Name: microscopy techniques for interpreting fungal colonization in mycoheterotrophic plants tissues and symbiotic germination of seeds
Uploaded: 2022-05-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds at JoVE.com

De auteurs bedanken de financiering van FAEPEX en FAPESP (2015/26479-6). MPP bedankt Capes voor zijn masterbeurs (proces 88887.600591/2021-00) en CNPq. JLSM bedankt CNPq voor productiviteitsbeurzen (303664/2020-7). De auteurs bedanken ook de toegang tot apparatuur en hulp van LME (Laboratory of Electron Microscopy - IB / Unicamp), INFABiC (National Institute of Science and Technology on Photonics Applied to Cell Biology - Unicamp) en LaBiVasc (Laboratory of Vascular Biology - DBEF / IB / Unicamp); LAMEB (UFSC) en Eliana de Medeiros Oliveira (UFSC) voor bijdragen aan cryoprotectieprotocol; LME voor bijdragen aan het TEM-protocol.

1. Verzamelen, bevestigen en onderhouden van monsters
OPMERKING: Volledig MH-planten zijn meestal te vinden in het donkere bos onder12,13, voornamelijk in vochtige en strooiselrijke gebieden, terwijl gedeeltelijk MH-planten te vinden zijn in meer open bossen12,13. MH-planten hebben meestal goed ontwikkelde ondergrondse organen in verschillende vormen en maten.</p...

<ol>
	<li>Evert, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Esau&#8217;s Plant Anatomy: Meristems, Cells, and Tissues of the Plant Body: Their Structure, Function, and Development. , (2006).</li><li>Yeung, E. C. T., Stasolla, C., Sumner, M. J., Huang, B. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plant Microtechniques and Protocols. , (2015).</li><li>Sokoloff, D. D., Jura-Morawiec, J., Zoric, L., Fay, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+anatomy:+at+the+heart+of+modern+botany.">Plant anatomy: at the heart of modern botany.</a> Botanical Journal of the Linnean Society. 195 (3), 249-253 (2021).</li><li>Leake, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+myco-heterotrophic+(&#8216;saprophytic&#8217;)+plants.">The biology of myco-heterotrophic (&#8216;saprophytic&#8217;) plants.</a> New Phytologist. 127 (2), 171-216 (1994).</li><li>Bidartondo, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolutionary+ecology+of+myco-heterotrophy.">The evolutionary ecology of myco-heterotrophy.</a> New Phytologist. 167 (2), 335-352 (2005).</li><li>Imhof, S., Massicotte, H. B., Melville, L. H., Peterson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subterranean+morphology+and+mycorrhizal+structures.">Subterranean morphology and mycorrhizal structures.</a> Mycoheterotrophy. , 157-214 (2013).</li><li>Rasmussen, H. N., Rasmussen, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchid+mycorrhiza:+implications+of+a+mycophagous+life+style.">Orchid mycorrhiza: implications of a mycophagous life style.</a> Oikos. 118 (3), 334-345 (2009).</li><li>Rasmussen, H. N., Dixon, K. W., Jers&#225;kov&#225;, J., T&#283;&#353;itelov&#225;, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+and+seedling+establishment+in+orchids:+a+complex+of+requirements.">Germination and seedling establishment in orchids: a complex of requirements.</a> Annals of Botany. 116 (3), 391-402 (2015).</li><li>Zettler, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terrestrial+orchid+conservation+by+symbiotic+seed+germination:+techniques+and+perspectives.">Terrestrial orchid conservation by symbiotic seed germination: techniques and perspectives.</a> Selbyana. 18 (2), 188-194 (1997).</li><li>Stewart, S. L., Kane, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symbiotic+seed+germination+and+evidence+for+in+vitro+mycobiont+specificity+in+Spiranthes+brevilabris+(Orchidaceae)+and+its+implications+for+species-level+conservation.">Symbiotic seed germination and evidence for in vitro mycobiont specificity in Spiranthes brevilabris (Orchidaceae) and its implications for species-level conservation.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Plant. 43 (3), 178-186 (2007).</li><li>Zhao, D. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchid+reintroduction+based+on+seed+germination-promoting+mycorrhizal+fungi+derived+from+protocorms+or+seedlings.">Orchid reintroduction based on seed germination-promoting mycorrhizal fungi derived from protocorms or seedlings.</a> Frontiers in Plant Science. 12, 701152 (2021).</li><li>Selosse, M. A., Roy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+plants+that+feed+on+fungi:+facts+and+questions+about+mixotrophy.">Green plants that feed on fungi: facts and questions about mixotrophy.</a> Trends in Plant Science. 14 (2), 64-70 (2009).</li><li>Merckx, V. S. F. T., Mennes, C. B., Peay, K. G., Geml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+diversification.">Evolution and diversification.</a> Mycoheterotrophy: The Biology of Plants Living on Fungi. , 215-244 (2013).</li><li>Boon, M. E., Drijver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routine+Cytological+Staining+Techniques:+Theoretical+Background+and+Practice.">Routine Cytological Staining Techniques: Theoretical Background and Practice.</a> Macmillan International Higher Education. , (1986).</li><li>Karnovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+formaldehyde-glutaraldehyde+fixative+of+high+osmolality+for+use+in+electron+microscopy.">A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 27 (2), 137-138 (1964).</li><li>Hayat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fixation for Electron Microscopy. , (1981).</li><li>Roland, J. C., Vian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+preparation+and+staining+of+thin+sections.">General preparation and staining of thin sections.</a> Electron Microscopy of Plant Cells. 1, 675 (1991).</li><li>Gerrits, P. O., Horobin, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycol+methacrylate+embedding+for+light+microscopy:+basic+principles+and+trouble-shooting.">Glycol methacrylate embedding for light microscopy: basic principles and trouble-shooting.</a> Journal of Histotechnology. 19 (4), 297-311 (1996).</li><li>Zhang, Z., Niu, L., Chen, X., Xu, X., Ru, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+plant+cryosection.">Improvement of plant cryosection.</a> Frontiers in Biology. 7 (4), 374-377 (2012).</li><li>Bene&#352;, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+media+improving+freeze-sectioning+of+plant+material.">On the media improving freeze-sectioning of plant material.</a> Biologia Plantarum. 15 (1), 50-56 (1973).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+slides+and+coverslips+for+microscopy.">Preparation of slides and coverslips for microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (5), (2008).</li><li>Sakai, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+method+for+differential+staining+of+paraffin+embedded+plant+material+using+toluidine+blue+O.">Simple method for differential staining of paraffin embedded plant material using toluidine blue O.</a> Stain Technology. 48 (5), 247-249 (1973).</li><li>O&#8217;Brien, T., Feder, N., McCully, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polychromatic+staining+of+plant+cell+walls+by+toluidine+blue+O.">Polychromatic staining of plant cell walls by toluidine blue O.</a> Protoplasma. 59 (2), 368-373 (1964).</li><li>Ventrella, M. C., Almeida, A. L., Nery, L. A., Coelho, V. P. d. e. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#233;todos+Histoqu&#237;micos+Aplicados+&#224;s+Sementes.">M&#233;todos Histoqu&#237;micos Aplicados &#224;s Sementes.</a> Universidade Federal de Vi&#231;osa. , (2013).</li><li>Pearse, A. G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histochemistry, Theoretical and Applied. , (1960).</li><li>Andrade-Linares, D. R., Franken, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+endophytes+in+plant+roots:+taxonomy,+colonization+patterns,+and+functions.">Fungal endophytes in plant roots: taxonomy, colonization patterns, and functions.</a> Symbiotic Endophytes. , 311-334 (2013).</li><li>Wymer, C. L., Beven, A. F., Boudonck, K., Lloyd, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy+of+plant+cells.">Confocal microscopy of plant cells.</a> Confocal Microscopy Methods and Protocols. , 103-130 (1999).</li><li>Marques, J. P. R., Soares, M. K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+de+T&#233;cnicas+Aplicadas+&#224;+Histopatologia+Vegetal.">Manual de T&#233;cnicas Aplicadas &#224; Histopatologia Vegetal.</a> FEALQ. , (2021).</li><li>Navarro, B. L., Marques, J. P. R., Appezzato-da-Gl&#243;ria, B., Sp&#243;sito, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histopathology+of+Phakopsora+euvitis+on+Vitis+vinifera.">Histopathology of Phakopsora euvitis on Vitis vinifera.</a> European Journal of Plant Pathology. 154 (4), 1185-1193 (2019).</li><li>Marques, J. P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugarcane+cell+wall-associated+defense+responses+to+infection+by+Sporisorium+scitamineum.">Sugarcane cell wall-associated defense responses to infection by Sporisorium scitamineum.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 698 (2018).</li><li>Jeffree, C. E., Read, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ambient-and+low-temperature+scanning+electron+microscopy.">Ambient-and low-temperature scanning electron microscopy.</a> Electron Microscopy of Plant Cells. , 313-413 (1991).</li><li>Bozzola, J. J., Russell, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Electron Microscopy: Principles and Techniques for Biologists. , (1999).</li><li>Murray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+transmission+and+scanning+electron+microscopy.">Basic transmission and scanning electron microscopy.</a> Introduction to electron Microscopy for Biologists. , 3-18 (2008).</li><li>. Glossary of TEM terms Available from: <a target="_blank" href="https://www.jeol.co.jp/en/words/emterms/">https://www.jeol.co.jp/en/words/emterms/</a> (2021)</li><li>Seaton, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchid+seed+and+pollen:+a+toolkit+for+long-term+storage,+viability+assessment+and+conservation.">Orchid seed and pollen: a toolkit for long-term storage, viability assessment and conservation.</a> Orchid Propagation: From Laboratories to Greenhouses&#8212;Methods and Protocols. , 71-98 (2018).</li><li>Otero, J. T., Ackerman, J. D., Bayman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+mycorrhizal+preferences+between+two+tropical+orchids.">Differences in mycorrhizal preferences between two tropical orchids.</a> Molecular Ecology. 13 (8), 2393-2404 (2004).</li><li>Koch, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marasmioid+rhizomorphs+in+bird+nests:+Species+diversity,+functional+specificity,+and+new+species+from+the+tropics.">Marasmioid rhizomorphs in bird nests: Species diversity, functional specificity, and new species from the tropics.</a> Mycologia. 112 (6), 1086-1103 (2020).</li><li>Webster, J., Weber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Introduction to Fungi. , (2007).</li><li>Sisti, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+non-mycorrhizal+fungi+in+germination+of+the+mycoheterotrophic+orchid+Pogoniopsis+schenckii+Cogn.">The role of non-mycorrhizal fungi in germination of the mycoheterotrophic orchid Pogoniopsis schenckii Cogn.</a> Frontiers in Plant Science. 10, 1589 (2019).</li><li>Martos, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+recruitment+of+saprotrophic+fungi+as+mycorrhizal+partners+by+tropical+achlorophyllous+orchids.">Independent recruitment of saprotrophic fungi as mycorrhizal partners by tropical achlorophyllous orchids.</a> New Phytologist. 184 (3), 668-681 (2009).</li><li>Alves, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+development+and+genetic+structure+of+the+mycoheterotrophic+orchid+Pogoniopsis+schenckii+Cogn.">Reproductive development and genetic structure of the mycoheterotrophic orchid Pogoniopsis schenckii Cogn.</a> BMC Plant Biology. 21 (1), 332 (2021).</li><li>Merckx, V. S. F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycoheterotrophy:+an+introduction.">Mycoheterotrophy: an introduction.</a> Mycoheterotrophy: The Biology of Plants Living on Fungi. , 1-17 (2013).</li><li>Hall, J. L., Hawes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Electron Microscopy of Plant Cells. , (1991).</li></ol>

Beeldanalyses in de anatomie en morfologie van planten hebben een belangrijk potentieel om doelstellingen te bereiken en helpen de relaties tussen mycoheterotrofe planten en hun onmisbare schimmel-endofyten te begrijpen, zoals aangetoond door studies van ondergrondse organen 6,40, structurele analyses van symbiotische kieming van zaden39 en lucht- en voortplantingsstructuren41 . Structurele plantkunde, ondanks het f...

Structureel onderzoek in de plantkunde, dat betrekking heeft op plantenmorfologie en anatomie, is fundamenteel voor het begrijpen van het hele organisme 1,2, en biedt onmisbare perspectieven om te integreren en bij te dragen aan kennis over de ecologie, fysiologie, ontwikkeling en evolutie van planten3. Methoden in plantenmorfologie en anatomie omvatten momenteel protocollen, apparatuur en kennis die onlangs en meer dan een eeuw geleden zijn ontwikkeld2. De continue uitvoering en aanpassing van klassieke methoden (bijv. Lichtmicroscopie) samen met meer recente technieken (bijv. Confocale microscopie, röntgenmicrotomografie) hebben dezelfde essentiële basis: theoretische kennis die de ontwikkeling van een methodologie mogelijk maakt.
Het belangrijkste hulpmiddel in de anatomie en morfologie van planten is het beeld. Ondanks de misvatting dat dergelijke analyses eenvoudige observaties zijn, ruimte geven aan subjectieve interpretaties2, vereist het analyseren en begrijpen van beelden op dit gebied kennis van de toegepaste methoden (de apparatuur, type analyse, methodologische procedures), celcomponenten, histochemie en het plantenlichaam (weefselorganisatie en -functie, ontogenie, morfologische aanpassingen). Het interpreteren van de beelden verkregen via een verscheidenheid aan methoden kan leiden tot het correleren van vorm en functie, het ontcijferen van de chemische samenstelling van een structuur, het bevestigen van taxa, het begrijpen van infecties door fytopathogenen en andere dergelijke beoordelingen.
Bij het onderzoeken van mycoheterotrofe (MH) planten (d.w.z. niet-fotosynthetische planten die koolstof verkrijgen uit mycorrhizaschimmels 4,5), kunnen opmerkelijke aspecten van hun structurele aanpassingen, de patronen van weefselkolonisatie door schimmels en de morfoanatomie van ondergrondse organen hun ontwikkelingsstrategieën en relaties met schimmeldraden, die de bron van voedingsstoffen zijn, verlichten. De ondergrondse organen van MH-planten vertonen meestal belangrijke aanpassingen in verband met hun associatie met bodemschimmels, daarom is het essentieel om deze anatomische en morfologische onderzoeken uit te voeren6. De luchtorganen van MH-soorten mogen niet worden genegeerd, omdat endofyten ook in deze weefsels aanwezig kunnen zijn, zelfs als het geen mycorrhizaschimmels zijn (persoonlijke waarnemingen, nog niet gepubliceerd).
Naast de gevestigde essentie van mycorrhizaschimmels associëring met MH-soorten gedurende hun hele levenscyclus7, heeft elke orchideeënsoort, zelfs de autotrofe, een initieel verplicht mycoheterotroof stadium in natuurlijke omgevingen. Het komt voor omdat het embryo van de orchideeën ongedifferentieerd is en geen endosperm of zaadlobben heeft, waardoor het niet in staat is zich te ontwikkelen en zich te vestigen in natuurlijke omgevingen zonder de voedingsondersteuning van schimmelpartners 4,8. Gezien het feit dat symbiotische kiemprotocollen niet alleen kunnen worden toegepast op MH-soorten, maar ook op fotosynthetiserende orchideeën, gericht op het onderzoeken van orchidee-schimmelspecificiteit in kieming en protocormontwikkeling, een enorm toegepaste methodologie in initiatieven voor het behoud van bedreigde soorten 9,10,11.
In deze methodeassemblage beschrijven we belangrijke stappen die betrokken zijn bij het verzamelen, fixeren en opslaan van MH-fabrieksmonsters voor anatomisch onderzoek (sectie 1), oppervlakteanalyse en monsterselectie (sectie 2), sectiemethoden (uit de vrije hand: sectie 3, microtomie: sectie 4, cryomicrotomie: sectie 5), kleuring en montage (sectie 6), fluorescentie en confocale microscopie van schimmel-endofyten (sectie 7), scanning-elektronenmicroscopie (sectie 8), en transmissie-elektronenmicroscopie (rubriek 9). Daarnaast beschrijven we een symbiotische kiemingsmethode voor orchideeënzaden (MH en autotroof, sectie 10), omdat de eerder genoemde beeldvormingsmethoden met succes kunnen worden toegepast om schimmelkolonisatie van zaden, protocormen en zaailingen in het kiemproces te analyseren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63777/63777fig01.jpg"> Figuur 1: Schematische samenvatting van beeldvormingsmethoden. De schema's geven indicaties van protocolstappen waarin ze worden beschreven. Afkortingen: GMA = glycolmethacrylaat, OCT = optimale snijtemperatuurverbinding, SEM = scanningelektronenmicroscopie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63777/63777fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
De hier in detail beschreven microscopietechnieken (figuur 1) worden voorafgegaan door de volgende essentiële stappen: verzamelen, fixeren, dehydrateren, insluiten en doorsnijden van monsters. Aangezien de stappen variabel zijn (figuur 1), afhankelijk van de gekozen techniek(en), is het belangrijk om vooruit te denken, rekening houdend met de fixeermiddelen die moeten worden voorbereid en naar de verzamelplaats moeten worden vervoerd, hoe de monsters moeten worden voorbereid voordat ze worden gefixeerd, de te gebruiken dehydratatieprocessen (sectie 1) en verschillende inbeddingsmogelijkheden en sectiemethoden (secties 4, 5, en 9). Figuur 1 geeft een overzicht van alle stappen die nodig zijn voor elke microscopietechniek die hieronder grondig wordt beschreven.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179124</td>
			<td>(for SEM stubs mounting)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar-agar (AA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1296</td>
			<td>(for seeds germination tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcofluor White Stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18909</td>
			<td>fluorescent dye (detects cellulose)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate Buffer Solution, 0.09M pH 4.8</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2488</td>
			<td>(for toluidine blue O staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive Double-Sided Carbon Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-285-81</td>
			<td>(for SEM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper Grids</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4776</td>
			<td>(for TEM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical-point dryer</td>
			<td>Balzers</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>(= stereomicroscope, any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Entellan</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>107960</td>
			<td>rapid mounting medium for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol, pure (&#8805;99.5%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>459836</td>
			<td>(= ethanol, for dehydration processes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution, 37%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252549</td>
			<td>(for NBF solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td>histological tissue fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin capsules for TEM</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-248-71</td>
			<td>(for resin polymerisation in TEM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin solution, 2% in H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1393</td>
			<td>(dilute for slides preparation - OCT adherence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution, 25%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6257</td>
			<td>(for Karnovsky&#8217;s solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoResin</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>14702231731</td>
			<td>glycol methacrylate (GMA) embedding kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>207772</td>
			<td>(for Lugol solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead(II) nitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>228621</td>
			<td>Pb(NO3)2 (for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR White acrylic resin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9774</td>
			<td>hydrophilic acrylic resin for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lugol solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>62650</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal stubs for specimen mounts</td>
			<td>Rave Scientific</td>
			<td></td>
			<td>(for SEM, different models)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>manual rotary microtome or other model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oatmeal agar (OMA)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>O3506</td>
			<td>(for seeds germination tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Compound, Tissue-Tek</td>
			<td>Sakura Finetek USA</td>
			<td>4583</td>
			<td>embedding medium for frozen tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201030</td>
			<td>OsO4 (for TEM postfixation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793</td>
			<td>sealing thermoplastic film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td>(for Karnovsky&#8217;s solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine solution, 0.1% in H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td>(for slides preparation - OCT adherence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep Slides</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0425</td>
			<td>poly-L-lysine coated glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Molding Cup Trays</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>17177A-3</td>
			<td>(6x8x5 mm, for embbeding samples in GMA resin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Molding Cup Trays</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>17177C-3</td>
			<td>(13x19x5 mm, for embbeding samples in GMA resin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221945</td>
			<td>(for Lugol solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato Dextrose Agar (PDA)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>70139</td>
			<td>(for seeds germination tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscope</td>
			<td>Jeol</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silane [(3-Aminopropyl)triethoxysilane]</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3648</td>
			<td>(for slides preparation - OCT adherence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silane-Prep Slides</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4651</td>
			<td>glass slides coated with silane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel orange, granular</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>10087</td>
			<td>(for dessicating processes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0250</td>
			<td>(for glutaraldehyde-sodium cacodylate buffer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881</td>
			<td>NaOH (for Karnovsky&#8217;s solution preparation and TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>425044</td>
			<td>NaClO (for seeds surface disinfection)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic, anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71640</td>
			<td>Na2HPO4 (for NBF solution and PB preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td>NaH2PO4&#183;H2O (for NBF and PB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sputter coater</td>
			<td>Balzers</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td>C12H22O11 (for cryoprotection and germination test)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan III</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4131</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan IV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>198102</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan Black B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>199664</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(3 mL, any brand, for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter Unit, Millex-GV 0.22 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033R</td>
			<td>PVDF, 33 mm, gamma sterilized (for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tek Bond Super Glue 793</td>
			<td>Tek Bond Saint-Gobain</td>
			<td>78072720018</td>
			<td>liquid cyanoacrylate adhesive, medium viscosity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3260</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Jeol</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triphenyltetrazolium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8877</td>
			<td>(for the tetrazolium test in seeds germination)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1804</td>
			<td>Na3(C6H5O7)&#183;2H2O (for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-607-645</td>
			<td>UO2(CH3COO)2 (for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td>TermoFisher Scientific</td>
			<td>W11261</td>
			<td>fluorescent dye-conjugated lectin (detects sialic acid and N-acetylglucosaminyl residues)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microscopy techniques for interpreting fungal colonization in mycoheterotrophic plants tissues and symbiotic germination of seeds

Structurele plantkunde is een onmisbaar perspectief om de ecologie, fysiologie, ontwikkeling en evolutie van planten volledig te begrijpen. Bij het onderzoeken van mycoheterotrofe planten (d.w.z. planten die koolstof uit schimmels verkrijgen), kunnen opmerkelijke aspecten van hun structurele aanpassingen, de patronen van weefselkolonisatie door schimmels en de morfoanatomie van ondergrondse organen hun ontwikkelingsstrategieën en hun relaties met schimmeldraden, de bron van voedingsstoffen, verlichten. Een andere belangrijke rol van symbiotische schimmels is gerelateerd aan de kieming van orchideeënzaden; alle Orchidaceae-soorten zijn mycoheterotroof tijdens ontkieming en zaailingstadium (initiële mycoheterotrofie), zelfs degenen die fotosynthetiseren in volwassen stadia. Vanwege het gebrek aan voedingsreserves in orchideeënzaden zijn schimmelsymbionten essentieel om substraten te bieden en ontkieming mogelijk te maken. Het analyseren van kiemfasen door structurele perspectieven kan ook belangrijke vragen beantwoorden met betrekking tot de interactie van schimmels met de zaden. Verschillende beeldvormingstechnieken kunnen worden toegepast om fungi-endofyten in plantenweefsels te onthullen, zoals in dit artikel wordt voorgesteld. Vrije hand en dunne delen van plantenorganen kunnen worden gekleurd en vervolgens worden waargenomen met behulp van lichtmicroscopie. Een fluorochroom geconjugeerd aan tarwekiem agglutinine kan worden toegepast op de schimmels en co-geïncubeerd met Calcofluor White om de celwanden van planten te benadrukken in confocale microscopie. Bovendien zijn de methodologieën van scanning- en transmissie-elektronenmicroscopie gedetailleerd voor mycoheterotrofe orchideeën en worden de mogelijkheden onderzocht om dergelijke protocollen toe te passen in verwante planten. Symbiotische kieming van orchideeënzaden (d.w.z. in aanwezigheid van mycorrhizaschimmels) wordt in het protocol in detail beschreven, samen met mogelijkheden om de structuren verkregen uit verschillende stadia van ontkieming voor te bereiden voor analyses met licht-, confocale en elektronenmicroscopie.

Het volgen van de essentiële stadia van het fixeren van plantenweefsel levert cellulaire structuren op die zo veel mogelijk lijken op de levende toestand, rekening houdend met de morfologie, het volume en de ruimtelijke organisatie van cellulaire componenten en weefsels16. Observeer dergelijke eigenschappen in de monsters na chemische fixatie (figuur 4). Figuur 4C-F vertegenwoordigt voldoende vaste monst...

Watch this Scientific Journal Video about Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds at JoVE.com

Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds

Dit protocol is bedoeld om gedetailleerde procedures te bieden voor het verzamelen, fixeren en onderhouden van mycoheterotrofe plantenmonsters, waarbij verschillende microscopietechnieken worden toegepast, zoals scanning- en transmissie-elektronenmicroscopie, licht-, confocale en fluorescentiemicroscopie om schimmelkolonisatie te bestuderen in plantenweefsels en zaden ontkiemd met mycorrhizaschimmels.

Microscopietechnieken voor het interpreteren van schimmelkolonisatie in mycoheterotrofe plantenweefsels en symbiotische kieming van zaden

Structural botany is an indispensable perspective to fully understand the ecology, physiology, development, and evolution of plants. When researching ...

Het protocol presenteert verschillende microscopietechnieken die worden toegepast om de schimmelkolonisatie in mycoheterotrofe planten te begrijpen, van het verzamelen tot het voorbereiden van monsters in detail en omvatten essentiële stappen. Dergelijke technieken kunnen worden toegepast op verschillende mycoheterotrofe planten en zelfs op andere materialen van een plant dan mycoheterotrofen. Deze methode is voornamelijk gerelateerd aan structurele plantkunde en zou ook inzicht kunnen geven in mycorrhiza-interacties, fysiologie, reproductieve biologie, evolutie en ecologie van mycoheterotrofe planten.Verzamel om te beginnen de mycoheterotrofe planten door de grond rond de plantenbasis te verkennen en ervoor te zorgen dat de ondergrondse organen niet worden beschadigd. Vermijd ook om de planten van de grond te trekken om te voorkomen dat de luchtorganen worden losgekoppeld van de ondergrondse organen. Graaf zorgvuldig rond luchtstructuren met behulp van een tuintroffel terwijl u de ondergrondse organen zoals wortels, stengels, wortelstokken en opslagorganen verkent zonder deze structuren te beschadigen.Verwijder bodemdeeltjes om fragiele structuren te behouden en was deze organen voorzichtig met kraanwater om de resterende bodemdeeltjes af te spoelen voordat de monsters worden bevestigd. Mycoheterotrofe planten geassocieerd met bladafval vragen extra aandacht. Verzamel daarom zorgvuldig de delicate organen die verbonden zijn met het ontbindende materiaal via hun schimmeldraden zonder ze uit de verbonden structuren te trekken.Behoud structuren met dergelijke verbindingen en verzamel het strooisel voor analyse. Voor transmissie-elektronenmicroscopieanalyse snijdt u de 3 tot 4 millimeter dikke monsters in een druppel glutaaraldehydenatrocodylaatbuffer in kleinere secties van 1 tot 2 millimeter dikte. Gooi de snijranden buiten de druppel weg.Zorg ervoor dat het fixatieproces onmiddellijk na het verzamelen van planten op de verzamelplaats wordt uitgevoerd. Breng de secties onmiddellijk over naar een verzamelbuis met een volume fixatief dat meer dan 10 keer groter is dan het volume van de monsters, omdat het een additief fixatief is. Voor oppervlakteanalyse van de oppervlakkige schimmeldraden in de organen, vooral in ondergrondse en die in contact met bladafval.Observeer vers of vast materiaal onder de ontleedmicroscoop bij een vergroting van 7,5x of hoger. Zoek naar de interessegebieden geleid door de oppervlakkige schimmeldraden en de rhizomorfen. Selecteer de monsters die gebieden van oppervlakkige rhizomorfen bevatten, omdat deze kunnen worden doorsneden om pelotonen en schimmeldradenspoelen in corticale cellen in wortels en stengels te visualiseren.Bereid 0,2 milligram per milliliter tarwekiem agglutinine fluorochroomconjugaat en 1% calcofluor witte oplossingen in 0,1 molaire fosfaatbuffer zoals beschreven in het tekstmanuscript. Incubeer nu de secties op glazen dia's door ze gedurende 30 minuten goed te bedekken met tarwekiem agglutinine fluorochroom geconjugeerde oplossing. Was na de incubatie de secties met 0,1 molaire fosfaatbuffer en incubeer ze in de calcofluoroplossing als een montagemedium.Plaats vervolgens de afdekglijders op de dia's en observeer deze onder een confocale of fluorescentielichtmicroscoop met behulp van de aangegeven filters. Na het bevestigen van de monsters, het uitvoeren van uitdroging en het opslaan in 70% ethanol, stelt u elk gewenst oppervlak bloot voor scanning elektronenmicroscopieanalyse door een scherp en nieuw scheermesje te gebruiken om sneden te maken met een eenrichtingsbeweging. Gebruik indien nodig een stereomicroscoop om de monsters te selecteren en rekening te houden met het gebied met metalen stompen bij het bepalen van de steekproefgroottes.Droog verder de monsters uit in een ethanolische reeks. Houd kleine en delicate monsters gedurende 30 minuten in elke concentratie en grotere en dichtere monsters gedurende 1 uur. Vouw vervolgens kleine enveloppen met tissuepapier om monsters te ordenen voor de volgende stappen.Grotere monsters kunnen zonder envelop worden behandeld. Label de enveloppen met een potlood en houd een logboek bij van de monsters. Plaats de monsters voorzichtig in de enveloppen met behulp van een penseel.Bewaar deze monsters nu in absolute ethanol. Ga onmiddellijk over tot het drogen van kritieke punten door een kritische puntdroger te gebruiken volgens de standaard bedrijfsprocedures. Plaats hiervoor de monsters in absolute ethanol in een monsterhouder en plaats deze in de drukkamer van de kritische puntdroger.De tussenvloeistof lost op in de overgangsvloeistof op het kritieke koolstofdioxidepunt, waardoor de monsters drogen. Omdat reabsorptie van de luchtvochtigheid de monsters kan vernietigen, bewaart u ze onmiddellijk na het drogen van het kritieke punt in een droogmiddel. Voordat u de monsters op metalen stronken monteert, trekt u de handschoenen aan om de stompen te manipuleren.Dompel ze 5 minuten onder in aceton om vet te verwijderen en laat ze drogen. Bevestig de monsters onder een stereomicroscoop op de stomp met behulp van een geleidende dubbelzijdige koolstofklevende tape en plaats ze. De site van bovenaf is het enige mogelijke perspectief in scanning elektronenmicroscopie beelden.Om de monsters te manipuleren, gebruikt u een fijnpunt pincet. Het monsterdeel dat door het pincet wordt aangeraakt, is meestal beschadigd. Wees dus voorzichtig en probeer onderdelen aan te raken die uit de buurt van de interessegebieden zijn geplaatst.Onderhoud de stompen met monsters in een afgesloten petrischaal met silicagel. Ga vervolgens verder met sputtercoating om een laag goud of platina op het oppervlak van de monsters af te zetten in een lagedrukatmosfeer van inert gas door de standaard operationele procedures te volgen. De laagdikte is afhankelijk van de topografie van het monster en ligt meestal tussen de 15 en 40 nanometer.Tot slot, onderhoud de gecoate stompen in een afgesloten petrischaal met silicagel die vocht vasthoudt. De monsters kunnen op deze manier wekenlang worden bewaard. Gebruik een scanning elektronenmicroscoop om deze monsters te analyseren.Een elektronenbundel raakt het in vacuo-monster tijdens scanning-elektronenmicroscopie en de signaalemissie van een dergelijke interactie wordt geïnterpreteerd als afbeeldingen. Zorg ervoor dat de oplossingen en materialen die worden gebruikt bij de symbiotische kieming van zaden steriel zijn. om besmetting te voorkomen.Begin met ze 20 minuten te autoclaveren bij 121 graden Celsius. Desinfecteer in een laminaire luchtstroomkap oppervlakkig de vruchten en zaden door ze onder te dompelen in een natriumhypochlorietoplossing die 2% actief chloor bevat. Slanke en fragiele zaden kunnen worden ondergedompeld in een 1:1 verdunde natriumhypochlorietoplossing.Herstel na desinfectie de zaden door ze te filteren met xerografische stof. Was de vruchten en zaden driemaal in gedestilleerd geautoclaveerd water om de hypochlorietoplossing te verwijderen voordat u doorgaat met de kiemingstests. Bewaar ze indien nodig in filterpapieren enveloppen in glazen kolven met silicagel bij 4 graden Celsius en sluit de kolven hermetisch af en sluit ze af met vershoudfolie, en evalueer vervolgens de effectiviteit van het wasproces door enkele druppels water van de laatste was over te brengen naar aardappel dextrose agar.Voor symbiotische ontkieming van orchideeënzaden, incubeer de zaden over 1 tot 2 centimeter geautoclaveerde filterpapierschijven die in petrischalen met havermout-agarcultuurmedium zijn geplaatst. Ent nu het midden van de petrischaal met het fragment van het kweekmedium dat mycelium bevat van de gekozen geïsoleerde schimmel. Sluit de petrischalen af met vershoudfolie en incubeer ze in het donker bij ongeveer 25 graden Celsius of kamertemperatuur, afhankelijk van de schimmelgroei.Bereid sommige gerechten met zaden en zonder schimmelinenting als een negatieve controle voor de kiemtest. Analyseer de kiemresultaten wekelijks door kwantitatieve en kwalitatieve gegevens te verzamelen en protocormen en zaailingen te fotograferen. De rhizomorfen zijn gemakkelijk te herkennen, meestal als donkere, schoenachtige structuren.Uit de vrije hand of andere methoden om secties dikker dan 10 micrometer te verkrijgen, kunnen pelotons beter uitbeelden en meer representatieve beelden van schimmelpatronen van kolonisatie bieden. Secties uit de vrije hand kunnen ook geschikt zijn voor schimmeldradenanalyse bij hogere versterking. Hoewel, details worden beter bereikt in dunnere secties.De secundaire celwanden in xyleemelementen kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd door de lichte kleur die toluidine verwerft. Ondertussen worden floëemelementen die alleen uit primaire celwanden bestaan, geïdentificeerd door hun dunnere en donkerdere celwanden. Artefacten door autofluorescentie zijn te zien in glycolmethacrylaatharssecties.Deze artefacten zijn meestal gerelateerd aan fluorochrome concentratie en kunnen worden vermeden door de monsters een groter aantal keren te wassen met de buffer. Het gedeelte uit de vrije hand van de wortel toont interne en externe schimmeldraden. Hetzelfde orgaan kan worden gezien door scanning elektronenmicroscopie met een overvloed aan rhizomorfen en individuele schimmeldraden op het oppervlak.De meeste orchideeënsoorten ontkiemen binnen enkele weken na besmetting door de geënte schimmel of tot bijna meer dan een maand. Licht in scanning elektronenmicroscopie kan worden toegepast op bloemen, fruit en zaden om de reproductieve biologie of mycoheterotrofe planten te onderzoeken. Symbiotische kieming van zaden kan ook worden getest in autotrofe orchideeën.

Research

JoVE Journal

Biology

Obtaining Hemocytes from the Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes and Observing their Adherence to Symbiotic and Non-Symbiotic Bacteria

Obtaining Hemocytes from the Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes and Observing their Adherence to Symbiotic and Non-Symbiotic Bacteria

Het verkrijgen van Hemocytes van de Hawaiiaanse Bobtail Squid Euprymna scolopes En observatie van de Naleving van Symbiotische en niet-symbiotische bacteriën

Studies concerning the role of the immune system in mediating molecular signaling between beneficial bacteria and their hosts have, in recent years, made ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp en perfusie technieken voor het bestuderen van Ion Channels Uitgedrukt in Xenopus Eicellen

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Tandem Hogedruk Invriezen en Quick Freeze Vervanging van plantaardige weefsels voor Transmission Electron Microscopy

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Meten Ruimtelijke en temporele Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Signalen in Arabidopsis Planten

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analyse van autofagie in<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Door gebruikmaken van uithongering pads in combinatie met fluorescentiemicroscopie

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocollen voor Problematisch Plant, oömyceet en Fungal Samples

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

Lichtwaaier fluorescentiemicroscopie van plantenwortels Kweken op het oppervlak van een gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Karakterisering van calcificatie Events met Live optische en elektronenmicroscopie technieken in een Marine tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

Eenvoudig en effectief beheer en visualisatie van deeltjes in de bloedsomloop van kleine vissen met behulp van nier injectie

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

Micron-scale Phenotyping Techniques of Maize Vascular Bundles Based on X-ray Microcomputed Tomography

Micron-schaal fenotypering technieken van maïs vaatbundels gebaseerd op de X-ray Microcomputed tomografie

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a ...