Name: microscopy techniques for interpreting fungal colonization in mycoheterotrophic plants tissues and symbiotic germination of seeds
Uploaded: 2022-05-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds at JoVE.com

Forfatterne takker finansiering fra FAEPEX og FAPESP (2015/26479-6). MPP takker Capes for sit kandidatgradsstipendium (proces 88887.600591/2021-00) og CNPq. JLSM takker CNPq for produktivitetstilskud (303664/2020-7). Forfatterne takker også adgangen til udstyr og bistand fra LME (Laboratory of Electron Microscopy - IB / Unicamp), INFABiC (National Institute of Science and Technology on Photonics Applied to Cell Biology - Unicamp) og LaBiVasc (Laboratory of Vascular Biology - DBEF / IB / Unicamp); LAMEB (UFSC) og Eliana de Medeiros Oliveira (UFSC) for bidrag til kryobeskyttelsesprotokollen LME for bidrag til TEM-protokollen.

1. Indsamling, fastsættelse og vedligeholdelse af prøver
BEMÆRK: Fuldt MH-planter kan normalt findes i den mørke skovundergrund 12,13, hovedsageligt i fugtige og kuldrige, mens delvist MH-planter kan findes i mere åbne skove 12,13. MH-planter har normalt veludviklede underjordiske organer i forskellige former og størrelser.
<ol><li>Når du samler MH-art...

<ol>
	<li>Evert, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Esau&#8217;s Plant Anatomy: Meristems, Cells, and Tissues of the Plant Body: Their Structure, Function, and Development. , (2006).</li><li>Yeung, E. C. T., Stasolla, C., Sumner, M. J., Huang, B. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plant Microtechniques and Protocols. , (2015).</li><li>Sokoloff, D. D., Jura-Morawiec, J., Zoric, L., Fay, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+anatomy:+at+the+heart+of+modern+botany.">Plant anatomy: at the heart of modern botany.</a> Botanical Journal of the Linnean Society. 195 (3), 249-253 (2021).</li><li>Leake, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+myco-heterotrophic+(&#8216;saprophytic&#8217;)+plants.">The biology of myco-heterotrophic (&#8216;saprophytic&#8217;) plants.</a> New Phytologist. 127 (2), 171-216 (1994).</li><li>Bidartondo, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolutionary+ecology+of+myco-heterotrophy.">The evolutionary ecology of myco-heterotrophy.</a> New Phytologist. 167 (2), 335-352 (2005).</li><li>Imhof, S., Massicotte, H. B., Melville, L. H., Peterson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subterranean+morphology+and+mycorrhizal+structures.">Subterranean morphology and mycorrhizal structures.</a> Mycoheterotrophy. , 157-214 (2013).</li><li>Rasmussen, H. N., Rasmussen, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchid+mycorrhiza:+implications+of+a+mycophagous+life+style.">Orchid mycorrhiza: implications of a mycophagous life style.</a> Oikos. 118 (3), 334-345 (2009).</li><li>Rasmussen, H. N., Dixon, K. W., Jers&#225;kov&#225;, J., T&#283;&#353;itelov&#225;, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+and+seedling+establishment+in+orchids:+a+complex+of+requirements.">Germination and seedling establishment in orchids: a complex of requirements.</a> Annals of Botany. 116 (3), 391-402 (2015).</li><li>Zettler, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terrestrial+orchid+conservation+by+symbiotic+seed+germination:+techniques+and+perspectives.">Terrestrial orchid conservation by symbiotic seed germination: techniques and perspectives.</a> Selbyana. 18 (2), 188-194 (1997).</li><li>Stewart, S. L., Kane, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symbiotic+seed+germination+and+evidence+for+in+vitro+mycobiont+specificity+in+Spiranthes+brevilabris+(Orchidaceae)+and+its+implications+for+species-level+conservation.">Symbiotic seed germination and evidence for in vitro mycobiont specificity in Spiranthes brevilabris (Orchidaceae) and its implications for species-level conservation.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Plant. 43 (3), 178-186 (2007).</li><li>Zhao, D. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchid+reintroduction+based+on+seed+germination-promoting+mycorrhizal+fungi+derived+from+protocorms+or+seedlings.">Orchid reintroduction based on seed germination-promoting mycorrhizal fungi derived from protocorms or seedlings.</a> Frontiers in Plant Science. 12, 701152 (2021).</li><li>Selosse, M. A., Roy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+plants+that+feed+on+fungi:+facts+and+questions+about+mixotrophy.">Green plants that feed on fungi: facts and questions about mixotrophy.</a> Trends in Plant Science. 14 (2), 64-70 (2009).</li><li>Merckx, V. S. F. T., Mennes, C. B., Peay, K. G., Geml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+diversification.">Evolution and diversification.</a> Mycoheterotrophy: The Biology of Plants Living on Fungi. , 215-244 (2013).</li><li>Boon, M. E., Drijver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routine+Cytological+Staining+Techniques:+Theoretical+Background+and+Practice.">Routine Cytological Staining Techniques: Theoretical Background and Practice.</a> Macmillan International Higher Education. , (1986).</li><li>Karnovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+formaldehyde-glutaraldehyde+fixative+of+high+osmolality+for+use+in+electron+microscopy.">A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 27 (2), 137-138 (1964).</li><li>Hayat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fixation for Electron Microscopy. , (1981).</li><li>Roland, J. C., Vian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+preparation+and+staining+of+thin+sections.">General preparation and staining of thin sections.</a> Electron Microscopy of Plant Cells. 1, 675 (1991).</li><li>Gerrits, P. O., Horobin, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycol+methacrylate+embedding+for+light+microscopy:+basic+principles+and+trouble-shooting.">Glycol methacrylate embedding for light microscopy: basic principles and trouble-shooting.</a> Journal of Histotechnology. 19 (4), 297-311 (1996).</li><li>Zhang, Z., Niu, L., Chen, X., Xu, X., Ru, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+plant+cryosection.">Improvement of plant cryosection.</a> Frontiers in Biology. 7 (4), 374-377 (2012).</li><li>Bene&#352;, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+media+improving+freeze-sectioning+of+plant+material.">On the media improving freeze-sectioning of plant material.</a> Biologia Plantarum. 15 (1), 50-56 (1973).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+slides+and+coverslips+for+microscopy.">Preparation of slides and coverslips for microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (5), (2008).</li><li>Sakai, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+method+for+differential+staining+of+paraffin+embedded+plant+material+using+toluidine+blue+O.">Simple method for differential staining of paraffin embedded plant material using toluidine blue O.</a> Stain Technology. 48 (5), 247-249 (1973).</li><li>O&#8217;Brien, T., Feder, N., McCully, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polychromatic+staining+of+plant+cell+walls+by+toluidine+blue+O.">Polychromatic staining of plant cell walls by toluidine blue O.</a> Protoplasma. 59 (2), 368-373 (1964).</li><li>Ventrella, M. C., Almeida, A. L., Nery, L. A., Coelho, V. P. d. e. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#233;todos+Histoqu&#237;micos+Aplicados+&#224;s+Sementes.">M&#233;todos Histoqu&#237;micos Aplicados &#224;s Sementes.</a> Universidade Federal de Vi&#231;osa. , (2013).</li><li>Pearse, A. G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histochemistry, Theoretical and Applied. , (1960).</li><li>Andrade-Linares, D. R., Franken, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+endophytes+in+plant+roots:+taxonomy,+colonization+patterns,+and+functions.">Fungal endophytes in plant roots: taxonomy, colonization patterns, and functions.</a> Symbiotic Endophytes. , 311-334 (2013).</li><li>Wymer, C. L., Beven, A. F., Boudonck, K., Lloyd, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy+of+plant+cells.">Confocal microscopy of plant cells.</a> Confocal Microscopy Methods and Protocols. , 103-130 (1999).</li><li>Marques, J. P. R., Soares, M. K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+de+T&#233;cnicas+Aplicadas+&#224;+Histopatologia+Vegetal.">Manual de T&#233;cnicas Aplicadas &#224; Histopatologia Vegetal.</a> FEALQ. , (2021).</li><li>Navarro, B. L., Marques, J. P. R., Appezzato-da-Gl&#243;ria, B., Sp&#243;sito, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histopathology+of+Phakopsora+euvitis+on+Vitis+vinifera.">Histopathology of Phakopsora euvitis on Vitis vinifera.</a> European Journal of Plant Pathology. 154 (4), 1185-1193 (2019).</li><li>Marques, J. P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugarcane+cell+wall-associated+defense+responses+to+infection+by+Sporisorium+scitamineum.">Sugarcane cell wall-associated defense responses to infection by Sporisorium scitamineum.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 698 (2018).</li><li>Jeffree, C. E., Read, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ambient-and+low-temperature+scanning+electron+microscopy.">Ambient-and low-temperature scanning electron microscopy.</a> Electron Microscopy of Plant Cells. , 313-413 (1991).</li><li>Bozzola, J. J., Russell, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Electron Microscopy: Principles and Techniques for Biologists. , (1999).</li><li>Murray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+transmission+and+scanning+electron+microscopy.">Basic transmission and scanning electron microscopy.</a> Introduction to electron Microscopy for Biologists. , 3-18 (2008).</li><li>. Glossary of TEM terms Available from: <a target="_blank" href="https://www.jeol.co.jp/en/words/emterms/">https://www.jeol.co.jp/en/words/emterms/</a> (2021)</li><li>Seaton, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchid+seed+and+pollen:+a+toolkit+for+long-term+storage,+viability+assessment+and+conservation.">Orchid seed and pollen: a toolkit for long-term storage, viability assessment and conservation.</a> Orchid Propagation: From Laboratories to Greenhouses&#8212;Methods and Protocols. , 71-98 (2018).</li><li>Otero, J. T., Ackerman, J. D., Bayman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+mycorrhizal+preferences+between+two+tropical+orchids.">Differences in mycorrhizal preferences between two tropical orchids.</a> Molecular Ecology. 13 (8), 2393-2404 (2004).</li><li>Koch, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marasmioid+rhizomorphs+in+bird+nests:+Species+diversity,+functional+specificity,+and+new+species+from+the+tropics.">Marasmioid rhizomorphs in bird nests: Species diversity, functional specificity, and new species from the tropics.</a> Mycologia. 112 (6), 1086-1103 (2020).</li><li>Webster, J., Weber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Introduction to Fungi. , (2007).</li><li>Sisti, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+non-mycorrhizal+fungi+in+germination+of+the+mycoheterotrophic+orchid+Pogoniopsis+schenckii+Cogn.">The role of non-mycorrhizal fungi in germination of the mycoheterotrophic orchid Pogoniopsis schenckii Cogn.</a> Frontiers in Plant Science. 10, 1589 (2019).</li><li>Martos, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+recruitment+of+saprotrophic+fungi+as+mycorrhizal+partners+by+tropical+achlorophyllous+orchids.">Independent recruitment of saprotrophic fungi as mycorrhizal partners by tropical achlorophyllous orchids.</a> New Phytologist. 184 (3), 668-681 (2009).</li><li>Alves, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+development+and+genetic+structure+of+the+mycoheterotrophic+orchid+Pogoniopsis+schenckii+Cogn.">Reproductive development and genetic structure of the mycoheterotrophic orchid Pogoniopsis schenckii Cogn.</a> BMC Plant Biology. 21 (1), 332 (2021).</li><li>Merckx, V. S. F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycoheterotrophy:+an+introduction.">Mycoheterotrophy: an introduction.</a> Mycoheterotrophy: The Biology of Plants Living on Fungi. , 1-17 (2013).</li><li>Hall, J. L., Hawes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Electron Microscopy of Plant Cells. , (1991).</li></ol>

Billedanalyser i planteanatomi og morfologi har et vigtigt potentiale til at opfylde mål og hjælpe med at forstå forholdet mellem mycoheterotrofe planter og deres uundværlige svampeendofytter, som det fremgår af undersøgelser af underjordiske organer 6,40, strukturelle analyser af symbiotisk spiring af frø39 og luft- og reproduktionsstrukturer 41 . Strukturel botanik, på trods af at have mistet sin prestige ...

Strukturel forskning i botanik, der dækker plantemorfologi og anatomi, er grundlæggende for at forstå hele organismen1,2 og giver uundværlige perspektiver til at integrere og bidrage til viden om økologi, fysiologi, udvikling og udvikling af planter3. Metoder inden for plantemorfologi og anatomi omfatter i øjeblikket protokoller, udstyr og viden, der er udviklet for nylig såvel som for mere end et århundrede siden2. Den kontinuerlige udførelse og tilpasning af klassiske metoder (f.eks. lysmikroskopi) sammen med nyere teknikker (f.eks. konfokal mikroskopi, røntgenmikrotomografi) har det samme væsentlige grundlag: teoretisk viden, der muliggør udvikling af en metode.
Det vigtigste værktøj i planteanatomi og morfologi er billedet. På trods af den misforståelse, at sådanne analyser er enkle observationer, der giver plads til subjektive fortolkninger2, kræver analyse og forståelse af billeder på dette område kendskab til de anvendte metoder (udstyr, analysetype, metodologiske procedurer), cellekomponenter, histokemi og plantekroppen (vævsorganisation og funktion, ontogeni, morfologiske tilpasninger). Fortolkning af de billeder, der er opnået via en række forskellige metoder, kan føre til korrelering af form og funktion, dechifrering af en strukturs kemiske sammensætning, bekræftelse af beskrivelse af taxa, forståelse af infektioner med fytopatogener og andre sådanne vurderinger.
Når man forsker i mycoheterotrofe (MH) planter (dvs. ikke-fotosyntetiske planter, der opnår kulstof fra mycorrhizal svampe4,5), kan bemærkelsesværdige aspekter af deres strukturelle tilpasninger, mønstre af vævskolonisering af svampe og underjordiske organers morfoanatomi oplyse deres udviklingsstrategier og forhold til hyfer, som er kilden til næringsstoffer. De underjordiske organer af MH-planter viser normalt vigtige tilpasninger relateret til deres tilknytning til jordsvampe, og det er derfor vigtigt at udføre disse anatomiske og morfologiske undersøgelser6. MH-arters luftorganer bør ikke ignoreres, da endofytter også kan være til stede i disse væv, selvom de ikke er mycorrhizal svampe (personlige observationer, ikke offentliggjort endnu).
Udover den veletablerede væsentlighed af mycorrhizal svampe tilknytning til MH-arter i hele deres livscyklus7, har hver orkidéart, selv de autotrofiske, et indledende obligatorisk mycoheterotrofisk stadium i naturlige miljøer. Det opstår, fordi orkideernes embryo er udifferentieret og mangler endosperm eller cotyledoner, hvilket er ude af stand til at udvikle sig og etablere sig i naturlige miljøer uden ernæringsmæssig støtte fra svampepartnere 4,8. I betragtning af at symbiotiske spiringsprotokoller ikke kun kan anvendes på MH-arter, men også på fotosyntetiserende orkideer, der sigter mod at undersøge orkidésvampspecificitet i spiring og protocormudvikling, en meget anvendt metode i initiativer til bevarelse af truede arter 9,10,11.
I denne metodesamling beskriver vi vigtige trin involveret i indsamling, fiksering og opbevaring af MH-planteprøver til anatomiske undersøgelser (afsnit 1), overfladeanalyse og prøveudvælgelse (afsnit 2), sektionsmetoder (frihånd: afsnit 3, mikrotomi: afsnit 4, kryomikrotomi: sektion 5), farvning og montering (afsnit 6), fluorescens og konfokal mikroskopi af svampeendofytter (afsnit 7), scanningselektronmikroskopi (afsnit 8), og transmissionselektronmikroskopi (afsnit 9). Derudover beskriver vi en symbiotisk spiringsmetode til orkidéfrø (MH og autotrofisk, afsnit 10), da de tidligere nævnte billeddannelsesmetoder med succes kan anvendes til at analysere svampekolonisering af frø, protocormer og frøplanter i spiringsprocessen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63777/63777fig01.jpg"> Figur 1: Skematisk opsummering af billeddannelsesmetoder. Skemaerne giver indikationer af protokoltrin, hvor de er detaljerede. Forkortelser: GMA = glycolmethacrylat, OCT = optimal skæretemperaturforbindelse, SEM = scanningselektronmikroskopi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63777/63777fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
De mikroskopiteknikker, der er beskrevet her i detaljer (figur 1), indledes med følgende væsentlige trin: indsamling, fiksering, dehydrering, indlejring og sektionering af prøver. Da trinene er variable (figur 1) afhængigt af den eller de valgte teknikker, er det vigtigt at tænke fremad i betragtning af de fikseringsmidler, der skal fremstilles og transporteres til indsamlingsstedet, hvordan prøverne skal forberedes inden fastgørelse, de dehydreringsprocesser, der skal anvendes (afsnit 1), og forskellige indlejringsmuligheder og sektioneringsmetoder (afsnit 4, 5, og 9). Figur 1 opsummerer sekventielt alle de trin, der kræves for hver mikroskopiteknik, der er grundigt beskrevet nedenfor.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179124</td>
			<td>(for SEM stubs mounting)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar-agar (AA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1296</td>
			<td>(for seeds germination tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcofluor White Stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18909</td>
			<td>fluorescent dye (detects cellulose)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate Buffer Solution, 0.09M pH 4.8</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2488</td>
			<td>(for toluidine blue O staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive Double-Sided Carbon Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-285-81</td>
			<td>(for SEM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper Grids</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4776</td>
			<td>(for TEM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical-point dryer</td>
			<td>Balzers</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>(= stereomicroscope, any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Entellan</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>107960</td>
			<td>rapid mounting medium for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol, pure (&#8805;99.5%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>459836</td>
			<td>(= ethanol, for dehydration processes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution, 37%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252549</td>
			<td>(for NBF solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td>histological tissue fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin capsules for TEM</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-248-71</td>
			<td>(for resin polymerisation in TEM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin solution, 2% in H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1393</td>
			<td>(dilute for slides preparation - OCT adherence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution, 25%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6257</td>
			<td>(for Karnovsky&#8217;s solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoResin</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>14702231731</td>
			<td>glycol methacrylate (GMA) embedding kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>207772</td>
			<td>(for Lugol solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead(II) nitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>228621</td>
			<td>Pb(NO3)2 (for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR White acrylic resin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9774</td>
			<td>hydrophilic acrylic resin for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lugol solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>62650</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal stubs for specimen mounts</td>
			<td>Rave Scientific</td>
			<td></td>
			<td>(for SEM, different models)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>manual rotary microtome or other model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oatmeal agar (OMA)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>O3506</td>
			<td>(for seeds germination tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Compound, Tissue-Tek</td>
			<td>Sakura Finetek USA</td>
			<td>4583</td>
			<td>embedding medium for frozen tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201030</td>
			<td>OsO4 (for TEM postfixation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793</td>
			<td>sealing thermoplastic film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td>(for Karnovsky&#8217;s solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine solution, 0.1% in H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td>(for slides preparation - OCT adherence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep Slides</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0425</td>
			<td>poly-L-lysine coated glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Molding Cup Trays</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>17177A-3</td>
			<td>(6x8x5 mm, for embbeding samples in GMA resin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Molding Cup Trays</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>17177C-3</td>
			<td>(13x19x5 mm, for embbeding samples in GMA resin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221945</td>
			<td>(for Lugol solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato Dextrose Agar (PDA)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>70139</td>
			<td>(for seeds germination tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscope</td>
			<td>Jeol</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silane [(3-Aminopropyl)triethoxysilane]</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3648</td>
			<td>(for slides preparation - OCT adherence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silane-Prep Slides</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4651</td>
			<td>glass slides coated with silane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel orange, granular</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>10087</td>
			<td>(for dessicating processes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0250</td>
			<td>(for glutaraldehyde-sodium cacodylate buffer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881</td>
			<td>NaOH (for Karnovsky&#8217;s solution preparation and TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>425044</td>
			<td>NaClO (for seeds surface disinfection)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic, anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71640</td>
			<td>Na2HPO4 (for NBF solution and PB preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td>NaH2PO4&#183;H2O (for NBF and PB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sputter coater</td>
			<td>Balzers</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td>C12H22O11 (for cryoprotection and germination test)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan III</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4131</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan IV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>198102</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan Black B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>199664</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(3 mL, any brand, for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter Unit, Millex-GV 0.22 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033R</td>
			<td>PVDF, 33 mm, gamma sterilized (for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tek Bond Super Glue 793</td>
			<td>Tek Bond Saint-Gobain</td>
			<td>78072720018</td>
			<td>liquid cyanoacrylate adhesive, medium viscosity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3260</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Jeol</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triphenyltetrazolium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8877</td>
			<td>(for the tetrazolium test in seeds germination)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1804</td>
			<td>Na3(C6H5O7)&#183;2H2O (for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-607-645</td>
			<td>UO2(CH3COO)2 (for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td>TermoFisher Scientific</td>
			<td>W11261</td>
			<td>fluorescent dye-conjugated lectin (detects sialic acid and N-acetylglucosaminyl residues)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microscopy techniques for interpreting fungal colonization in mycoheterotrophic plants tissues and symbiotic germination of seeds

Strukturel botanik er et uundværligt perspektiv for fuldt ud at forstå økologi, fysiologi, udvikling og udvikling af planter. Når man forsker i mycoheterotrofe planter (dvs. planter, der får kulstof fra svampe), kan bemærkelsesværdige aspekter af deres strukturelle tilpasninger, mønstre af vævskolonisering af svampe og underjordiske organers morfoanatomi oplyse deres udviklingsstrategier og deres forhold til hyfer, kilden til næringsstoffer. En anden vigtig rolle af symbiotiske svampe er relateret til spiring af orkidéfrø; alle Orchidaceae-arter er mycoheterotrofe under spiring og frøplantestadium (indledende mycoheterotrofi), selv dem, der fotosyntetiserer i voksne stadier. På grund af manglen på ernæringsmæssige reserver i orkidéfrø er svampesymbionter afgørende for at tilvejebringe substrater og muliggøre spiring. Analyse af spiringsstadier ved strukturelle perspektiver kan også besvare vigtige spørgsmål vedrørende svampeinteraktionen med frøene. Forskellige billeddannelsesteknikker kan anvendes til at afsløre svampeendofytter i plantevæv, som det foreslås i denne artikel. Frihånd og tynde sektioner af planteorganer kan farves og derefter observeres ved hjælp af lysmikroskopi. En fluorokrom, der er konjugeret til hvedekimagglutinin, kan påføres svampene og co-inkuberes med Calcofluor White for at fremhæve plantecellevægge i konfokal mikroskopi. Derudover er metoderne til scanning og transmissionselektronmikroskopi detaljeret for mycoheterotrofe orkideer, og mulighederne for at anvende sådanne protokoller i beslægtede planter undersøges. Symbiotisk spiring af orkidéfrø (dvs. i nærvær af mycorrhizal svampe) er beskrevet i protokollen detaljeret sammen med muligheder for at forberede strukturerne opnået fra forskellige spiringsstadier til analyser med lys-, konfokal og elektronmikroskopi.

Efter de væsentlige stadier af fastgørelse af plantevæv giver cellulære strukturer så ens som muligt til den levende tilstand i betragtning af morfologien, volumen og rumlig organisering af cellulære komponenter og væv16. Overhold sådanne træk i prøverne efter kemisk fiksering (figur 4). Figur 4C-F repræsenterer tilstrækkeligt faste prøver under lysmikroskopi. Efter de beskrevne fikseringspro...

Watch this Scientific Journal Video about Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds at JoVE.com

Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds

Denne protokol har til formål at give detaljerede procedurer til indsamling, fiksering og vedligeholdelse af mycoheterotrofe planteprøver ved anvendelse af forskellige mikroskopiteknikker såsom scanning og transmissionselektronmikroskopi, lys-, konfokal og fluorescensmikroskopi for at studere svampekolonisering i plantevæv og frø spiret med mycorrhizal svampe.

Mikroskopiteknikker til fortolkning af svampekolonisering i mycoheterotrofiske plantevæv og symbiotisk spiring af frø

Structural botany is an indispensable perspective to fully understand the ecology, physiology, development, and evolution of plants. When researching ...

Protokollen præsenterer forskellige mikroskopiteknikker, der anvendes til at forstå svampekoloniseringen i mycoheterotrofe planter, fra indsamling til forberedelse af prøver i detaljer og inkluderer væsentlige trin. Sådanne teknikker kan anvendes på forskellige mycoheterotrofe planter og endda på en plantes andre materialer end mycoheterotrophics. Denne metode er hovedsageligt relateret til strukturel botanik og kan også give indsigt i mycorrhizal interaktioner, fysiologi, reproduktiv biologi, evolution og økologi af mycoheterotrofe planter.Til at begynde med skal du samle de mycoheterotrofe planter ved at udforske jorden omkring plantebasen og passe på ikke at beskadige de underjordiske organer. Undgå også at trække planterne fra jorden for at forhindre afbrydelse af antenneorganerne fra de underjordiske. Grav forsigtigt rundt om luftstrukturer ved hjælp af en havearbejde murske, mens du udforsker de underjordiske organer som rødder, stilke, jordstængler og opbevaringsorganer uden at beskadige disse strukturer.Fjern jordpartikler for at bevare skrøbelige strukturer, og vask disse organer forsigtigt med ledningsvand for at skylle de resterende jordpartikler af, inden prøverne fastgøres. Mycoheterotrofe planter forbundet med bladkuld kræver ekstra opmærksomhed. Saml derfor omhyggeligt de sarte organer, der er forbundet med det nedbrydende materiale gennem deres hyfer uden at trække dem fra de forbundne strukturer.Bevar strukturer med sådanne forbindelser og saml kuldet til analyse. Til analyse af transmissionselektronmikroskopi skal du sektionere de 3 til 4 millimeter tykke prøver inde i en dråbe glutaraldehydnatriumcacodylatbuffer i mindre sektioner med en tykkelse på 1 til 2 millimeter. Kassér de afskårne kanter uden for dråben.Sørg for at udføre fikseringsprocessen på indsamlingsstedet umiddelbart efter indsamlingen af planter. Overfør straks sektionerne til et opsamlingsrør med et volumen fikseringsmiddel, der er mere end 10 gange større end prøvens volumen, da det er et additivfikseringsmiddel. Til overfladeanalyse af de overfladiske hyfer i organerne, især i underjordiske og dem, der er i kontakt med bladkuld.Overhold frisk eller fast materiale under dissekeringsmikroskopet ved en forstørrelse på 7,5x eller derover. Søg efter de interesseområder, der styres af de overfladiske hyfer og rhizomorphs. Vælg de prøver, der indeholder områder med overfladiske rhizomorphs, da disse kan opdeles for at visualisere pelotoner og hyferspoler i kortikale celler i rødder og stilke.Der fremstilles 0,2 milligram pr. milliliter hvedekimagglutininfluorokromkonjugat og 1% calcofluorhvide opløsninger i 0,1 molær fosfatbuffer som beskrevet i tekstmanuskriptet. Inkuber nu sektionerne på glasglas ved korrekt at dække dem med hvedekim agglutinin fluorokromkonjugatopløsning i 30 minutter. Efter inkubationen vaskes sektionerne med 0,1 molær fosfatbuffer og inkuberes dem i calcofluoropløsningen som et monteringsmedium.Placer derefter dækselglider på diasene og observer det under et konfokal- eller fluorescenslysmikroskop ved hjælp af de angivne filtre. Efter fastgørelse af prøverne, udførelse af dehydrering og opbevaring i 70% ethanol, skal du udsætte enhver ønsket overflade til scanning af elektronmikroskopianalyse ved hjælp af et skarpt og nyt barberblad til at skære med en envejsbevægelse. Brug om nødvendigt et stereomikroskop til at vælge prøverne og overveje metalstubbeområdet, mens du bestemmer prøvestørrelserne.Dehydrere endvidere prøverne i en ethanolisk serie. Opbevar små og delikate prøver i 30 minutter i hver koncentration og større og tættere prøver i 1 time. Fold derefter små konvolutter ved hjælp af silkepapir for at organisere prøver til de næste trin.Større prøver kan håndteres uden en konvolut. Mærk konvolutterne med en blyant og hold en log over prøverne. Placer forsigtigt prøverne inde i konvolutterne ved hjælp af en pensel.Opbevar nu disse prøver i absolut ethanol. Fortsæt straks med kritisk punkttørring ved at betjene en kritisk punkttørrer i henhold til standardprocedurer. Til dette formål anbringes prøverne i absolut ethanol i en prøveholder, og den placeres i den kritiske punkttørrers trykkammer.Den mellemliggende væske opløses i overgangsvæsken ved det kritiske kuldioxidpunkt og tørrer således prøverne. Da reabsorption af luftfugtighed kan ødelægge prøverne, opbevares de i en udtørringsbeholder umiddelbart efter kritisk punkttørring. Før du monterer prøverne på metalstubbe, skal du tage handskerne på for at manipulere stubbene.Dyp dem i acetone i 5 minutter for at fjerne fedt og lad dem tørre. Under et stereomikroskop fastgøres prøverne på stubben ved hjælp af et ledende dobbeltsidet kulstofklæbebånd og placeres dem. Webstedet ovenfra er det eneste mulige perspektiv i scanning af elektronmikroskopibilleder.For at manipulere prøverne skal du bruge finpunktpincet. Prøvedelen, der berøres af pincetten, er normalt beskadiget. Så vær forsigtig og prøv at røre ved dele, der er placeret væk fra interesseområderne.Vedligehold stubbene med prøver i en forseglet petriskål med silicagel. Fortsæt derefter med sputterbelægning for at deponere et lag guld eller platin på overfladen af prøverne i en lavtryksatmosfære af inert gas ved at følge standardprocedurerne. Belægningstykkelsen afhænger af prøvens topografi og er normalt mellem 15 og 40 nanometer.Til sidst skal du vedligeholde de belagte stubbe i en forseglet petriskål med silicagel, der bevarer fugtigheden. Prøverne kan opbevares på denne måde i flere uger. Brug et scanningselektronmikroskop til at analysere disse prøver.En elektronstråle rammer in vacuo-prøven under scanningselektronmikroskopi, og signalemissionen fra en sådan interaktion fortolkes som billeder. Sørg for, at de opløsninger og materialer, der anvendes til symbiotisk spiring af frø, er sterile. for at undgå forurening.Start med at autoklavere dem i 20 minutter ved 121 grader Celsius. I en laminær luftstrømshætte desinficeres overfladisk frugterne og frøene ved at nedsænke dem i en natriumhypochloritopløsning indeholdende 2% aktivt chlor. Slanke og skrøbelige frø kan nedsænkes i en 1:1 fortyndet natriumhypochloritopløsning.Efter desinfektion genoprettes frøene ved at filtrere dem ved hjælp af xerografisk stof. Vask frugterne og frøene tre gange i autoklaveret destilleret vand for at fjerne hypochloritopløsningen, inden du fortsætter med spiringstestene. Opbevar dem om nødvendigt i filterpapirkuverter inde i glaskolber med silicagel ved 4 grader Celsius og luk kolberne hermetisk og forsegl dem med klæbende film, og vurder derefter effektiviteten af vaskeprocessen ved at overføre nogle dråber vand fra den sidste vask til kartoffel dextrose agar.Til symbiotisk spiring af orkidéfrø inkuberes frøene over 1 til 2 centimeter autoklaverede filterpapirskiver anbragt i petriskåle indeholdende havregryn agarkulturmedium. Nu inokuleres midten af petriskålen med fragmentet af kulturmedium indeholdende mycelium fra den valgte isolerede svamp. Forsegl petriskålene med husholdningsfilm og inkuber dem i mørket ved omkring 25 grader Celsius eller stuetemperatur, afhængigt af svampevæksten.Forbered nogle retter med frø og uden svampepodning som en negativ kontrol til spiringstesten. Analyser spiringsresultaterne ugentligt ved at indsamle kvantitative og kvalitative data og fotografere protocormer og frøplanter. Rhizomorphs kan let genkendes normalt som mørke, shoestring-lignende strukturer.Frihånd eller andre metoder til at opnå sektioner tykkere end 10 mikrometer kan bedre udvise pelotoner og give mere repræsentative billeder af svampemønstre af kolonisering. Frihåndssektioner kan også være velegnede til hyphaeanalyse i højere forstærkning. Selvom detaljer opnås bedre i tyndere sektioner.De sekundære cellevægge i xylemelementer kan let identificeres ved den lyse farve, toluidin erhverver. I mellemtiden identificeres phloemelementer, der kun består af primære cellevægge, ved deres tyndere og mørkere cellevægge. Artefakter ved autofluorescens kan ses i glykolmethacrylatharpiks sektioner.Disse artefakter er normalt relateret til fluorokromkoncentration og kan undgås ved at vaske prøverne et større antal gange med bufferen. Frihåndssektionen af roden viser interne og eksterne hyfer. Det samme organ kan ses ved at scanne elektronmikroskopi med en overflod af rhizomorphs og individuelle hyfer på overfladen.De fleste orkidéarter spirer inden for nogle uger efter at være blevet inficeret af den podede svamp eller indtil næsten mere end en måned. Lys i scanningselektronmikroskopi kan anvendes på blomster, frugter og frø for at undersøge reproduktionsbiologien eller mycoheterotrofe planter. Symbiotisk spiring af frø kan også testes i autotrofiske orkideer.

Research

JoVE Journal

Biology

Obtaining Hemocytes from the Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes and Observing their Adherence to Symbiotic and Non-Symbiotic Bacteria

Obtaining Hemocytes from the Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes and Observing their Adherence to Symbiotic and Non-Symbiotic Bacteria

Studies concerning the role of the immune system in mediating molecular signaling between beneficial bacteria and their hosts have, in recent years, made ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Tandem Højtryks-Frysning og Quick Freeze Substitution af plantevævene for Transmission Electron Microscopy

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Måling rumlige og tidslige Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signaler i Arabidopsis Planter

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analyse af Autophagy i<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Ved hjælp Sult Pads i kombination med Fluorescence Microscopy

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protokoller for Problematisk Plant, ægsporesvampe, og Fungal Prøver

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

Light Sheet Fluorescens mikroskopi af planterødder Dyrkning på overfladen af ​​en gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Karakterisering af Forkalkning Events med Live Optiske og elektronmikroskopi teknikker i en Marine Tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

Enkel og effektiv Administration og visualisering af mikropartikler i kredsløbet af små fisk ved hjælp af nyre injektion

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

Micron-scale Phenotyping Techniques of Maize Vascular Bundles Based on X-ray Microcomputed Tomography

Micron-skala fænotyper teknikker af majs kardiovaskulære bundter baseret på X-ray Microcomputed tomografi

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a ...