Name: microscopy techniques for interpreting fungal colonization in mycoheterotrophic plants tissues and symbiotic germination of seeds
Uploaded: 2022-05-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds at JoVE.com

يشكر المؤلفون التمويل المقدم من FAEPEX و FAPESP (2015/26479-6). يشكر MPP Capes على منحة درجة الماجستير (العملية 88887.600591/2021-00) و CNPq. JLSM يشكر CNPq على منح الإنتاجية (303664/2020-7). ويشكر المؤلفون أيضا الوصول إلى المعدات والمساعدة التي يقدمها مختبر المجهر الإلكتروني - IB/Unicamp)، والمعهد الوطني للعلوم والتكنولوجيا في مجال الضوئيات المطبقة على بيولوجيا الخلية - Unicamp)، ومختبر بيولوجيا الأوعية الدموية - DBEF/IB/Unicamp)؛ LAMEB (UFSC) وإليانا دي ميديروس أوليفيرا (UFSC) للمساهمات في بروتوكول الحماية من التبريد ؛ LME للمساهمات في بروتوكول TEM.

1. جمع العينات وتثبيتها وصيانتها
ملاحظة: يمكن العثور على نباتات MH بالكامل عادة في الغابة المظلمة تحت الأرض 12,13 ، خاصة في المناطق الرطبة والوفيرة بالقمامة ، في حين يمكن العثور على نباتات MH جزئيا في الغابات الأكثر انفتاحا 12,13.<sup class...

<ol>
	<li>Evert, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Esau&#8217;s Plant Anatomy: Meristems, Cells, and Tissues of the Plant Body: Their Structure, Function, and Development. , (2006).</li><li>Yeung, E. C. T., Stasolla, C., Sumner, M. J., Huang, B. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plant Microtechniques and Protocols. , (2015).</li><li>Sokoloff, D. D., Jura-Morawiec, J., Zoric, L., Fay, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+anatomy:+at+the+heart+of+modern+botany.">Plant anatomy: at the heart of modern botany.</a> Botanical Journal of the Linnean Society. 195 (3), 249-253 (2021).</li><li>Leake, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+myco-heterotrophic+(&#8216;saprophytic&#8217;)+plants.">The biology of myco-heterotrophic (&#8216;saprophytic&#8217;) plants.</a> New Phytologist. 127 (2), 171-216 (1994).</li><li>Bidartondo, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolutionary+ecology+of+myco-heterotrophy.">The evolutionary ecology of myco-heterotrophy.</a> New Phytologist. 167 (2), 335-352 (2005).</li><li>Imhof, S., Massicotte, H. B., Melville, L. H., Peterson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subterranean+morphology+and+mycorrhizal+structures.">Subterranean morphology and mycorrhizal structures.</a> Mycoheterotrophy. , 157-214 (2013).</li><li>Rasmussen, H. N., Rasmussen, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchid+mycorrhiza:+implications+of+a+mycophagous+life+style.">Orchid mycorrhiza: implications of a mycophagous life style.</a> Oikos. 118 (3), 334-345 (2009).</li><li>Rasmussen, H. N., Dixon, K. W., Jers&#225;kov&#225;, J., T&#283;&#353;itelov&#225;, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+and+seedling+establishment+in+orchids:+a+complex+of+requirements.">Germination and seedling establishment in orchids: a complex of requirements.</a> Annals of Botany. 116 (3), 391-402 (2015).</li><li>Zettler, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terrestrial+orchid+conservation+by+symbiotic+seed+germination:+techniques+and+perspectives.">Terrestrial orchid conservation by symbiotic seed germination: techniques and perspectives.</a> Selbyana. 18 (2), 188-194 (1997).</li><li>Stewart, S. L., Kane, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symbiotic+seed+germination+and+evidence+for+in+vitro+mycobiont+specificity+in+Spiranthes+brevilabris+(Orchidaceae)+and+its+implications+for+species-level+conservation.">Symbiotic seed germination and evidence for in vitro mycobiont specificity in Spiranthes brevilabris (Orchidaceae) and its implications for species-level conservation.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Plant. 43 (3), 178-186 (2007).</li><li>Zhao, D. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchid+reintroduction+based+on+seed+germination-promoting+mycorrhizal+fungi+derived+from+protocorms+or+seedlings.">Orchid reintroduction based on seed germination-promoting mycorrhizal fungi derived from protocorms or seedlings.</a> Frontiers in Plant Science. 12, 701152 (2021).</li><li>Selosse, M. A., Roy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+plants+that+feed+on+fungi:+facts+and+questions+about+mixotrophy.">Green plants that feed on fungi: facts and questions about mixotrophy.</a> Trends in Plant Science. 14 (2), 64-70 (2009).</li><li>Merckx, V. S. F. T., Mennes, C. B., Peay, K. G., Geml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+diversification.">Evolution and diversification.</a> Mycoheterotrophy: The Biology of Plants Living on Fungi. , 215-244 (2013).</li><li>Boon, M. E., Drijver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routine+Cytological+Staining+Techniques:+Theoretical+Background+and+Practice.">Routine Cytological Staining Techniques: Theoretical Background and Practice.</a> Macmillan International Higher Education. , (1986).</li><li>Karnovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+formaldehyde-glutaraldehyde+fixative+of+high+osmolality+for+use+in+electron+microscopy.">A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 27 (2), 137-138 (1964).</li><li>Hayat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fixation for Electron Microscopy. , (1981).</li><li>Roland, J. C., Vian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+preparation+and+staining+of+thin+sections.">General preparation and staining of thin sections.</a> Electron Microscopy of Plant Cells. 1, 675 (1991).</li><li>Gerrits, P. O., Horobin, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycol+methacrylate+embedding+for+light+microscopy:+basic+principles+and+trouble-shooting.">Glycol methacrylate embedding for light microscopy: basic principles and trouble-shooting.</a> Journal of Histotechnology. 19 (4), 297-311 (1996).</li><li>Zhang, Z., Niu, L., Chen, X., Xu, X., Ru, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+plant+cryosection.">Improvement of plant cryosection.</a> Frontiers in Biology. 7 (4), 374-377 (2012).</li><li>Bene&#352;, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+media+improving+freeze-sectioning+of+plant+material.">On the media improving freeze-sectioning of plant material.</a> Biologia Plantarum. 15 (1), 50-56 (1973).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+slides+and+coverslips+for+microscopy.">Preparation of slides and coverslips for microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (5), (2008).</li><li>Sakai, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+method+for+differential+staining+of+paraffin+embedded+plant+material+using+toluidine+blue+O.">Simple method for differential staining of paraffin embedded plant material using toluidine blue O.</a> Stain Technology. 48 (5), 247-249 (1973).</li><li>O&#8217;Brien, T., Feder, N., McCully, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polychromatic+staining+of+plant+cell+walls+by+toluidine+blue+O.">Polychromatic staining of plant cell walls by toluidine blue O.</a> Protoplasma. 59 (2), 368-373 (1964).</li><li>Ventrella, M. C., Almeida, A. L., Nery, L. A., Coelho, V. P. d. e. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#233;todos+Histoqu&#237;micos+Aplicados+&#224;s+Sementes.">M&#233;todos Histoqu&#237;micos Aplicados &#224;s Sementes.</a> Universidade Federal de Vi&#231;osa. , (2013).</li><li>Pearse, A. G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histochemistry, Theoretical and Applied. , (1960).</li><li>Andrade-Linares, D. R., Franken, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+endophytes+in+plant+roots:+taxonomy,+colonization+patterns,+and+functions.">Fungal endophytes in plant roots: taxonomy, colonization patterns, and functions.</a> Symbiotic Endophytes. , 311-334 (2013).</li><li>Wymer, C. L., Beven, A. F., Boudonck, K., Lloyd, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy+of+plant+cells.">Confocal microscopy of plant cells.</a> Confocal Microscopy Methods and Protocols. , 103-130 (1999).</li><li>Marques, J. P. R., Soares, M. K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+de+T&#233;cnicas+Aplicadas+&#224;+Histopatologia+Vegetal.">Manual de T&#233;cnicas Aplicadas &#224; Histopatologia Vegetal.</a> FEALQ. , (2021).</li><li>Navarro, B. L., Marques, J. P. R., Appezzato-da-Gl&#243;ria, B., Sp&#243;sito, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histopathology+of+Phakopsora+euvitis+on+Vitis+vinifera.">Histopathology of Phakopsora euvitis on Vitis vinifera.</a> European Journal of Plant Pathology. 154 (4), 1185-1193 (2019).</li><li>Marques, J. P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugarcane+cell+wall-associated+defense+responses+to+infection+by+Sporisorium+scitamineum.">Sugarcane cell wall-associated defense responses to infection by Sporisorium scitamineum.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 698 (2018).</li><li>Jeffree, C. E., Read, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ambient-and+low-temperature+scanning+electron+microscopy.">Ambient-and low-temperature scanning electron microscopy.</a> Electron Microscopy of Plant Cells. , 313-413 (1991).</li><li>Bozzola, J. J., Russell, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Electron Microscopy: Principles and Techniques for Biologists. , (1999).</li><li>Murray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+transmission+and+scanning+electron+microscopy.">Basic transmission and scanning electron microscopy.</a> Introduction to electron Microscopy for Biologists. , 3-18 (2008).</li><li>. Glossary of TEM terms Available from: <a target="_blank" href="https://www.jeol.co.jp/en/words/emterms/">https://www.jeol.co.jp/en/words/emterms/</a> (2021)</li><li>Seaton, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchid+seed+and+pollen:+a+toolkit+for+long-term+storage,+viability+assessment+and+conservation.">Orchid seed and pollen: a toolkit for long-term storage, viability assessment and conservation.</a> Orchid Propagation: From Laboratories to Greenhouses&#8212;Methods and Protocols. , 71-98 (2018).</li><li>Otero, J. T., Ackerman, J. D., Bayman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+mycorrhizal+preferences+between+two+tropical+orchids.">Differences in mycorrhizal preferences between two tropical orchids.</a> Molecular Ecology. 13 (8), 2393-2404 (2004).</li><li>Koch, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marasmioid+rhizomorphs+in+bird+nests:+Species+diversity,+functional+specificity,+and+new+species+from+the+tropics.">Marasmioid rhizomorphs in bird nests: Species diversity, functional specificity, and new species from the tropics.</a> Mycologia. 112 (6), 1086-1103 (2020).</li><li>Webster, J., Weber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Introduction to Fungi. , (2007).</li><li>Sisti, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+non-mycorrhizal+fungi+in+germination+of+the+mycoheterotrophic+orchid+Pogoniopsis+schenckii+Cogn.">The role of non-mycorrhizal fungi in germination of the mycoheterotrophic orchid Pogoniopsis schenckii Cogn.</a> Frontiers in Plant Science. 10, 1589 (2019).</li><li>Martos, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+recruitment+of+saprotrophic+fungi+as+mycorrhizal+partners+by+tropical+achlorophyllous+orchids.">Independent recruitment of saprotrophic fungi as mycorrhizal partners by tropical achlorophyllous orchids.</a> New Phytologist. 184 (3), 668-681 (2009).</li><li>Alves, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+development+and+genetic+structure+of+the+mycoheterotrophic+orchid+Pogoniopsis+schenckii+Cogn.">Reproductive development and genetic structure of the mycoheterotrophic orchid Pogoniopsis schenckii Cogn.</a> BMC Plant Biology. 21 (1), 332 (2021).</li><li>Merckx, V. S. F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycoheterotrophy:+an+introduction.">Mycoheterotrophy: an introduction.</a> Mycoheterotrophy: The Biology of Plants Living on Fungi. , 1-17 (2013).</li><li>Hall, J. L., Hawes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Electron Microscopy of Plant Cells. , (1991).</li></ol>

تتمتع تحليلات الصور في تشريح النبات ومورفولوجيا بإمكانات مهمة لتحقيق الأهداف والمساعدة في فهم العلاقات بين النباتات المتغايرة والنباتات الداخلية الفطرية التي لا غنى عنها ، كما يتضح من دراسات الأعضاء الجوفية 6,40 ، والتحليلات الهيكلية للإنبات التكافلي للبذور3...

البحوث الهيكلية في علم النبات ، والتي تغطي مورفولوجيا النبات والتشريح ، أساسية في فهم الكائن الحي بأكمله1،2 ، وتوفر وجهات نظر لا غنى عنها لدمج والمساهمة في المعرفة المتعلقة بالبيئة وعلم وظائف الأعضاء والتنمية وتطور النباتات3. تشمل الطرق في مورفولوجيا النبات والتشريح حاليا البروتوكولات والمعدات والمعرفة التي تم تطويرها مؤخرا وكذلك منذ أكثر من قرن من الزمان2. إن التنفيذ المستمر والتكيف مع الأساليب الكلاسيكية (مثل المجهر الضوئي) جنبا إلى جنب مع التقنيات الحديثة (مثل المجهر البؤري ، التصوير المقطعي المصغر بالأشعة السينية) لها نفس الأساس الأساسي: المعرفة النظرية التي تمكن من تطوير منهجية.
الأداة الرئيسية في تشريح النبات والمورفولوجيا هي الصورة. على الرغم من الاعتقاد الخاطئ بأن هذه التحليلات هي ملاحظات بسيطة ، مما يعطي مساحة للتفسيرات الذاتية2 ، فإن تحليل وفهم الصور في هذا المجال يتطلب معرفة الأساليب المطبقة (المعدات ، ونوع التحليل ، والإجراءات المنهجية) ، ومكونات الخلية ، والكيمياء النسيجية ، وجسم النبات (تنظيم الأنسجة ووظيفتها ، وعلم الوراثة ، والتكيفات المورفولوجية). يمكن أن يؤدي تفسير الصور التي تم الحصول عليها عبر مجموعة متنوعة من الطرق إلى ربط الشكل والوظيفة ، وفك رموز التركيب الكيميائي للبنية ، والتأييد في وصف الأصناف ، وفهم العدوى بمسببات الأمراض النباتية ، وغيرها من التقييمات المماثلة.
عند البحث في النباتات المتغايرة (MH) (أي النباتات غير الضوئية التي تحصل على الكربون من الفطريات الفطرية 4,5) ، يمكن للجوانب الرائعة من تكيفاتها الهيكلية ، وأنماط استعمار الأنسجة بواسطة الفطريات ، والتشريح المورفوغرافي للأعضاء الجوفية أن تنير استراتيجيات تنميتها وعلاقاتها مع hyphae ، والتي هي مصدر العناصر الغذائية. عادة ما تظهر الأعضاء الجوفية لنباتات MH تكيفات مهمة تتعلق بارتباطها بفطريات التربة ، وبالتالي من الضروري إجراء هذه التحقيقات التشريحية والمورفولوجية6. لا ينبغي تجاهل الأعضاء الهوائية لأنواع MH ، حيث يمكن أن تكون النباتات الداخلية موجودة أيضا في هذه الأنسجة ، حتى لو لم تكن فطريات فطرية (ملاحظات شخصية ، لم تنشر بعد).
إلى جانب الجوهرية الراسخة لارتباط الفطريات الفطرية بأنواع MH خلال دورة حياتها بأكملها7 ، فإن كل أنواع السحلية ، حتى الأنواع ذاتية التغذية ، لها مرحلة أولية ملزمة من التغذية الفطرية في البيئات الطبيعية. يحدث ذلك لأن جنين بساتين الفاكهة غير متمايز ويفتقر إلى السويداء أو النبتات ، وبالتالي فهو غير قادر على التطور وتأسيس نفسه في البيئات الطبيعية دون الدعم الغذائي من الشركاء الفطريين 4,8. وبالنظر إلى أنه يمكن تطبيق بروتوكولات الإنبات التكافلي ليس فقط على أنواع MH ولكن أيضا على بساتين الفاكهة الضوئية ، بهدف التحقيق في خصوصية فطريات السحلية في الإنبات وتطوير البروتوكروم ، وهي منهجية مطبقة على نطاق واسع في مبادرات الحفاظ على الأنواع المهددة بالانقراض9،10،11.
في تجميع الطرق هذا ، نصف الخطوات المهمة التي ينطوي عليها جمع وتثبيت وتخزين عينات نبات MH للدراسات التشريحية (القسم 1) ، وتحليل السطح واختيار العينات (القسم 2) ، وطرق التقسيم (اليدوي: القسم 3 ، الميكروتوميا: القسم 4 ، الاستئصال المجهري بالتبريد: القسم 5) ، التلطيخ والتركيب (القسم 6) ، التألق والمجهر البؤري للنباتات الداخلية الفطرية (القسم 7) ، المجهر الإلكتروني الماسح (القسم 8) ، والمجهر الإلكتروني الناقل (القسم 9). بالإضافة إلى ذلك ، نصف طريقة الإنبات التكافلي لبذور السحلية (MH و autotrophic ، القسم 10) ، حيث يمكن تطبيق طرق التصوير المذكورة سابقا بنجاح لتحليل الاستعمار الفطري للبذور والبروتوكورمات والشتلات في عملية الإنبات.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63777/63777fig01.jpg"> الشكل 1: التلخيص التخطيطي لطرق التصوير. توفر المخططات مؤشرات على خطوات البروتوكول التي يتم تفصيلها فيها. الاختصارات: GMA = ميثاكريلات غليكول ، OCT = مركب درجة حرارة القطع الأمثل ، SEM = المجهر الإلكتروني الماسح. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63777/63777fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
يسبق تقنيات الفحص المجهري الموصوفة هنا بالتفصيل (الشكل 1) الخطوات الأساسية التالية: جمع العينات وإصلاحها وتجفيفها وتضمينها وتقسيمها. نظرا لأن الخطوات متغيرة (الشكل 1) اعتمادا على التقنية (التقنيات) المختارة ، فمن المهم التفكير في المستقبل ، مع مراعاة المثبتات التي سيتم إعدادها ونقلها إلى موقع التجميع ، وكيفية إعداد العينات قبل التثبيت ، وعمليات الجفاف التي سيتم استخدامها (القسم 1) ، وإمكانيات التضمين المختلفة وطرق التقسيم (الأقسام 4 ، 5 ، و 9). يلخص الشكل 1 بالتتابع جميع الخطوات المطلوبة لكل تقنية من تقنيات الفحص المجهري الموضحة بدقة أدناه.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179124</td>
			<td>(for SEM stubs mounting)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar-agar (AA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1296</td>
			<td>(for seeds germination tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcofluor White Stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18909</td>
			<td>fluorescent dye (detects cellulose)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate Buffer Solution, 0.09M pH 4.8</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2488</td>
			<td>(for toluidine blue O staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive Double-Sided Carbon Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-285-81</td>
			<td>(for SEM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper Grids</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4776</td>
			<td>(for TEM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical-point dryer</td>
			<td>Balzers</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>(= stereomicroscope, any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Entellan</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>107960</td>
			<td>rapid mounting medium for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol, pure (&#8805;99.5%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>459836</td>
			<td>(= ethanol, for dehydration processes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution, 37%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252549</td>
			<td>(for NBF solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td>histological tissue fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin capsules for TEM</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-248-71</td>
			<td>(for resin polymerisation in TEM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin solution, 2% in H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1393</td>
			<td>(dilute for slides preparation - OCT adherence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution, 25%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6257</td>
			<td>(for Karnovsky&#8217;s solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoResin</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>14702231731</td>
			<td>glycol methacrylate (GMA) embedding kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>207772</td>
			<td>(for Lugol solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead(II) nitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>228621</td>
			<td>Pb(NO3)2 (for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR White acrylic resin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9774</td>
			<td>hydrophilic acrylic resin for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lugol solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>62650</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal stubs for specimen mounts</td>
			<td>Rave Scientific</td>
			<td></td>
			<td>(for SEM, different models)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>manual rotary microtome or other model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oatmeal agar (OMA)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>O3506</td>
			<td>(for seeds germination tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Compound, Tissue-Tek</td>
			<td>Sakura Finetek USA</td>
			<td>4583</td>
			<td>embedding medium for frozen tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201030</td>
			<td>OsO4 (for TEM postfixation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793</td>
			<td>sealing thermoplastic film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td>(for Karnovsky&#8217;s solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine solution, 0.1% in H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td>(for slides preparation - OCT adherence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep Slides</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0425</td>
			<td>poly-L-lysine coated glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Molding Cup Trays</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>17177A-3</td>
			<td>(6x8x5 mm, for embbeding samples in GMA resin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Molding Cup Trays</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>17177C-3</td>
			<td>(13x19x5 mm, for embbeding samples in GMA resin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221945</td>
			<td>(for Lugol solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato Dextrose Agar (PDA)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>70139</td>
			<td>(for seeds germination tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscope</td>
			<td>Jeol</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silane [(3-Aminopropyl)triethoxysilane]</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3648</td>
			<td>(for slides preparation - OCT adherence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silane-Prep Slides</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4651</td>
			<td>glass slides coated with silane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel orange, granular</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>10087</td>
			<td>(for dessicating processes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0250</td>
			<td>(for glutaraldehyde-sodium cacodylate buffer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881</td>
			<td>NaOH (for Karnovsky&#8217;s solution preparation and TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>425044</td>
			<td>NaClO (for seeds surface disinfection)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic, anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71640</td>
			<td>Na2HPO4 (for NBF solution and PB preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td>NaH2PO4&#183;H2O (for NBF and PB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sputter coater</td>
			<td>Balzers</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td>C12H22O11 (for cryoprotection and germination test)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan III</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4131</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan IV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>198102</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan Black B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>199664</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(3 mL, any brand, for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter Unit, Millex-GV 0.22 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033R</td>
			<td>PVDF, 33 mm, gamma sterilized (for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tek Bond Super Glue 793</td>
			<td>Tek Bond Saint-Gobain</td>
			<td>78072720018</td>
			<td>liquid cyanoacrylate adhesive, medium viscosity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3260</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Jeol</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triphenyltetrazolium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8877</td>
			<td>(for the tetrazolium test in seeds germination)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1804</td>
			<td>Na3(C6H5O7)&#183;2H2O (for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-607-645</td>
			<td>UO2(CH3COO)2 (for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td>TermoFisher Scientific</td>
			<td>W11261</td>
			<td>fluorescent dye-conjugated lectin (detects sialic acid and N-acetylglucosaminyl residues)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microscopy techniques for interpreting fungal colonization in mycoheterotrophic plants tissues and symbiotic germination of seeds

علم النبات الهيكلي هو منظور لا غنى عنه لفهم كامل للبيئة وعلم وظائف الأعضاء والتنمية وتطور النباتات. عند البحث في النباتات المتغايرة (أي النباتات التي تحصل على الكربون من الفطريات) ، يمكن للجوانب الرائعة من تكيفاتها الهيكلية ، وأنماط استعمار الأنسجة بواسطة الفطريات ، والتشريح المورفوغرافي للأعضاء الجوفية أن تنير استراتيجياتها التنموية وعلاقاتها مع hyphae ، مصدر العناصر الغذائية. دور مهم آخر للفطريات التكافلية يرتبط بإنبات بذور السحلية. جميع أنواع Orchidaceae هي mycoheterotrophic أثناء مرحلة الإنبات والشتلات (المتفطرة الأولية) ، حتى تلك التي تقوم بعملية التمثيل الضوئي في مراحل البالغين. بسبب نقص الاحتياطيات الغذائية في بذور السحلية ، فإن التكافل الفطري ضروري لتوفير الركائز وتمكين الإنبات. يمكن أن يجيب تحليل مراحل الإنبات من خلال وجهات النظر الهيكلية أيضا على أسئلة مهمة تتعلق بتفاعل الفطريات مع البذور. يمكن تطبيق تقنيات تصوير مختلفة للكشف عن النباتات الداخلية للفطريات في الأنسجة النباتية ، كما هو مقترح في هذه المقالة. يمكن تلطيخ الأجزاء اليدوية والرقيقة من الأعضاء النباتية ثم ملاحظتها باستخدام المجهر الخفيف. يمكن تطبيق الفلوروكروم المترافق مع أجغلوتينين جنين القمح على الفطريات واحتضانه مع Calcofluor White لتسليط الضوء على جدران الخلايا النباتية في المجهر البؤري. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تفصيل منهجيات المسح المجهري الإلكتروني ونقله لبساتين الفاكهة المتغايرة ، ويتم استكشاف إمكانيات تطبيق هذه البروتوكولات في النباتات ذات الصلة. يتم وصف الإنبات التكافلي لبذور السحلية (أي في وجود الفطريات الفطرية) في البروتوكول بالتفصيل ، إلى جانب إمكانيات إعداد الهياكل التي تم الحصول عليها من مراحل مختلفة من الإنبات للتحليل باستخدام المجهر الضوئي والمشبك والإلكتروني.

بعد المراحل الأساسية لتثبيت الأنسجة النباتية ينتج هياكل خلوية مشابهة قدر الإمكان للحالة الحية ، مع الأخذ في الاعتبار مورفولوجيا المكونات والأنسجة الخلوية وحجمها وتنظيمها المكاني16. لاحظ هذه السمات في العينات بعد التثبيت الكيميائي (الشكل 4). يمثل ا?...

Watch this Scientific Journal Video about Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds at JoVE.com

Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds

يهدف هذا البروتوكول إلى توفير إجراءات مفصلة لجمع وتثبيت وصيانة عينات النباتات المتغايرة ، وتطبيق تقنيات الفحص المجهري المختلفة مثل المسح المجهري الإلكتروني ونقله ، والمجهر الضوئي ، والكونفوكال ، والمجهر الفلوري لدراسة الاستعمار الفطري في الأنسجة النباتية والبذور المنبتة بالفطريات الفطرية.

تقنيات الفحص المجهري لتفسير الاستعمار الفطري في أنسجة النباتات المتغايرة والإنبات التكافلي للبذور

Structural botany is an indispensable perspective to fully understand the ecology, physiology, development, and evolution of plants. When researching ...

يقدم البروتوكول تقنيات الفحص المجهري المتنوعة المطبقة لفهم الاستعمار الفطري في النباتات المتغايرة ، من الجمع إلى إعداد العينات بالتفصيل وتشمل الخطوات الأساسية. يمكن تطبيق هذه التقنيات على مختلف النباتات المتغايرة ، وحتى على مواد النبات بخلاف المتغايرات المتغايرة. ترتبط هذه الطريقة بشكل أساسي بعلم النبات الهيكلي ويمكن أن توفر أيضا رؤى ثاقبة حول التفاعلات الفطرية ، وعلم وظائف الأعضاء ، والبيولوجيا الإنجابية ، والتطور ، والبيئة للنباتات المتغايرة للفطريات.للبدء ، قم بجمع النباتات المتغايرة من خلال استكشاف التربة حول قاعدة النبات ، مع الحرص على عدم إتلاف الأعضاء تحت الأرض. أيضا ، تجنب سحب النباتات من الأرض لمنع فصل الأعضاء الهوائية عن الأعضاء الجوفية. بعناية ، قم بالحفر حول الهياكل الهوائية باستخدام مجرفة البستنة أثناء استكشاف الأعضاء الجوفية مثل الجذور والسيقان والجذور وأجهزة التخزين دون الإضرار بهذه الهياكل.قم بإزالة جزيئات التربة للحفاظ على الهياكل الهشة وغسل هذه الأعضاء بدقة بماء الصنبور لشطف جزيئات التربة المتبقية قبل تثبيت العينات. تتطلب النباتات المتغايرة المرتبطة بفضلات الأوراق مزيدا من الاهتمام. وبالتالي ، قم بجمع الأعضاء الحساسة المتصلة بالمواد المتحللة بعناية من خلال hyphae دون سحبها من الهياكل المتصلة.الحفاظ على الهياكل مع مثل هذه الاتصالات وجمع القمامة للتحليل. لتحليل المجهر الإلكتروني الناقل ، قسم العينات التي يتراوح سمكها من 3 إلى 4 ملليمترات داخل قطرة من الغلوتارالدهيد الصوديوم كاكوديليت المخزن المؤقت إلى أقسام أصغر من 1 إلى 2 ملليمتر. تخلص من الحواف المقطوعة خارج القطرة.تأكد من إجراء عملية التثبيت في موقع التجميع مباشرة بعد جمع النباتات. انقل المقاطع على الفور إلى أنبوب تجميع بحجم مثبت أكبر بأكثر من 10 مرات من حجم العينات لأنه مثبت مضاف. للتحليل السطحي للضجيج السطحي في الأعضاء ، وخاصة في الأعضاء الجوفية وتلك التي تتلامس مع فضلات الأوراق.راقب المواد الطازجة أو الثابتة تحت المجهر التشريحي عند تكبير 7.5x أو أعلى. ابحث عن مجالات الاهتمام التي تسترشد بها hyphae السطحية و rhizomorphs. حدد العينات التي تحتوي على مناطق من الريزومورفات السطحية حيث يمكن تقسيمها لتصور بيلوتون ولفائف hyphae داخل الخلايا القشرية في الجذور والسيقان.تحضير 0.2 ملليغرام لكل ملليلتر من فلوروكروم جرثومة القمح المترافقة و 1٪ من المحاليل البيضاء calcofluor في 0.1 مخزن فوسفات مولي كما هو موضح في مخطوطة النص. الآن ، احتضن الأقسام الموجودة على الشرائح الزجاجية عن طريق تغطيتها بشكل صحيح بمحلول اقتران فلوروكروم جرثومة القمح لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة ، اغسل الأقسام بمخزن مؤقت للفوسفات المولي 0.1 واحتضنها في محلول calcofluor كوسيط تركيب.بعد ذلك ، ضع زلات الغطاء على الشرائح وراقبها تحت مجهر ضوئي متحد البؤرة أو التألق باستخدام المرشحات المشار إليها. بعد تثبيت العينات ، وإجراء الجفاف ، وتخزينها في 70٪ من الإيثانول ، قم بتعريض أي سطح مرغوب فيه لمسح التحليل المجهري الإلكتروني باستخدام شفرة حلاقة حادة وجديدة لإجراء تخفيضات بحركة أحادية الاتجاه. إذا لزم الأمر ، استخدم مجهر ستيريو لاختيار العينات والنظر في منطقة الكعب المعدني أثناء تحديد أحجام العينات.علاوة على ذلك ، جفف العينات في سلسلة إيثانوليك. الحفاظ على عينات صغيرة وحساسة لمدة 30 دقيقة في كل تركيز وعينات أكبر وأكثر كثافة لمدة 1 ساعة. بعد ذلك ، قم بطي المغلفات الصغيرة باستخدام المناديل الورقية لتنظيم العينات للخطوات التالية.يمكن التعامل مع العينات الأكبر حجما بدون ظرف. قم بتسمية المغلفات باستخدام قلم رصاص واحتفظ بسجل للعينات. بعناية ، ضع العينات داخل المغلفات باستخدام فرشاة الطلاء.الآن ، احتفظ بهذه العينات في الإيثانول المطلق. تابع على الفور تجفيف النقاط الحرجة من خلال تشغيل مجفف النقاط الحرجة وفقا لإجراءات التشغيل القياسية. لهذا ، ضع العينات في الإيثانول المطلق في حامل العينة وضعها داخل غرفة ضغط مجفف النقطة الحرجة.يذوب السائل الوسيط في السائل الانتقالي عند نقطة ثاني أكسيد الكربون الحرجة ، وبالتالي تجفيف العينات. نظرا لأن إعادة امتصاص الرطوبة الجوية يمكن أن تدمر العينات ، فقم بتخزينها في حاوية تجفيف مباشرة بعد تجفيف النقطة الحرجة. قبل تركيب العينات على الكعب المعدني ، ضع القفازات للتلاعب بالكعب.اغمرها في الأسيتون لمدة 5 دقائق للتخلص من أي دهون واتركها تجف. تحت مجهر ستيريو ، قم بإصلاح العينات الموجودة على الكعب باستخدام شريط لاصق كربوني موصل على الوجهين ووضعها. الموقع من الأعلى هو المنظور الوحيد الممكن في مسح صور المجهر الإلكتروني.لمعالجة العينات، استخدم ملاقط النقاط الدقيقة. عادة ما يكون جزء العينة الذي تلمسه الملقط تالفا. لذا كن حذرا وحاول لمس الأجزاء الموضوعة بعيدا عن مجالات الاهتمام.الحفاظ على الكعب مع عينات في طبق بتري مختوم مع هلام السيليكا. بعد ذلك ، تابع طلاء الرذاذ لإيداع طبقة من الذهب أو البلاتين على سطح العينات في جو منخفض الضغط من الغاز الخامل باتباع إجراءات التشغيل القياسية. يعتمد سمك الطلاء على تضاريس العينة وعادة ما يتراوح بين 15 إلى 40 نانومتر.أخيرا ، حافظ على الكعوب المطلية في طبق بتري مغلق مع هلام السيليكا الذي يحتفظ بالرطوبة. يمكن تخزين العينات بهذه الطريقة لأسابيع. استخدم المجهر الإلكتروني الماسح لتحليل هذه العينات.يضرب شعاع الإلكترون العينة في الفراغ أثناء المسح المجهري الإلكتروني ويتم تفسير انبعاث الإشارة من هذا التفاعل على أنه صور. تأكد من أن المحاليل والمواد المستخدمة في الإنبات التكافلي للبذور معقمة. لتجنب التلوث.ابدأ بتعقيمها لمدة 20 دقيقة عند 121 درجة مئوية. في غطاء تدفق الهواء الرقائقي ، قم بتطهير الثمار والبذور بشكل سطحي عن طريق غمرها في محلول هيبوكلوريت الصوديوم الذي يحتوي على 2٪ من الكلور النشط. يمكن غمر البذور الرفيعة والهشة في محلول هيبوكلوريت الصوديوم المخفف 1: 1.بعد التطهير ، استعيد البذور عن طريق تصفيتها باستخدام نسيج زيروغرافي. اغسل الثمار والبذور ثلاث مرات في ماء مقطر معقم لإزالة محلول هيبوكلوريت قبل الشروع في اختبارات الإنبات. إذا لزم الأمر ، قم بتخزينها في مظاريف ورق ترشيح داخل قوارير زجاجية مع هلام السيليكا عند 4 درجات مئوية وأغلق القوارير بإحكام وأغلقها بفيلم التشبث ، ثم قم بتقييم فعالية عملية الغسيل عن طريق نقل بعض قطرات الماء من الغسيل الأخير إلى أجار سكر العنب البطاطس.للإنبات التكافلي لبذور السحلية ، احتضن البذور التي تزيد عن 1 إلى 2 سم من أقراص ورق الترشيح المعقمة الموضوعة في أطباق بتري التي تحتوي على وسط ثقافة أجار الشوفان. الآن ، قم بتلقيح مركز طبق بتري بجزء من وسط الثقافة الذي يحتوي على الميسيليوم من الفطريات المعزولة المختارة. قم بإغلاق أطباق بتري بفيلم التشبث واحتضنها في الظلام عند حوالي 25 درجة مئوية أو درجة حرارة الغرفة ، اعتمادا على نمو الفطريات.تحضير بعض الأطباق بالبذور وبدون تلقيح فطري كعنصر تحكم سلبي لاختبار الإنبات. تحليل نتائج الإنبات أسبوعيا من خلال جمع البيانات الكمية والنوعية وتصوير البروتوكورمات والشتلات. يمكن التعرف بسهولة على الريزومورفات عادة كهياكل مظلمة تشبه الأحذية.يمكن لليد الحرة أو غيرها من الطرق للحصول على أقسام أكثر سمكا من 10 ميكرومتر أن تظهر بشكل أفضل البيلوزونات وتوفر صورا أكثر تمثيلا للأنماط الفطرية للاستعمار. يمكن أن تكون الأقسام اليدوية أيضا مناسبة لتحليل hyphae في تضخيم أعلى. على الرغم من أن التفاصيل يتم تحقيقها بشكل أفضل في أقسام أرق.يمكن التعرف بسهولة على جدران الخلايا الثانوية في عناصر xylem من خلال اللون الفاتح الذي يكتسبه التولويدين . وفي الوقت نفسه ، يتم تحديد عناصر اللحاء المكونة فقط من جدران الخلايا الأولية من خلال جدران الخلايا الأرق والأكثر قتامة. يمكن رؤية القطع الأثرية بواسطة التألق الذاتي في أقسام راتنج الميثاكريليت غليكول.عادة ما ترتبط هذه القطع الأثرية بتركيز الفلوروكروم ويمكن تجنبها عن طريق غسل العينات لعدد أكبر من المرات باستخدام المخزن المؤقت. يظهر القسم الحر من الجذر hyphae الداخلية والخارجية. يمكن رؤية نفس العضو عن طريق مسح المجهر الإلكتروني مع وفرة من الريزومورفات و hyphae الفردية على سطحه.تنبت معظم أنواع بساتين الفاكهة في غضون بضعة أسابيع بعد إصابتها بالفطريات الملقحة أو حتى ما يقرب من أكثر من شهر. يمكن تطبيق الضوء في المجهر الإلكتروني الماسح على الزهور والفواكه والبذور للتحقيق في البيولوجيا التناسلية أو النباتات المتغايرة الفطرية. يمكن أيضا اختبار الإنبات التكافلي للبذور في بساتين الفاكهة ذاتية التغذية.

Research

JoVE Journal

Biology

Obtaining Hemocytes from the Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes and Observing their Adherence to Symbiotic and Non-Symbiotic Bacteria

Obtaining Hemocytes from the Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes and Observing their Adherence to Symbiotic and Non-Symbiotic Bacteria

الحصول على Hemocytes من الحبار قصير الذيل هاواي Euprymna scolopes مراقبة وتمسكهم البكتيريا التكافلية وغير التكافلية ،

Studies concerning the role of the immune system in mediating molecular signaling between beneficial bacteria and their hosts have, in recent years, made ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

أعربت المشبك التصحيح وتقنيات الإرواء لدراسة في قنوات ايون القيطم البويضات

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

جنبا إلى جنب تجميد الضغط العالي والسريع تجميد استبدال الأنسجة النباتية للنقل المجهر الإلكتروني

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

قياس المكانية والزمانية كاليفورنيا<sup&gt; 2+</sup&gt; إشارات في النباتات نبات الأرابيدوبسيس

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

تحليل الالتهام الذاتي في<em&gt; البنسليوم العسجدية</em&gt; باستخدام التجويع وسادات في تركيبة مع المجهر مضان

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

مسح بروتوكولات المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) لإشكالية النبات، طلائعيات بيضية، وعينات الفطرية

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

المجهر الضوئي ورقة الإسفار من جذور النباتات التي تنمو على سطح الأرض من هلام

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

توصيف تكلس الأحداث عن طريق لايف البصرية والمجهر الإلكتروني تقنيات في Tubeworm البحرية

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

إدارة بسيطة وفعالة والتصور من المجهرية الدقيقة في الدورة الدموية للأسماك الصغيرة باستخدام الحقن الكلي

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

Micron-scale Phenotyping Techniques of Maize Vascular Bundles Based on X-ray Microcomputed Tomography

تقنيات Phenotyping ميكرون-مقياس الذرة حزم وعائية استناداً إلى التصوير المقطعي بالأشعة السينية ميكروكومبوتيد

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a ...