибиотики и антимикотические средства. Затем замочите вымытую кожу в 25-30 миллилитрах ледяной базальной среды DMEM в 10-сантиметровой чашке для культивирования тканей.Через 15 минут разрезайте крайнюю плоть скальпелем, чтобы обнажить дерму и подкожную жировую клетчатку. Используйте щипцы, лезвие скальпеля и ножницы, чтобы удалить и отбросить подкожную жировую клетчатку. Затем разрежьте чистую крайнюю плоть на три-пять более мелких кусочков и высиживайте кусочки кожи в 16-20 миллилитрах Dispace одной среды DMEM в стерильной конической трубке.В течение первых 30 минут инкубации с Dispace периодически смешивают кусочки кожи в конической трубке путем инверсии. Затем поместите коническую трубку при четырех градусах Цельсия на 16-18 часов. На следующий день удалите кусочки кожи и поместите их на сухую стерильную чашку для культивирования и разверните каждый кусочек кожи так, чтобы внешний слой эпидермиса касался чашки культуры.Начиная с края ткани отшелушивают эпидермис от дермы с помощью двух наборов щипцов. Добавьте отделенные фрагменты эпидермиса к пяти миллилитрам HBS в 10-сантиметровую культуральную чашку для инкубации при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем собирают раствор HBS в коническую трубку объемом 50 миллилитров и добавляют пять миллилитров буфера нейтрализации трипсина или T и B в коническую трубку.Отложите трубку в сторону. К эпидермальным фрагментам в культуральной посуде добавляют три миллилитра раствора трипсина для инкубации при 37 градусах Цельсия в течение 10 минут. После инкубации осторожно перемешивают эпидермальные фрагменты щипцами до тех пор, пока раствор трипсина кератиноцитов не станет мутным.Далее добавляют раствор трипсина кератиноцитов в трубку HBS T и B. После растворения непереваренных эпидермальных фрагментов раствором трипсина ЭДТА добавьте два миллилитра FBS в трубку HBS T и B, содержащую раствор трипсина ЭДТА, и центрифугируйте их примерно в 870 раз G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Затем аспирируют супернатант и повторно суспендируют клеточную гранулу в трех миллилитрах кератиноцитарной полной питательной среды с последующей фильтрацией клеточной суспензии стерильным 100-микрометровым фильтром в стерильную коническую трубку объемом 50 миллилитров.Как только количество клеток и жизнеспособность клеток количественно определены, посейте клетки в культуральных пластинах, чтобы поместить их в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия в 5% углекислого газа. Через два дня аспирируйте неприлипшие клетки и обновляйте среду культивирования клеток через день, пока кератиноциты не достигнут 50-80% слияния для проходных или последующих экспериментов. Фляги Precoat T25 с поли-l-лизином или ФАПЧ, используя пять миллилитров DPBS и поместите предварительно покрытые колбы при 37 градусах Цельсия в течение трех часов.Затем дважды промыть матрицу покрытия ФАПЧ с помощью DPBS. После промывания изолированных кусочков дермы пятью миллилитрами базальной среды ДМЭМ измельчите дерму на мелкие кусочки ножницами. Переваривайте измельченную дерму пятью миллилитрами коллагеназы при 37 градусах Цельсия в течение двух с половиной часов, с мягким титрованием с использованием наконечника пипетки каждые 30 минут, пока дерма полностью не диссоциирует.После переваривания фильтруйте клеточную суспензию с помощью 70-микрометрового клеточного ситечка с последующим разбавлением фильтрованной клеточной суспензии пятью миллилитрами полной среды DMEM, чтобы остановить ферментативную активность коллагеназы. Затем центрифугируют суспензию ячейки в 870 раз G в течение пяти минут при комнатной температуре и повторно суспендируют ячейку бюллетеня в двух миллилитрах DMEM полной среды для деления клеток. После повторения процесса центрификации, как описано, аспирируйте супернатант, чтобы использовать клеточную гранулу для выделения шванновских клеток или фибробластов.Чтобы изолировать швановские клетки, повторно суспендируют клеточную гранулу в пяти миллилитрах свежей полной среды DMEM и количественно оценят количество клеток и жизнеспособность перед посевом пяти миллилитров повторно суспендированных клеток в предварительно закодированные колбы T25 с плотностью от 4,0 раз 10 до трех клеток на миллилитр. Инкубируйте колбу при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. Через 16 часов подтверждают адгезию клеток с помощью микроскопии при 10-кратном увеличении.Затем удалите неадгезионные клетки и трижды промыть колбу пятью миллилитрами DPBS. Затем инкубируют клетки с пятью миллилитрами 10 микромолярного цитозина арабинозида в полной среде DMEM. Через 24 часа аспирируйте цитозинарабинозид, содержащую среду, прежде чем промывать колбу, как было показано ранее.Наполните культуральную колбу пятью миллилитрами шванновских клеток полной питательной среды для инкубации 48 часов, одновременно обновляя среду через день, пока шванновские клетки не достигнут 80% конфлюзии. Чтобы выделить фибробласты, повторно суспендируют собранную гранулу в пяти миллилитрах фибробластов полной среды. Культивировать клетки в некодированных колбах для культивирования Т25 в течение 24 часов, как показано для шванновских клеток.После аспирации неадгезивных клеток и промывки колбы, инкубируют клетки с пятью миллилитрами свежих фибробластов полной среды при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение 48 часов. Поскольку изолированные первичные клетки культивировали в соответствующих клеточных культуральных средах, первичные кератиноциты достигали 85% слияния к седьмому дню и демонстрировали характерную морфологию клеток с булыжной формой. Шванновские клетки достигли 95% слияния к пятому дню и казались биполярными или триполярными по форме.Культуры фибробластов достигли 95% слияния к четвертому дню, и большинство клеток демонстрировали морфологию формы веретена. Иммунофлуоресцентное окрашивание подтвердило экспрессию белка специфического типа клеток в клеточных культурах. Кератиноциты были положительными для белка K10 и K14.Объединенные изображения иммунофлуоресценции кератина и ядерного окрашивания DAPI показали чистоту клеточных культур 97,8%. Аналогичным образом, шванновские клетки были положительными для S100 и P75 NTR и имели чистоту 95,2% в культуре. Фибробласты положительно экспрессировали виментин, но не экспрессировали альфа-гладкомышечный актин, маркер миофибробластов.Чистота культуры составляла около 97,2% Чтобы усилить доказательства Shanse, можно использовать предварительно покрытое поли-l-лизиновое блюдо. А для дальнейшего смягчения волокнистого загрязнения цитозин арабинозид и антимикотический агент были добавлены после того, как клетки добавились в течение короткого времени. Это простая недорогая экспериментальная процедура для установления трех первичных клеток, таких как клетки шванна, кератиноциты и фибробласты, из одной передней кожи человека.Этот протокол идеально подходит для экспериментов in vitro, включающих клеточную связь или перекрестные помехи между типами клеток.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

Выделение и культуры нервного гребня стволовых клеток из человеческих волоса

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

Isolation and Culture of Human Fungiform Taste Papillae Cells

Выделение и культуры клеток человека Вкус Fungiform Сосочки

Taste cells are highly specialized, with unique histological, molecular and physiological characteristics that permit detection of a wide range of simple ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Выделение и культуры клеток нервного гребня из эмбриональных мышей нервной трубки

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Выделение и культуры эндотелиальных клеток из эмбриональных переднего мозга

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Изоляция, культуры и долгосрочного поддержания первичного теменной дофаминергических нейронов из эмбриональных грызунов Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Выделение и культуры взрослых нервные стволовые клетки от мыши зоны расположенный под мозолистым телом

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Простая генерация высокой урожайности культуры искусственных нейронов из фибробластов кожи взрослого человека

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Характеристика и изоляция первичной микроглии мыши по плотности градиентного центрифугирования

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Спинной корень ганглиев изоляции и основной культуры для изучения нейромедиатора релиз

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

Первичная культура нейронов, изолированных от эмбриональной мыши Cerebellum

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...