Name: isolation, culture, and characterization of primary schwann cells, keratinocytes, and fibroblasts from human foreskin
Uploaded: 2022-03-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin at JoVE.com

Dr. Fadia Kamal ve Dr. Reyad Elbarbary'ye laboratuvar araçlarını ve teknik desteği kullanmamıza izin verdikleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Pennsylvania Eyalet Üniversitesi Hershey Tıp Merkezi'nden kurumsal desteğe ek olarak, NIH (K08 AR060164-01A) ve DOD'dan (W81XWH-16-1-0725) JC E.'ye verilen hibelerle desteklenmiştir.

Tanımlanmamış insan sünnet derisi dokusunun araştırma amacıyla edinilmesi ve kullanılması gözden geçirilmiş ve Penn State College of Medicine Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB #17574) tarafından "insan araştırması değil" tespiti alınmıştır.
NOT: Aşağıdaki protokol izlenerek tek bir sünnet derisinden 2.4 x 10 6 keratinosit, 4.4 x 106 fibroblast ve 1.1 x 106 SC elde edilir. Genel olarak, bu birincil hücreler deneysel koşullara bağlı olar...

<ol>
	<li>Hawksworth, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+disadvantages+of+using+human+cells+for+pharmacological+and+toxicological+studies.">Advantages and disadvantages of using human cells for pharmacological and toxicological studies.</a> Human &amp; Experimental Toxicology. 13 (8), 568-573 (1994).</li><li>Green, H., Kehinde, O., Thomas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+cultured+human+epidermal+cells+into+multiple+epithelia+suitable+for+grafting.">Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (11), 5665-5668 (1979).</li><li>Fuchs, E., Green, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+keratin+gene+expression+during+terminal+differentiation+of+the+keratinocyte.">Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocyte.</a> Cell. 19 (4), 1033-1042 (1980).</li><li>Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+cultivation+of+human+keratinocytes+from+skin+or+plucked+hair+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells.">Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).</li><li>Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+primary+adult+fibroblast+cultures+from+rodents.">Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2033 (2010).</li><li>Belviso, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+adult+human+dermal+fibroblasts+from+abdominal+skin+and+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+using+a+non-integrating+method.">Isolation of adult human dermal fibroblasts from abdominal skin and generation of induced pluripotent stem cells using a non-integrating method.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60629 (2020).</li><li>Silva, W. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Schwann+cells+in+cutaneous+wound+healing.">Role of Schwann cells in cutaneous wound healing.</a> Wound Repair and Regeneration. 26 (5), 392-397 (2018).</li><li>Bray, E. R., Cheret, J., Yosipovitch, G., Paus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cells+as+underestimated,+major+players+in+human+skin+physiology+and+pathology.">Schwann cells as underestimated, major players in human skin physiology and pathology.</a> Experimental Dermatology. 29 (1), 93-101 (2020).</li><li>Laverdet, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+innervation:+important+roles+during+normal+and+pathological+cutaneous+repair.">Skin innervation: important roles during normal and pathological cutaneous repair.</a> Histology and Histopathology. 30 (8), 875-892 (2015).</li><li>Jessen, K. R., Mirsky, R., Lloyd, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cells:+Development+and+role+in+nerve+repair.">Schwann cells: Development and role in nerve repair.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (7), 020487 (2015).</li><li>Bentley, C. A., Lee, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p75+is+important+for+axon+growth+and+Schwann+cell+migration+during+development.">p75 is important for axon growth and Schwann cell migration during development.</a> The Journal of Neuroscience. 20 (20), 7706-7715 (2000).</li><li>Rutkowski, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signals+for+proinflammatory+cytokine+secretion+by+human+Schwann+cells.">Signals for proinflammatory cytokine secretion by human Schwann cells.</a> Journal of Neuroimmunology. 101 (1), 47-60 (1999).</li><li>Kumar, A., Brockes, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+dependence+in+tissue,+organ,+and+appendage+regeneration.">Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration.</a> Trends in Neurosciences. 35 (11), 691-699 (2012).</li><li>Balakrishnan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+role+and+potential+of+Schwann+cells+for+peripheral+nerve+repair+from+studies+of+development+and+injury.">Insights into the role and potential of Schwann cells for peripheral nerve repair from studies of development and injury.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 608442 (2020).</li><li>Gresset, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boundary+caps+give+rise+to+neurogenic+stem+cells+and+terminal+glia+in+the+skin.">Boundary caps give rise to neurogenic stem cells and terminal glia in the skin.</a> Stem Cell Reports. 5 (2), 278-290 (2015).</li><li>Stratton, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+Schwann+cells+from+adult+human+skin+and+nerve.">Purification and characterization of Schwann cells from adult human skin and nerve.</a> eNeuro. 4 (3), (2017).</li></ol>

Bu protokol, üç farklı hücre popülasyonunu sünnet derisinin tek bir parçasından, yani keratinositlerden, fibroblastlardan ve Schwann hücrelerinden izole etmek için bir yöntemi tanımlar. Keratinositleri ve fibroblastları 2,3,5,6 izole etmek için birkaç izolasyon protokolü vardır, ancak hiçbiri SC izolasyonunu tanımlamaz. Derideki anahtar yapısal hücreler, keratinositler ve...

Canlı dokudan türetilen ve in vitro koşullar altında kültürlenen birincil hücreler, fizyolojik durum1'e çok benzer, bu da onları fizyolojik ve patofizyolojik süreçleri araştırmak için ideal bir model haline getirir. Deri, keratinositler, fibroblastlar, sebositler, melanositler ve in vitro deneyler için izole edilebilen ve kültürlenebilen Schwann hücreleri (SC'ler) dahil olmak üzere çoklu hücre tipleri içerir. Keratinositleri, fibroblastları ve SC'leri tek bir deri parçasından izole etme ve kültürleme yöntemleri tanımlanmamıştır. Bu protokolün amacı iki yönlüdür: 1) dermal SC'lerin izolasyonu ve kültürlenmesi için güvenilir ve tekrarlanabilir bir yöntem oluşturmak ve 2) keratinositlerin, fibroblastların ve SC'lerin tek bir insan sünnet derisinden izolasyonu için etkili, sağlam bir yöntem kullanmak.
Şu anda, deri keratinositleri 2,3,4 ve fibroblastları 5,6'yı izole etmek için belirlenmiş protokoller vardır. Bu çalışmalar, keratinositlerin, fibroblastların veya her ikisinin deriden izolasyonunu tanımlamaktadır, ancak hiçbir protokol, birincil SC'lerin kültürlerinin insan derisinden nasıl oluşturulacağını ele almamaktadır. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, nöronal SC'lerin keratinosit ve fibroblast hücresel süreçlerini modüle ettiğini ve normal cilt fizyolojik fonksiyonlarını düzenlediğini göstermektedir7. SC'ler bu nedenle cilt homeostazı için kritik öneme sahiptir ve mevcut komşu cilt hücresi tiplerinin davranışını etkileyen düzenleyici fizyolojiye önemli ölçüde katkıda bulunur8. Bu nedenle, bu hücre tiplerinin her birinin izolasyonuna izin veren bir protokol, hücre-hücre iletişimi veya hücre tipleri arasında çapraz konuşmayı içeren in vitro deneyler için idealdir.
Bu protokol, tek bir deri parçasından birincil hücrelerin bireysel hücre kültürlerinin kurulmasını tanımlar. Bu protokol, mevcut doku miktarı sınırlı olduğunda özellikle yararlıdır. Ayrıca, üç hücre tipinin de tek bir donörden izole edilmesi, istenen deney sırasında genetiğin etkisini azaltırken, hücre tipleri veya ko-kültür deneyleri arasında sağlam karşılaştırmalara izin verir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;M sterile filters (Millex-GP Syringe Filter Unit,polyethersulfone)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SLGPR33RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;M cell strainers</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;M cell strainers</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL disposable syringes</td>
			<td>BD Luer-Lok</td>
			<td>BD-309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL disposable syringes (Syringe sterile, single use)</td>
			<td>BD Luer-Lok</td>
			<td>BD309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL disposable syringes</td>
			<td>BD Luer-Lok</td>
			<td>BD305462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% TritonX-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-1L</td>
			<td>Prepared at the time of use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>J19943.K2</td>
			<td>Ready to use and store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td>Prepared at the time of use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemometec Vial1-Cassette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1420193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17018-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12544D 22*50-1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D46693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM basal medium</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>9221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline free from Ca2+ and Mg2+ (DPBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;21-031-CV)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL micro-centrifuge tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-681-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast complete medium</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>2331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11032</td>
			<td>Dilution (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>Dilution (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Buffered Saline Solution (HBSS buffer)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human foreskin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>De-identified human foreskin tissue for research purposes (Institutional Review Board- IRB #17574).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KGM-GOLD keratinocyte medium (KGM gold and supplements)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>00192151 and 00192152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse alpha-smooth muscle actin antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-9760-82</td>
			<td>Dilution (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Cytokeratin14 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7800</td>
			<td>Dilution (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse S100 antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MA5-12969</td>
			<td>Dilution (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi chambered (4 well glass slide)</td>
			<td>Tab-Tek</td>
			<td>154526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoCounter -Via1-Cassette</td>
			<td>Chemometec</td>
			<td>941-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysisne (PLL)</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>32503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Anti-fade Mountant with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit K10 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB4501656</td>
			<td>Dilution (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit p75-NTR antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB1554</td>
			<td>Dilution (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit vimentin</td>
			<td>ProteinTech</td>
			<td>10366-1-AP</td>
			<td>Dilution (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schwann cell culture medium</td>
			<td>ScienCell Research</td>
			<td>1701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision tweezers DUMONT straight with extra fine tips Dumostar, 5</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>LH75.1</td>
			<td>Sterilize with 70% alcohol before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS Scissors, sharp/sharp. Length 4&#8211;3/8&#34;(111mm)</td>
			<td>Codman</td>
			<td>54-6500</td>
			<td>Sterilize with 70% alcohol before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized surgical - sharp blade (Duro Edge Economy Single Edge Blades)</td>
			<td>Razor blade company</td>
			<td>94-0120</td>
			<td>Sterilize with 70% alcohol before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin neutralization buffer (TNS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Axio Observer 7- Axiocam 506 mono &#8211; Apotome.2 microscope</td>
			<td>For immunofluorescence of chamber slide containing stained cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Primovert</td>
			<td>For visulaizing/observing cell attachment or detachment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and characterization of primary schwann cells, keratinocytes, and fibroblasts from human foreskin

Bu protokol, cildin hızlı enzimatik ayrışmasını kullanarak izolasyon yöntemlerini, kültürleme koşullarını ve insan birincil hücrelerinin yüksek verim ve canlılığa sahip karakterizasyonunu açıklar. Birincil keratinositler, fibroblastlar ve Schwann hücreleri, standart bakım prosedürlerini takiben mevcut olan insan yenidoğan sünnet derisinden toplanır. Çıkarılan cilt dezenfekte edilir ve deri altı yağ ve kas bir neşter kullanılarak çıkarılır. Yöntem, epidermal ve dermal tabakaların enzimatik ve mekanik olarak ayrılmasından ve ardından bu cilt katmanlarının her birinden tek hücreli süspansiyonlar elde etmek için ek enzimatik sindirimden oluşur. Son olarak, tek hücreler, haftalar boyunca büyümeyi ve canlılığı korumak için standart hücre kültürü protokollerini izleyerek uygun hücre kültürü ortamında yetiştirilir. Birlikte, bu basit protokol, cilt-sinir modellerinin in vitro değerlendirmesi için üç hücre tipinin de tek bir deri parçasından izolasyonuna, kültürlenmesine ve karakterizasyonuna izin verir. Ek olarak, bu hücreler birbirleri üzerindeki etkilerini ve in vitro travmaya verdikleri tepkileri, yara iyileşmesi ile ilişkili kültürde robotik olarak gerçekleştirilen çizikler şeklinde ölçmek için ortak kültürlerde birlikte kullanılabilir.

Primer epidermal keratinositler ile dermal SC'ler ve fibroblastların izolasyonu için normal yenidoğan sünnet derisi kullanıldı. İzole edilen primer hücreler, büyüme faktörleri içeren ilgili hücre kültürü ortamlarında kültürlendi. Kültür şişelerinde SC'lerin ve fibroblastın tohumlanmasından sonra, hücrelerin çoğu şişenin dibine 2 saat içinde yapışır. Keratinositler söz konusu olduğunda, çoğu keratinosit 24 saat yapışır. İzole epidermal primer keratinositler 7. günde %85 birleşim...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin at JoVE.com

Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin

Kas-iskelet sistemi yaralanması ile ilişkili yara iyileşmesinin incelenmesi genellikle Schwann hücreleri (SC'ler), keratinositler ve fibroblastlar arasındaki in vitro etkileşimlerin değerlendirilmesini gerektirir. Bu protokol, bu birincil hücrelerin insan sünnet derisinden izole edilmesini, kültürlenmesini ve karakterizasyonunu açıklar.

İnsan Sünnet Derisinden Primer Schwann Hücrelerinin, Keratinositlerin ve Fibroblastların İzolasyonu, Kültürü ve Karakterizasyonu

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid ...

Deri, keratinositler, fibroblastlar ve sinir Schwann hücreleri dahil olmak üzere çoklu hücre tipleri içerir. Bu protokol, in vitro deneyler için bu hücre tiplerinin her birinin izolasyonuna izin verir. Tek bir donörden bireysel birincil hücre kültürlerinin izolasyonu ve kurulması, genetik varyasyonun etkilerini hafifletirken, sağlam karşılaştırmalara ve ortak kültür deneylerine izin verir.Bu protokolle, bireysel hücrelerin ve etkileşimlerinin analizi, Schwann hücrelerinin cilt homeostazı ve patofizyolojisindeki rolünün analizine izin verir. Bu farklı hücre popülasyonları, Schwann hücrelerini, fibroblastları veya keratinositleri ayrı ayrı veya normal cilt fizyolojisinde, yara iyileşmesinde veya cilt hastalıklı durumlarında kombinasyon halinde incelemek için kullanılabilir. Laboratuvarımda doktora sonrası bir akademisyen olan Jagadeeshaprasad M G, prosedürü göstermemde bana yardımcı olacak.Standart bakım prosedürlerini izleyerek yenidoğan sünnet derisini aldıktan sonra, eksize edilen sünnet derisini sekiz ila 10 mililitre buz gibi soğuk DMEM bazal ortam içeren bir mikro santrifüj tüpüne yerleştirin ve sünnet derisini derhal hücre izolasyonu için hücre kültürü laboratuvarına taşıyın. Sünnet derisini, antibiyotik ve antimikotik içeren 20 ila 25 mililitre Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu veya DPBS ile iki kez durulayın. Daha sonra yıkanmış cildi 10 santimetrelik bir doku kültürü kabında 25 ila 30 mililitre buz gibi soğuk DMEM bazal ortamına batırın.15 dakika sonra sünnet derisini dermis ve deri altı yağ dokusunu ortaya çıkarmak için bir neşter kullanarak dilimleyin. Subkutan yağ dokusunu çıkarmak ve atmak için forseps, neşter bıçağı ve makas kullanın. Daha sonra temiz sünnet derisini üç ila beş küçük parçaya bölün ve cilt parçalarını steril bir konik tüp içinde 16 ila 20 mililitre Dispace bir DMEM ortamında inkübe edin.Dispace ile inkübasyonun ilk 30 dakikası boyunca, konik tüpteki cilt parçalarını ara sıra ters çevirerek karıştırın. Daha sonra konik tüpü 16 ila 18 saat boyunca dört santigrat dereceye yerleştirin. Ertesi gün cilt parçalarını çıkarın ve kuru steril bir kültür kabına yerleştirin ve dış epidermis tabakasının kültür kabına dokunması için her bir cilt parçasını açın.Dokunun kenarından başlayarak, iki set forseps kullanarak epidermisi dermisten uzaklaştırın. Ayrılmış epidermis parçalarını, 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe etmek için 10 santimetrelik bir kültür kabında beş mililitre HBS'ye ekleyin. Daha sonra HBS çözeltisini 50 mililitrelik bir konik tüpte toplayın ve konik tüpe beş mililitre tripsin nötralizasyon tamponu veya T ve B ekleyin.Tüpü bir kenara koyun. Kültür kabındaki epidermal parçalara, 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe etmek için üç mililitre Tripsin çözeltisi ekleyin. Kuluçkayı takiben, tripsin keratinositler çözeltisi bulanıklaşana kadar epidermal parçaları forseps ile nazikçe çalkalayın.Daha sonra tripsin keratinosit çözeltisini HBS T ve B tüpüne ekleyin. Sindirilmemiş epidermal fragmanları tripsin EDTA çözeltisi ile çözdükten sonra, tripsin EDTA çözeltisi içeren HBS T ve B tüpüne iki mililitre FBS ekleyin ve ikisini dört santigrat derecede beş dakika boyunca yaklaşık 870 kez G santrifüj edin. Daha sonra süpernatantı aspire edin ve hücre peletini üç mililitre keratinosit tam büyüme ortamında yeniden askıya alın, ardından hücre süspansiyonunun steril bir 100 mikrometre filtre ile steril bir 50 mililitrelik konik tüpe filtrelenmesi ile filtrelenmesi.Hücre sayısı ve hücre canlılığı ölçüldükten sonra, kültür plakalarındaki hücreleri% 5 karbondioksit içinde 37 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirmek üzere tohumlayın. İki gün sonra, yapışmamış hücreleri aspire edin ve keratinositler pasaj veya aşağı akış deneyleri için% 50 ila% 80 birleşime ulaşana kadar hücre kültürü ortamını her gün yenileyin. Beş mililitre DPBS kullanarak poli-l-lizin veya PLL ile ön kat T25 şişeleri ve önceden kaplanmış şişeleri üç saat boyunca 37 santigrat dereceye yerleştirin.Daha sonra PLL kaplama matrisini DPBS ile iki kez yıkayın. Dermisin izole edilmiş parçalarını beş mililitre DMEM bazal ortamı ile yıkadıktan sonra, dermisi makasla küçük parçalara ayırın. Kıyılmış dermisi iki buçuk saat boyunca 37 santigrat derecede beş mililitre kollajenaz ile sindirin, dermis tamamen ayrışana kadar her 30 dakikada bir pipet ucu kullanarak nazik bir titrasyon yapın.Sindirildikten sonra, hücre süspansiyonunu 70 mikrometrelik bir hücre süzgeci ile filtreleyin, ardından kollajenazın enzimatik aktivitesini durdurmak için filtrelenmiş hücre süspansiyonunun beş mililitre tam DMEM ortamı ile seyreltilmesi ile seyreltilir. Daha sonra, hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında beş dakika boyunca 870 kez G'de santrifüj edin ve hücreleri bölmek için hücre oy pusulasını iki mililitre DMEM tam ortamında yeniden askıya alın. Santrifikasyon işlemini tarif edildiği gibi tekrarladıktan sonra, Schwann hücrelerini veya fibroblastlarını izole etmek için hücre peletini kullanmak üzere süpernatantı aspire edin.Schwan hücrelerini izole etmek için, hücre peletini beş mililitre taze DMEM tam ortamında yeniden askıya alın ve önceden kodlanmış T25 şişelerinde yeniden askıya alınmış hücrelerin beş mililitresini, mililitre başına üç hücreye 4.0 kat 10 yoğunlukta tohumlamadan önce hücre sayısını ve canlılığını ölçün. Şişeyi 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. 16 saat sonra, 10X büyütmede mikroskopi ile hücre yapışmasını onaylayın.Ardından yapışmayan hücreleri çıkarın ve şişeyi beş mililitre DPBS ile üç kez yıkayın. Daha sonra hücreleri beş mililitre 10 mikromolar sitozin arabinozid ile DMEM tam bir ortamda inkübe edin. 24 saat sonra, şişeyi daha önce gösterildiği gibi durulamadan önce sitozin arabinozid içeren ortamı aspire edin.Kültür şişesini beş mililitre Schwann hücresi ile doldurun, 48 saat inkübe etmek için kültür ortamını tamamlayın, Schwann hücreleri% 80 akıcılığa ulaşana kadar ortamı her gün yenileyin. Fibroblastları izole etmek için, toplanan peleti beş mililitre fibroblast tam ortamında yeniden askıya alın. Schwann hücreleri için gösterildiği gibi kodlanmamış T25 kültür şişelerindeki hücreleri 24 saat boyunca kültürlemek.Yapışmayan hücreleri aspire ettikten ve şişeyi yıkadıktan sonra, hücreleri 37 santigrat derecede tam orta ve 48 saat boyunca% 5 karbondioksitte beş mililitre taze fibroblast ile inkübe edin. İzole edilen primer hücreler ilgili hücre kültürü ortamında kültürlendiğinden, primer keratinositler yedinci güne kadar% 85 akıcılığa ulaştı ve parke taşı şeklinde karakteristik hücre morfolojisi sergiledi. Schwann hücreleri beşinci güne kadar% 95 birleşmeye ulaştı ve bipolar veya tripolar şeklinde ortaya çıktı.Fibroblast kültürleri dördüncü güne kadar% 95 birleşmeye ulaştı ve çoğu hücre bir iğ şekli morfolojisi sergiledi. İmmünofloresan boyama, hücre kültürlerinde hücre tipine özgü protein ekspresyonunu doğruladı. Keratinositler K10 ve K14 proteini için pozitifti.Keratin immünofloresan ve DAPI nükleer boyamasının birleştirilmiş görüntüleri, hücre kültürlerinin% 97.8 saflığını göstermiştir. Benzer şekilde, Schwann hücreleri S100 ve P75 NTR için pozitifti ve kültürde% 95.2'lik bir saflığa sahipti. Fibroblastlar pozitif olarak vimentin eksprese etti, ancak bir miyofibroblast belirteci olan alfa düz kas Aktin'i eksprese etmedi.Kültürün saflığı yaklaşık% 97.2 idiShanse'nin kanıtlarını arttırmak için, önceden kaplanmış poli-l-lizin çanak kullanılabilir. Fibröz kontaminasyonu daha da azaltmak için, hücreler kısa bir süre eklendikten sonra sitozin arabinozid ve antimikotik ajan eklendi. Bu, shwann hücreleri, keratinositler ve fibroblastlar gibi üç birincil hücreyi tek bir insan sünnet derisinden oluşturmak için basit, ucuz bir deneysel prosedürdür.Bu protokol, hücre hücre iletişimini veya hücre tipleri arasındaki çapraz konuşmayı içeren in vitro deneyler için idealdir.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

İnsan Saç köklerinin arasından Sinir Crest Kök Hücre İzolasyonu ve Kültür

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

Isolation and Culture of Human Fungiform Taste Papillae Cells

İnsan Mantar şeklinde Lezzet papilla hücrelerinin izolasyonu ve Kültürü

Taste cells are highly specialized, with unique histological, molecular and physiological characteristics that permit detection of a wide range of simple ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Embriyonik Mürin Nöral Tüp çıkan sinirsel Crest Hücre İzolasyonu ve Kültür

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embriyonik ön beyin gelen Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültürü

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Embriyonik Kemirgen Brain itibaren İlköğretim Mesensefalik dopaminerjik Nöronlar İzolasyonu, Kültür ve Uzun Vadeli Bakım

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Fare Subcallosal Zone İzolasyon ve Yetişkin Nöral Kök Hücre Kültürü

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

İnsan yetişkin cilt fibroblastlar indüklenen Neurons yüksek verimli kültürünün basit üretimi

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Karakterizasyonu ve yoğunluk Gradient Santrifüjü tarafından fare birincil Microglia izolasyonu

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Dorsal kök gangliyon yalıtım ve birincil kültür nörotransmitter yayın çalışmaya

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

Embriyonik Fare Beyincisinden İzole Edilen Nöronların Birincil Kültürü

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...