Name: isolation, culture, and characterization of primary schwann cells, keratinocytes, and fibroblasts from human foreskin
Uploaded: 2022-03-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin at JoVE.com

Vi vill tacka Dr. Fadia Kamal och Dr. Reyad Elbarbary för att vi fick använda labbinstrument och teknisk support. Detta arbete stöddes av bidrag från NIH (K08 AR060164-01A) och DOD (W81XWH-16-1-0725) till J. C. E. förutom institutionellt stöd från Pennsylvania State University Hershey Medical Center.

Förvärv och användning av avidentifierad mänsklig förhudsvävnad för forskningsändamål granskades och fick bestämningen av "inte mänsklig forskning" av Penn State College of Medicine Institutional Review Board (IRB # 17574).
OBS: Genom att följa protokollet nedan erhålls 2,4 x 106 keratinocyter, 4,4 x 106 fibroblaster och 1,1 x 106 SC från en enda förhud. I allmänhet kan dessa primära celler användas för 3 passager, beroende på experimentella...

<ol>
	<li>Hawksworth, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+disadvantages+of+using+human+cells+for+pharmacological+and+toxicological+studies.">Advantages and disadvantages of using human cells for pharmacological and toxicological studies.</a> Human &amp; Experimental Toxicology. 13 (8), 568-573 (1994).</li><li>Green, H., Kehinde, O., Thomas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+cultured+human+epidermal+cells+into+multiple+epithelia+suitable+for+grafting.">Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (11), 5665-5668 (1979).</li><li>Fuchs, E., Green, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+keratin+gene+expression+during+terminal+differentiation+of+the+keratinocyte.">Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocyte.</a> Cell. 19 (4), 1033-1042 (1980).</li><li>Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+cultivation+of+human+keratinocytes+from+skin+or+plucked+hair+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells.">Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).</li><li>Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+primary+adult+fibroblast+cultures+from+rodents.">Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2033 (2010).</li><li>Belviso, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+adult+human+dermal+fibroblasts+from+abdominal+skin+and+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+using+a+non-integrating+method.">Isolation of adult human dermal fibroblasts from abdominal skin and generation of induced pluripotent stem cells using a non-integrating method.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60629 (2020).</li><li>Silva, W. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Schwann+cells+in+cutaneous+wound+healing.">Role of Schwann cells in cutaneous wound healing.</a> Wound Repair and Regeneration. 26 (5), 392-397 (2018).</li><li>Bray, E. R., Cheret, J., Yosipovitch, G., Paus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cells+as+underestimated,+major+players+in+human+skin+physiology+and+pathology.">Schwann cells as underestimated, major players in human skin physiology and pathology.</a> Experimental Dermatology. 29 (1), 93-101 (2020).</li><li>Laverdet, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+innervation:+important+roles+during+normal+and+pathological+cutaneous+repair.">Skin innervation: important roles during normal and pathological cutaneous repair.</a> Histology and Histopathology. 30 (8), 875-892 (2015).</li><li>Jessen, K. R., Mirsky, R., Lloyd, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cells:+Development+and+role+in+nerve+repair.">Schwann cells: Development and role in nerve repair.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (7), 020487 (2015).</li><li>Bentley, C. A., Lee, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p75+is+important+for+axon+growth+and+Schwann+cell+migration+during+development.">p75 is important for axon growth and Schwann cell migration during development.</a> The Journal of Neuroscience. 20 (20), 7706-7715 (2000).</li><li>Rutkowski, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signals+for+proinflammatory+cytokine+secretion+by+human+Schwann+cells.">Signals for proinflammatory cytokine secretion by human Schwann cells.</a> Journal of Neuroimmunology. 101 (1), 47-60 (1999).</li><li>Kumar, A., Brockes, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+dependence+in+tissue,+organ,+and+appendage+regeneration.">Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration.</a> Trends in Neurosciences. 35 (11), 691-699 (2012).</li><li>Balakrishnan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+role+and+potential+of+Schwann+cells+for+peripheral+nerve+repair+from+studies+of+development+and+injury.">Insights into the role and potential of Schwann cells for peripheral nerve repair from studies of development and injury.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 608442 (2020).</li><li>Gresset, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boundary+caps+give+rise+to+neurogenic+stem+cells+and+terminal+glia+in+the+skin.">Boundary caps give rise to neurogenic stem cells and terminal glia in the skin.</a> Stem Cell Reports. 5 (2), 278-290 (2015).</li><li>Stratton, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+Schwann+cells+from+adult+human+skin+and+nerve.">Purification and characterization of Schwann cells from adult human skin and nerve.</a> eNeuro. 4 (3), (2017).</li></ol>

Detta protokoll beskriver en metod för att isolera tre distinkta cellpopulationer från en enda bit av förhuden, nämligen keratinocyter, fibroblaster och Schwann-celler. Det finns några isoleringsprotokoll tillgängliga för att isolera keratinocyter och fibroblaster 2,3,5,6, men ingen beskriver SC-isolering. Bortsett från de viktigaste strukturella cellerna i hud, keratinocyter och fibrob...

Primära celler som härrör från levande vävnad och odlas under in vitro-förhållanden liknar det fysiologiska tillståndet1, vilket gör dem till en idealisk modell för att undersöka fysiologiska och patofysiologiska processer. Huden innehåller flera celltyper, inklusive keratinocyter, fibroblaster, sebocyter, melanocyter och Schwann-celler (SC), som kan isoleras och odlas för in vitro-experiment . Metoder för att isolera och odla keratinocyter, fibroblaster och SC, från en enda hudbit, har inte beskrivits. Målet med detta protokoll är tvåfaldigt: 1) att upprätta en tillförlitlig och reproducerbar metod för isolering och odling av dermala SC och 2) att använda en effektiv, robust metod för isolering av keratinocyter, fibroblaster och SC från en enda human förhud.
För närvarande finns det etablerade protokoll för att isolera hud keratinocyter 2,3,4 och fibroblaster 5,6. Dessa studier beskriver isoleringen av antingen keratinocyter, fibroblaster eller båda från huden, men inget protokoll behandlar hur man etablerar kulturer av primära SC från mänsklig hud. Nya studier tyder på att neuronala SC modulerar keratinocyt- och fibroblastcellulära processer och reglerar normala hudfysiologiska funktioner7. SCs är således kritiska för hudhomeostas och bidrar väsentligt till regleringsfysiologin som påverkar beteendet hos närliggande hudcelltyper närvarande8. Därför är ett protokoll som möjliggör isolering av var och en av dessa celltyper idealiskt för in vitro-experiment som involverar cell-cellkommunikation eller korsprat mellan celltyper.
Detta protokoll beskriver upprättandet av enskilda cellkulturer av primära celler från en enda hudbit. Detta protokoll är särskilt användbart när mängden tillgänglig vävnad är begränsad. Dessutom möjliggör isolering av alla tre celltyperna från en enda givare robusta jämförelser mellan celltyper eller samodlingsexperiment samtidigt som man mildrar genetikens inflytande under det önskade experimentet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;M sterile filters (Millex-GP Syringe Filter Unit,polyethersulfone)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SLGPR33RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;M cell strainers</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;M cell strainers</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL disposable syringes</td>
			<td>BD Luer-Lok</td>
			<td>BD-309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL disposable syringes (Syringe sterile, single use)</td>
			<td>BD Luer-Lok</td>
			<td>BD309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL disposable syringes</td>
			<td>BD Luer-Lok</td>
			<td>BD305462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% TritonX-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-1L</td>
			<td>Prepared at the time of use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>J19943.K2</td>
			<td>Ready to use and store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td>Prepared at the time of use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemometec Vial1-Cassette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1420193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17018-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12544D 22*50-1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D46693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM basal medium</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>9221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline free from Ca2+ and Mg2+ (DPBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;21-031-CV)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL micro-centrifuge tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-681-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast complete medium</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>2331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11032</td>
			<td>Dilution (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>Dilution (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Buffered Saline Solution (HBSS buffer)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human foreskin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>De-identified human foreskin tissue for research purposes (Institutional Review Board- IRB #17574).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KGM-GOLD keratinocyte medium (KGM gold and supplements)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>00192151 and 00192152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse alpha-smooth muscle actin antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-9760-82</td>
			<td>Dilution (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Cytokeratin14 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7800</td>
			<td>Dilution (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse S100 antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MA5-12969</td>
			<td>Dilution (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi chambered (4 well glass slide)</td>
			<td>Tab-Tek</td>
			<td>154526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoCounter -Via1-Cassette</td>
			<td>Chemometec</td>
			<td>941-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysisne (PLL)</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>32503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Anti-fade Mountant with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit K10 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB4501656</td>
			<td>Dilution (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit p75-NTR antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB1554</td>
			<td>Dilution (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit vimentin</td>
			<td>ProteinTech</td>
			<td>10366-1-AP</td>
			<td>Dilution (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schwann cell culture medium</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>1701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision tweezers DUMONT straight with extra fine tips Dumostar, 5</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>LH75.1</td>
			<td>Sterilize with 70% alcohol before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS Scissors, sharp/sharp. Length 4&#8211;3/8&#34;(111mm)</td>
			<td>Codman</td>
			<td>54-6500</td>
			<td>Sterilize with 70% alcohol before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized surgical - sharp blade (Duro Edge Economy Single Edge Blades)</td>
			<td>Razor blade company</td>
			<td>94-0120</td>
			<td>Sterilize with 70% alcohol before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin neutralization buffer (TNS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Axio Observer 7- Axiocam 506 mono &#8211; Apotome.2 microscope</td>
			<td>For immunofluorescence of chamber slide containing stained cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Primovert</td>
			<td>For visulaizing/observing cell attachment or detachment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and characterization of primary schwann cells, keratinocytes, and fibroblasts from human foreskin

Detta protokoll beskriver isoleringsmetoder, odlingsförhållanden och karakterisering av humana primära celler med högt utbyte och livskraft med hjälp av snabb enzymatisk dissociation av huden. Primära keratinocyter, fibroblaster och Schwann-celler skördas alla från den mänskliga nyfödda förhuden, som är tillgänglig enligt standardvårdsprocedurer. Den borttagna huden desinficeras och det subkutana fettet och muskeln avlägsnas med en skalpell. Metoden består av enzymatisk och mekanisk separation av epidermala och dermala lager, följt av ytterligare enzymatisk matsmältning för att erhålla encellssuspensioner från vart och ett av dessa hudskikt. Slutligen odlas enstaka celler i lämpliga cellodlingsmedier enligt standardcellodlingsprotokoll för att upprätthålla tillväxt och livskraft under veckor. Tillsammans möjliggör detta enkla protokoll isolering, odling och karakterisering av alla tre celltyperna från en enda hudbit för in vitro-utvärdering av hudnervmodeller. Dessutom kan dessa celler användas tillsammans i samkulturer för att mäta deras effekter på varandra och deras svar på in vitro-trauma i form av repor som utförs robotiskt i kulturen i samband med sårläkning.

Normal neonatal förhud användes för isolering av primära epidermala keratinocyter och dermala SC och fibroblaster. De isolerade primära cellerna odlades i respektive cellodlingsmedium innehållande tillväxtfaktorer. Efter sådd av SC och fibroblast i odlingskolvar fastnade de flesta cellerna på botten av kolven inom 2 timmar. När det gäller keratinocyter vidhäftade de flesta keratinocyter med 24 timmar. Isolerade epidermala primära keratinocyter nådde 85% sammanflöde vid dag 7 och uppvisade karakteristisk ce...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin at JoVE.com

Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin

Studien av sårläkning i samband med muskuloskeletal skada kräver ofta bedömning av in vitro-interaktioner mellan Schwann-celler (SC), keratinocyter och fibroblaster. Detta protokoll beskriver isolering, odling och karakterisering av dessa primära celler från den mänskliga förhuden.

Isolering, kultur och karakterisering av primära Schwann-celler, keratinocyter och fibroblaster från mänsklig förhud

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid ...

Huden innehåller flera celltyper inklusive keratinocyter, fibroblaster och nerv Schwann-celler. Detta protokoll möjliggör isolering av var och en av dessa celltyper för in vitro-experiment. Isolering och etablering av enskilda primära cellkulturer från en enda givare möjliggör robusta jämförelser och samodlingsexperiment, samtidigt som effekterna av genetisk variation mildras.Med detta protokoll möjliggör analysen av enskilda celler och deras interaktioner analysen av Schwann-cellernas roll i hudhomeostas och patofysiologi. Dessa distinkta cellpopulationer kan användas för att studera Schwann-celler, fibroblaster eller keratinocyter antingen individuellt eller i kombination i normal hudfysiologi, sårläkning eller i hudsjuka tillstånd. Jagadeeshaprasad M G, en postdoktor i mitt laboratorium kommer att hjälpa mig att demonstrera proceduren.Efter att ha förvärvat den neonatala förhuden enligt standardvårdsförfaranden, placera den utskurna förhuden i ett mikrocentrifugrör som innehåller åtta till 10 ml iskallt DMEM-basalmedium och transportera omedelbart förhuden till cellodlingslaboratoriet för cellisolering. Skölj förhuden två gånger med 20 till 25 ml Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning eller DPBS, innehållande antibiotika och antimykotika. Blötlägg sedan den tvättade huden i 25 till 30 ml iskallt DMEM-basalmedium i en 10 centimeter vävnadsodlingsskål.Efter 15 minuter skiva förhuden öppen med en skalpell för att exponera dermis och subkutan fettvävnad. Använd pincett, ett skalpellblad och sax för att ta bort och kassera den subkutana fettvävnaden. Skär sedan den rena förhuden i tre till fem mindre bitar och inkubera hudbitarna i 16 till 20 ml Dispace ett DMEM-medium i ett sterilt koniskt rör.Under de första 30 minuterna av inkubation med Dispace blandar man intermittent hudbitarna i det koniska röret genom inversion. Placera sedan det koniska röret vid fyra grader Celsius i 16 till 18 timmar. Nästa dag ta bort hudbitarna och lägg dem på en torr steril odlingsskål och rulla ut varje hudbit så att det yttre epidermisskiktet vidrör odlingsskålen.Börja på kanten av vävnaden skala epidermis bort från dermis med två uppsättningar pincett. Tillsätt de separerade epidermisfragmenten till fem milliliter HBS i en 10 centimeter odlingsskål för att inkubera vid rumstemperatur i 10 minuter. Samla sedan HBS-lösningen i ett 50 ml koniskt rör och tillsätt fem milliliter trypsinneutraliseringsbuffert eller T och B i det koniska röret.Lägg röret åt sidan. Till de epidermala fragmenten i odlingsskålen tillsätt tre milliliter Trypsinlösning för att inkubera vid 37 grader Celsius i 10 minuter. Efter inkubationen agiterar försiktigt de epidermala fragmenten med pincett tills trypsin keratinocyternas lösning blir grumlig.Tillsätt sedan trypsin keratinocytlösningen till HBS T- och B-röret. Efter upplösning av osmälta epidermala fragment med trypsin EDTA-lösning, tillsätt två milliliter FBS till HBS T- och B-röret innehållande trypsin EDTA-lösning och centrifugera de två cirka 870 gånger G i fem minuter vid fyra grader Celsius. Aspirera sedan supernatanten och återsuspendera cellpelleten i tre milliliter keratinocyt komplett tillväxtmedium, följt av filtrering av cellsuspensionen med ett sterilt 100 mikrometer filter i ett sterilt 50 ml koniskt rör.När cellantalet och cellviabiliteten har kvantifierats, frö cellerna i odlingsplattorna för att placera i en inkubator vid 37 grader Celsius i 5% koldioxid. Efter två dagar aspirera de icke-vidhäftade cellerna och uppdatera cellodlingsmediet varannan dag tills keratinocyter når 50 till 80% sammanflöde för passaging eller nedströms experiment. Förbelägg T25-kolvar med poly-l-lysin eller PLL, med användning av fem milliliter DPBS och placera de förbelagda kolvarna vid 37 grader Celsius i tre timmar.Tvätta senare PLL-beläggningsmatrisen två gånger med DPBS. Efter tvättning av de isolerade bitarna av dermis med fem milliliter DMEM basalmedium, haka dermis i små bitar med sax. Smält den malet dermis med fem milliliter kollagenas vid 37 grader Celsius i två och en halv timme, med mild titrering med en pipettspets var 30: e minut tills dermis dissocierar helt.När den har smälts, filtrera cellsuspensionen med en 70 mikrometer cellsil, följt av utspädning av den filtrerade cellsuspensionen med fem milliliter komplett DMEM-medium för att stoppa kollagenasets enzymatiska aktivitet. Därefter centrifugera cellsuspensionen vid 870 gånger G i fem minuter vid rumstemperatur och återsuspendera cellröstningen i två milliliter DMEM komplett medium för att dela cellerna. Efter att ha upprepat centrifieringsprocessen enligt beskrivningen, aspirera supernatanten för att använda cellpelleten för att isolera Schwann-cellerna eller fibroblasterna.För att isolera Schwan-cellerna, återsuspendera cellpelleten i fem milliliter färskt DMEM-komplett medium och kvantifiera cellantalet och livskraften innan du såddar fem milliliter av de återsuspenderade cellerna i förkodade T25-kolvar med en densitet av 4,0 gånger 10 till de tre cellerna per milliliter. Inkubera kolven vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid. Efter 16 timmar bekräfta celladhesionen genom mikroskopi vid 10X förstoring.Ta sedan bort icke-vidhäftningscellerna och tvätta kolven tre gånger med fem milliliter DPBS. Därefter inkubera cellerna med fem milliliter 10 mikromolär cytosin arabinosid i ett DMEM komplett medium. Efter 24 timmar aspirera cytosinargin arabicinosid som innehåller medium innan du sköljer kolven som visats tidigare.Fyll på odlingskolven med fem milliliter Schwann-celler komplett odlingsmedium för att inkubera 48 timmar, samtidigt som du uppdaterar mediet varannan dag tills Schwann-cellerna når 80% sammanflöde. För att isolera fibroblasterna, återsuspendera den uppsamlade pelleten i fem milliliter fibroblaster komplett medium. Att odla cellerna i icke-kodade T25-odlingskolvar i 24 timmar, vilket visats för Schwann-cellerna.Efter att ha aspirerat de icke-vidhäftningscellerna och tvättat kolven, inkubera cellerna med fem milliliter färska fibroblaster komplett medium vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid i 48 timmar. Eftersom de isolerade primära cellerna odlades i respektive cellodlingsmedia nådde de primära keratinocyterna 85% sammanflöde vid dag sju och uppvisade karakteristisk cellmorfologi med en kullerstensform. Schwann-cellerna nådde 95% sammanflöde vid dag fem och verkade bipolär eller tripolär i form.Fibroblastkulturerna nådde 95% sammanflöde vid dag fyra och de flesta celler uppvisade en spindelformmorfologi. Immunofluorescensfärgningen bekräftade celltypspecifikt proteinuttryck i cellkulturerna. Keratinocyterna var positiva för K10- och K14-protein.De sammanslagna bilderna av keratinimmunfluorescens och DAPI-kärnfärgning indikerade 97,8% renhet hos cellkulturerna. På samma sätt var Schwann-cellerna positiva för S100 och P75 NTR och hade en renhet på 95,2% i kulturen. Fibroblasterna uttryckte positivt vimentin, men uttryckte inte alfa-glattmuskel Actin, en myofibroblastmarkör.Renheten i kulturen var cirka 97.2% För att förbättra Shanses bevis kan förbelagd poly-l-lysinskål användas. Och för att ytterligare mildra fibrös kontaminering tillsattes cytosinarinosid och antimykotiskt medel efter att celler hade tillsatts under en kort tid. Detta är ett enkelt billigt experimentellt förfarande för att etablera de tre primära cellerna, såsom shwannceller, keratinocyter och fibroblaster, från en enda mänsklig framhud.Detta protokoll är idealiskt för in vitro-experiment som involverar cellcellkommunikation eller överhörning mellan celltyper.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

Isolering och odling av neurala celler Crest härrör från mänskliga hårsäckar

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

Isolation and Culture of Human Fungiform Taste Papillae Cells

Isolering och kultur mänskliga papiller Fungiform smak celler

Taste cells are highly specialized, with unique histological, molecular and physiological characteristics that permit detection of a wide range of simple ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Isolering och odling av neurallistceller från embryonala Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Isolering och odling av endotelceller från embryonal framhjärnan

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Isolering, kultur och långsiktigt underhåll av primär mesencefala dopaminerga neuron från embryonala Gnagare Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Isolering och kultur av vuxna neurala stamceller från mus Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Enkla Generation av en hög avkastning kultur av inducerade nervceller från mänsklig vuxen hud fibroblaster

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Karakterisering och isolering av mus primära mikroglia täthet lutning centrifugering

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Dorsalrotsganglier ganglier isolering och primära kultur att studera neurotransmitterfrigöraren

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

Primär kultur av neuroner isolerade från embryonala mus cerebellum

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...