Name: isolation, culture, and characterization of primary schwann cells, keratinocytes, and fibroblasts from human foreskin
Uploaded: 2022-03-23T15:00:00
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Nos gustaría agradecer a la Dra. Fadia Kamal y al Dr. Reyad Elbarbary por permitirnos utilizar instrumentos de laboratorio y soporte técnico. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los NIH (K08 AR060164-01A) y el DOD (W81XWH-16-1-0725) a J. C. E., además del apoyo institucional del Centro Médico Hershey de la Universidad Estatal de Pensilvania.

La adquisición y el uso de tejido del prepucio humano no identificado con fines de investigación fue revisado y recibió la determinación de "investigación no humana" por la Junta de Revisión Institucional de la Facultad de Medicina de Penn State (IRB # 17574).
NOTA: Siguiendo el siguiente protocolo, se obtienen 2,4 x 106 queratinocitos, 4,4 x 106 fibroblastos y 1,1 x 106 SC de un solo prepucio. En general, estas células primarias se pueden utilizar para ...

<ol>
	<li>Hawksworth, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+disadvantages+of+using+human+cells+for+pharmacological+and+toxicological+studies.">Advantages and disadvantages of using human cells for pharmacological and toxicological studies.</a> Human &amp; Experimental Toxicology. 13 (8), 568-573 (1994).</li><li>Green, H., Kehinde, O., Thomas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+cultured+human+epidermal+cells+into+multiple+epithelia+suitable+for+grafting.">Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (11), 5665-5668 (1979).</li><li>Fuchs, E., Green, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+keratin+gene+expression+during+terminal+differentiation+of+the+keratinocyte.">Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocyte.</a> Cell. 19 (4), 1033-1042 (1980).</li><li>Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+cultivation+of+human+keratinocytes+from+skin+or+plucked+hair+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells.">Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).</li><li>Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+primary+adult+fibroblast+cultures+from+rodents.">Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2033 (2010).</li><li>Belviso, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+adult+human+dermal+fibroblasts+from+abdominal+skin+and+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+using+a+non-integrating+method.">Isolation of adult human dermal fibroblasts from abdominal skin and generation of induced pluripotent stem cells using a non-integrating method.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60629 (2020).</li><li>Silva, W. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Schwann+cells+in+cutaneous+wound+healing.">Role of Schwann cells in cutaneous wound healing.</a> Wound Repair and Regeneration. 26 (5), 392-397 (2018).</li><li>Bray, E. R., Cheret, J., Yosipovitch, G., Paus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cells+as+underestimated,+major+players+in+human+skin+physiology+and+pathology.">Schwann cells as underestimated, major players in human skin physiology and pathology.</a> Experimental Dermatology. 29 (1), 93-101 (2020).</li><li>Laverdet, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+innervation:+important+roles+during+normal+and+pathological+cutaneous+repair.">Skin innervation: important roles during normal and pathological cutaneous repair.</a> Histology and Histopathology. 30 (8), 875-892 (2015).</li><li>Jessen, K. R., Mirsky, R., Lloyd, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cells:+Development+and+role+in+nerve+repair.">Schwann cells: Development and role in nerve repair.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (7), 020487 (2015).</li><li>Bentley, C. A., Lee, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p75+is+important+for+axon+growth+and+Schwann+cell+migration+during+development.">p75 is important for axon growth and Schwann cell migration during development.</a> The Journal of Neuroscience. 20 (20), 7706-7715 (2000).</li><li>Rutkowski, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signals+for+proinflammatory+cytokine+secretion+by+human+Schwann+cells.">Signals for proinflammatory cytokine secretion by human Schwann cells.</a> Journal of Neuroimmunology. 101 (1), 47-60 (1999).</li><li>Kumar, A., Brockes, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+dependence+in+tissue,+organ,+and+appendage+regeneration.">Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration.</a> Trends in Neurosciences. 35 (11), 691-699 (2012).</li><li>Balakrishnan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+role+and+potential+of+Schwann+cells+for+peripheral+nerve+repair+from+studies+of+development+and+injury.">Insights into the role and potential of Schwann cells for peripheral nerve repair from studies of development and injury.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 608442 (2020).</li><li>Gresset, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boundary+caps+give+rise+to+neurogenic+stem+cells+and+terminal+glia+in+the+skin.">Boundary caps give rise to neurogenic stem cells and terminal glia in the skin.</a> Stem Cell Reports. 5 (2), 278-290 (2015).</li><li>Stratton, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+Schwann+cells+from+adult+human+skin+and+nerve.">Purification and characterization of Schwann cells from adult human skin and nerve.</a> eNeuro. 4 (3), (2017).</li></ol>

Este protocolo describe un método para aislar tres poblaciones celulares distintas de una sola pieza del prepucio, a saber, queratinocitos, fibroblastos y células de Schwann. Existen algunos protocolos de aislamiento disponibles para aislar queratinocitos y fibroblastos 2,3,5,6, pero ninguno describe el aislamiento SC. Además de las células estructurales clave en la piel, los queratinocitos...

Las células primarias derivadas de tejido vivo y cultivadas en condiciones in vitro se asemejan mucho al estado fisiológico1, lo que las convierte en un modelo ideal para investigar procesos fisiológicos y fisiopatológicos. La piel contiene múltiples tipos de células, incluyendo queratinocitos, fibroblastos, sebocitos, melanocitos y células de Schwann (SC), que pueden aislarse y cultivarse para experimentos in vitro . No se han descrito métodos para aislar y cultivar queratinocitos, fibroblastos y SC, a partir de una sola pieza de piel. El objetivo de este protocolo es doble: 1) establecer un método confiable y reproducible para el aislamiento y cultivo de SC dérmicos y 2) utilizar un método eficiente y robusto para el aislamiento de queratinocitos, fibroblastos y SC de un solo prepucio humano.
En la actualidad, existen protocolos establecidos para aislar queratinocitos cutáneos 2,3,4 y fibroblastos 5,6. Estos estudios describen el aislamiento de queratinocitos, fibroblastos o ambos de la piel, pero ningún protocolo aborda cómo establecer cultivos de SC primarios de piel humana. Estudios recientes sugieren que los SC neuronales modulan los procesos celulares de queratinocitos y fibroblastos y regulan las funciones fisiológicas normales de la piel7. Por lo tanto, los SC son críticos para la homeostasis de la piel y contribuyen sustancialmente a la fisiología reguladora que influye en el comportamiento de los tipos de células de la piel vecinas presentes8. Por lo tanto, un protocolo que permita el aislamiento de cada uno de estos tipos de células es ideal para experimentos in vitro que involucren la comunicación célula-célula o la diafonía entre tipos de células.
Este protocolo describe el establecimiento de cultivos celulares individuales de células primarias a partir de una sola pieza de piel. Este protocolo es particularmente útil cuando la cantidad de tejido disponible es limitada. Además, el aislamiento de los tres tipos de células de un solo donante permite comparaciones sólidas entre tipos de células o experimentos de cocultivo, al tiempo que mitiga la influencia de la genética durante el experimento deseado.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;M sterile filters (Millex-GP Syringe Filter Unit,polyethersulfone)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SLGPR33RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;M cell strainers</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;M cell strainers</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL disposable syringes</td>
			<td>BD Luer-Lok</td>
			<td>BD-309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL disposable syringes (Syringe sterile, single use)</td>
			<td>BD Luer-Lok</td>
			<td>BD309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL disposable syringes</td>
			<td>BD Luer-Lok</td>
			<td>BD305462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% TritonX-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-1L</td>
			<td>Prepared at the time of use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>J19943.K2</td>
			<td>Ready to use and store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td>Prepared at the time of use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemometec Vial1-Cassette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1420193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17018-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12544D 22*50-1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D46693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM basal medium</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>9221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline free from Ca2+ and Mg2+ (DPBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;21-031-CV)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL micro-centrifuge tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-681-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast complete medium</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>2331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11032</td>
			<td>Dilution (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>Dilution (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Buffered Saline Solution (HBSS buffer)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human foreskin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>De-identified human foreskin tissue for research purposes (Institutional Review Board- IRB #17574).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KGM-GOLD keratinocyte medium (KGM gold and supplements)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>00192151 and 00192152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse alpha-smooth muscle actin antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-9760-82</td>
			<td>Dilution (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Cytokeratin14 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7800</td>
			<td>Dilution (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse S100 antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MA5-12969</td>
			<td>Dilution (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi chambered (4 well glass slide)</td>
			<td>Tab-Tek</td>
			<td>154526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoCounter -Via1-Cassette</td>
			<td>Chemometec</td>
			<td>941-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysisne (PLL)</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>32503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Anti-fade Mountant with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit K10 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB4501656</td>
			<td>Dilution (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit p75-NTR antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB1554</td>
			<td>Dilution (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit vimentin</td>
			<td>ProteinTech</td>
			<td>10366-1-AP</td>
			<td>Dilution (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schwann cell culture medium</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>1701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision tweezers DUMONT straight with extra fine tips Dumostar, 5</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>LH75.1</td>
			<td>Sterilize with 70% alcohol before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS Scissors, sharp/sharp. Length 4&#8211;3/8&#34;(111mm)</td>
			<td>Codman</td>
			<td>54-6500</td>
			<td>Sterilize with 70% alcohol before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized surgical - sharp blade (Duro Edge Economy Single Edge Blades)</td>
			<td>Razor blade company</td>
			<td>94-0120</td>
			<td>Sterilize with 70% alcohol before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin neutralization buffer (TNS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Axio Observer 7- Axiocam 506 mono &#8211; Apotome.2 microscope</td>
			<td>For immunofluorescence of chamber slide containing stained cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Primovert</td>
			<td>For visulaizing/observing cell attachment or detachment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and characterization of primary schwann cells, keratinocytes, and fibroblasts from human foreskin

Este protocolo describe los métodos de aislamiento, las condiciones de cultivo y la caracterización de células primarias humanas con alto rendimiento y viabilidad utilizando la disociación enzimática rápida de la piel. Los queratinocitos primarios, los fibroblastos y las células de Schwann se extraen del prepucio del recién nacido humano, que está disponible siguiendo los procedimientos estándar de atención. La piel extraída se desinfecta y la grasa subcutánea y el músculo se eliminan con un bisturí. El método consiste en la separación enzimática y mecánica de las capas epidérmicas y dérmicas, seguida de una digestión enzimática adicional para obtener suspensiones unicelulares de cada una de estas capas de la piel. Finalmente, las células individuales se cultivan en medios de cultivo celular apropiados siguiendo los protocolos estándar de cultivo celular para mantener el crecimiento y la viabilidad durante semanas. Juntos, este protocolo simple permite el aislamiento, el cultivo y la caracterización de los tres tipos de células a partir de una sola pieza de piel para la evaluación in vitro de modelos de nervios de la piel. Además, estas células se pueden usar juntas en cocultivos para medir sus efectos entre sí y sus respuestas al trauma in vitro en forma de arañazos realizados robóticamente en el cultivo asociado con la cicatrización de heridas.

Se utilizó el prepucio neonatal normal para el aislamiento de queratinocitos epidérmicos primarios y SC y fibroblastos dérmicos. Las células primarias aisladas se cultivaron en los respectivos medios de cultivo celular que contenían factores de crecimiento. Después de la siembra de SC y fibroblastos en matraces de cultivo, la mayoría de las células se adhirieron al fondo del matraz dentro de las 2 h. En el caso de los queratinocitos, la mayoría de los queratinocitos se adhirieron por 24 h. Los queratinocitos pri...

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Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin

El estudio de la cicatrización de heridas asociada con la lesión musculoesquelética a menudo requiere la evaluación de las interacciones in vitro entre las células de Schwann (SC), los queratinocitos y los fibroblastos. Este protocolo describe el aislamiento, cultivo y caracterización de estas células primarias del prepucio humano.

Aislamiento, cultivo y caracterización de células primarias de Schwann, queratinocitos y fibroblastos del prepucio humano

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid ...

La piel contiene múltiples tipos de células, incluyendo queratinocitos, fibroblastos y células nerviosas de Schwann. Este protocolo permite el aislamiento de cada uno de estos tipos de células para experimentos in vitro. El aislamiento y el establecimiento de cultivos celulares primarios individuales de un solo donante permite comparaciones sólidas y experimentos de cocultivo, al tiempo que mitiga los efectos de la variación genética.Con este protocolo, el análisis de células individuales y sus interacciones permite el análisis del papel de las células de Schwann en la homeostasis de la piel y la fisiopatología. Estas distintas poblaciones celulares se pueden utilizar para estudiar células de Schwann, fibroblastos o queratinocitos, ya sea individualmente o en combinación en la fisiología normal de la piel, la cicatrización de heridas o en estados enfermos de la piel. Jagadeeshaprasad M G, un becario postdoctoral en mi laboratorio, me ayudará a demostrar el procedimiento.Después de adquirir el prepucio neonatal siguiendo los procedimientos estándar de atención, coloque el prepucio extirpado en un tubo de micro centrífuga que contenga de ocho a 10 mililitros de medio basal DMEM helado y transporte inmediatamente el prepucio al laboratorio de cultivo celular para el aislamiento celular. Enjuague el prepucio dos veces con 20 a 25 mililitros de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco o DPBS, que contenga antibióticos y antimicóticos. Luego remoje la piel lavada en 25 a 30 mililitros de medio basal DMEM helado en un plato de cultivo de tejidos de 10 centímetros.Después de 15 minutos, corte el prepucio abierto con un bisturí para exponer la dermis y el tejido adiposo subcutáneo. Use fórceps, una cuchilla de bisturí y tijeras para extraer y desechar el tejido adiposo subcutáneo. Luego corte el prepucio limpio en tres a cinco piezas más pequeñas e incube las piezas de piel en 16 a 20 mililitros de Dispace un medio DMEM en un tubo cónico estéril.Durante los primeros 30 minutos de incubación con Dispace se mezclan intermitentemente las piezas de piel en el tubo cónico por inversión. Luego coloque el tubo cónico a cuatro grados centígrados durante 16 a 18 horas. Al día siguiente retire los trozos de piel y colóquelos en un plato de cultivo estéril seco y desenrolle cada trozo de piel para que la capa externa de la epidermis esté tocando el plato de cultivo.Comenzando en el borde del tejido, pelar la epidermis lejos de la dermis usando dos juegos de fórceps. Agregue los fragmentos separados de la epidermis a cinco mililitros de HBS en un plato de cultivo de 10 centímetros para incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego recoja la solución de HBS en un tubo cónico de 50 mililitros y agregue cinco mililitros de tampón de neutralización de tripsina o T y B en el tubo cónico.Deje el tubo a un lado. A los fragmentos epidérmicos en el plato de cultivo agregue tres mililitros de solución de tripsina para incubar a 37 grados centígrados durante 10 minutos. Después de la incubación, agite suavemente los fragmentos epidérmicos con fórceps hasta que la solución de queratinocitos de tripsina se vuelva turbia.A continuación, agregue la solución de queratinocitos de tripsina al tubo HBS T y B. Después de disolver fragmentos epidérmicos no digeridos con solución de tripsina EDTA, agregue dos mililitros de FBS al tubo HBS T y B que contiene la solución de TRIPSina EDTA, y centrífuga los dos aproximadamente 870 veces G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Luego aspire el sobrenadante y resuspenda el gránulo celular en tres mililitros de medio de crecimiento completo de queratinocitos, seguido de la filtración de la suspensión celular con un filtro estéril de 100 micrómetros en un tubo cónico estéril de 50 mililitros.Una vez cuantificado el número de células y la viabilidad celular, sembra las células en las placas de cultivo para colocarlas en una incubadora a 37 grados centígrados en dióxido de carbono al 5%. Después de dos días, aspire las células no adheridas y actualice los medios de cultivo celular cada dos días hasta que los queratinocitos alcancen entre el 50 y el 80% de confluencia para experimentos de paso o aguas abajo. Precoat T25 matraces con poli-l-lisina o PLL, utilizando cinco mililitros de DPBS y colocar los matraces preestucados a 37 grados centígrados durante tres horas.Posteriormente lave la matriz de recubrimiento PLL dos veces con DPBS. Después de lavar las piezas aisladas de la dermis con cinco mililitros de medio basal DMEM, picar la dermis en trozos pequeños con tijeras. Digiera la dermis picada con cinco mililitros de colagenasa a 37 grados centígrados durante dos horas y media, con una titulación suave con una punta de pipeta cada 30 minutos hasta que la dermis se disocie por completo.Una vez digerida, filtre la suspensión celular con un colador celular de 70 micrómetros, seguido de la dilución de la suspensión celular filtrada con cinco mililitros de medio DMEM completo para detener la actividad enzimática de la colagenasa. A continuación, centrifugue la suspensión celular a 870 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente y resusponga la boleta celular en dos mililitros de medio completo DMEM para dividir las células. Después de repetir el proceso de centrificación como se describe, aspire el sobrenadante para usar el pellet celular para aislar las células de Schwann o fibroblastos.Para aislar las células de Schwan, resuspenda la gránula celular en cinco mililitros de medio completo DMEM fresco y cuantificar el número de células y la viabilidad antes de sembrar cinco mililitros de las células resuspendidas en matraces T25 precodificados a una densidad de 4.0 veces 10 a las tres células por mililitro. Incubar el matraz a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Después de 16 horas, confirme la adhesión celular mediante microscopía a un aumento de 10X.A continuación, retire las células de no adherencia y lave el matraz tres veces con cinco mililitros de DPBS. A continuación, incubar las células con cinco mililitros de 10 arabinósidos de citosina micromolares en un medio completo DMEM. Después de 24 horas aspire el medio que contiene citosina arabinósido antes de enjuagar el matraz como se demostró anteriormente.Rellene el matraz de cultivo con cinco mililitros de células de Schwann para incubar 48 horas, mientras refresca el medio cada dos días hasta que las células de Schwann alcancen el 80% de confluencia. Para aislar los fibroblastos, resuspendir el pellet recolectado en cinco mililitros de fibroblastos en medio completo. Cultivar las células en matraces de cultivo T25 no codificados durante 24 horas, como se ha demostrado para las células de Schwann.Después de aspirar las células de no adherencia y lavar el matraz, incubar las células con cinco mililitros de fibroblastos frescos a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 48 horas. A medida que las células primarias aisladas se cultivaron en los respectivos medios de cultivo celular, los queratinocitos primarios alcanzaron el 85% de confluencia en el séptimo día y exhibieron una morfología celular característica con una forma de adoquín. Las células de Schwann alcanzaron el 95% de confluencia en el quinto día y parecían bipolares o de forma tripolar.Los cultivos de fibroblastos alcanzaron el 95% de confluencia en el cuarto día y la mayoría de las células exhibieron una morfología en forma de huso. La tinción por inmunofluorescencia confirmó la expresión de proteínas específicas del tipo celular en los cultivos celulares. Los queratinocitos fueron positivos para la proteína K10 y K14.Las imágenes combinadas de inmunofluorescencia de queratina y tinción nuclear DAPI indicaron una pureza del 97,8% de los cultivos celulares. Del mismo modo, las células de Schwann fueron positivas para S100 y P75 NTR y tuvieron una pureza del 95,2% en el cultivo. Los fibroblastos expresaron positivamente vimentina, pero no expresaron actina del músculo liso alfa, un marcador de miofibroblastos.La pureza del cultivo fue de alrededor del 97,2% Para mejorar la evidencia de Shanse, se puede usar un plato de poli-l-lisina pre-recubierto. Y para mitigar aún más la contaminación fibrosa, se agregaron arabinósidos de citosina y agente antimicótico después de que las células se agregaron por un corto tiempo. Este es un procedimiento experimental simple y económico para establecer las tres células primarias, como las células shwann, los queratinocitos y los fibroblastos, a partir de una sola piel delantera humana.Este protocolo es ideal para experimentos in vitro que involucran la comunicación celular o la diafonía entre tipos de células.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

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Investigación

Neurociencias

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Aislamiento y cultivo de células humanas las papilas fungiformes gusto

Taste cells are highly specialized, with unique histological, molecular and physiological characteristics that permit detection of a wide range of simple ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Aislamiento y cultivo de células de la cresta neural de embriones murinos del Tubo Neural

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Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

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Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

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Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Sencilla generación de una cultura de alto rendimiento de las neuronas inducidas de fibroblastos de piel humana adulta

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Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

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Cultivo primario de neuronas aisladas del cerebelo del ratón embrionario

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