Name: microscopy techniques for interpreting fungal colonization in mycoheterotrophic plants tissues and symbiotic germination of seeds
Uploaded: 2022-05-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds at JoVE.com

Die Autoren danken der Finanzierung durch FAEPEX und FAPESP (2015/26479-6). MPP dankt Capes für sein Masterstipendium (Prozess 88887.600591/2021-00) und CNPq. JLSM dankt CNPq für Produktivitätszuschüsse (303664/2020-7). Die Autoren danken auch dem Zugang zu Ausrüstung und Unterstützung durch LME (Laboratory of Electron Microscopy - IB / Unicamp), INFABiC (National Institute of Science and Technology on Photonics Applied to Cell Biology - Unicamp) und LaBiVasc (Laboratory of Vascular Biology - DBEF / IB / Unicamp); LAMEB (UFSC) und Eliana de Medeiros Oliveira (UFSC) für Beiträge zum Kryoprotektionsprotokoll; LME für Beiträge zum TEM-Protokoll.

1. Sammeln, Reparieren und Pflegen von Mustern
ANMERKUNG: Voll-MH-Pflanzen können normalerweise im dunklen Waldunterholz 12,13 gefunden werden, hauptsächlich in feuchten und streureichen Gebieten, während MH-Pflanzen teilweise in offeneren Wäldern 12,13 gefunden werden können. MH-Pflanzen haben in der Regel gut entwickelte unterirdische Organe in einer Vielz...

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Bildanalysen in der Pflanzenanatomie und -morphologie haben ein wichtiges Potenzial, Ziele zu erreichen und zum Verständnis der Beziehungen zwischen mykoheterotrophen Pflanzen und ihren unverzichtbaren Pilzendophyten beizutragen, wie Untersuchungen unterirdischer Organe6,40, Strukturanalysen der symbiotischen Keimung von Samen39 sowie Luft- und Fortpflanzungsstrukturen 41 zeigen. . Obwohl die strukturelle Botanik i...

Strukturforschung in der Botanik, die Pflanzenmorphologie und Anatomie abdeckt, ist grundlegend für das Verständnis des gesamten Organismus1,2 und bietet unverzichtbare Perspektiven, um Wissen über die Ökologie, Physiologie, Entwicklung und Evolution von Pflanzen zu integrieren und dazu beizutragen3. Methoden in der Pflanzenmorphologie und Anatomie umfassen derzeit Protokolle, Geräte und Kenntnisse, die in jüngster Zeit sowie vor mehr als einem Jahrhundert entwickelt wurden2. Die kontinuierliche Durchführung und Anpassung klassischer Methoden (z.B. Lichtmikroskopie) sowie neuerer Techniken (z.B. konfokale Mikroskopie, Röntgenmikrotomographie) haben die gleiche wesentliche Grundlage: theoretisches Wissen, das die Entwicklung einer Methodik ermöglicht.
Das Hauptwerkzeug in der Pflanzenanatomie und -morphologie ist das Bild. Trotz des Missverständnisses, dass es sich bei solchen Analysen um einfache Beobachtungen handelt, die subjektiven Interpretationen Raum geben2, erfordert die Analyse und das Verständnis von Bildern in diesem Bereich Kenntnisse der angewandten Methoden (Ausrüstung, Art der Analyse, methodische Verfahren), der Zellbestandteile, der Histochemie und des Pflanzenkörpers (Gewebeorganisation und -funktion, Ontogenese, morphologische Anpassungen). Die Interpretation der mit einer Vielzahl von Methoden erhaltenen Bilder kann dazu führen, Form und Funktion zu korrelieren, die chemische Zusammensetzung einer Struktur zu entschlüsseln, die Beschreibung von Taxa zu bestätigen, Infektionen durch Phytopathogene zu verstehen und andere solche Bewertungen.
Bei der Erforschung mykoheterotropher (MH) Pflanzen (d.h. nicht-photosynthetischer Pflanzen, die Kohlenstoff aus Mykorrhizapilzen gewinnen4,5), können bemerkenswerte Aspekte ihrer strukturellen Anpassungen, die Muster der Gewebebesiedlung durch Pilze und die Morphoanatomie unterirdischer Organe ihre Entwicklungsstrategien und Beziehungen zu Hyphen, die die Quelle von Nährstoffen sind, aufklären. Die unterirdischen Organe von MH-Pflanzen zeigen in der Regel wichtige Anpassungen im Zusammenhang mit ihrer Assoziation mit Bodenpilzen, daher ist es wichtig, diese anatomischen und morphologischen Untersuchungen durchzuführen6. Die Luftorgane von MH-Arten sollten nicht ignoriert werden, da in diesen Geweben auch Endophyten vorhanden sein können, auch wenn es sich nicht um Mykorrhizapilze handelt (persönliche Beobachtungen, noch nicht veröffentlicht).
Neben der gut etablierten Wesentlichkeit der Assoziation von Mykorrhizapilzen mit MH-Arten während ihres gesamten Lebenszyklus7 hat jede Orchideenart, auch die autotrophen, ein initiales obligates mykoheterotrophes Stadium in natürlichen Umgebungen. Es tritt auf, weil der Embryo der Orchideen undifferenziert ist und kein Endosperm oder Keimblätter aufweist, so dass er ohne die Ernährungsunterstützung von Pilzpartnern nicht in der Lage ist, sich in natürlichen Umgebungen zu entwickeln und zu etablieren 4,8. In Anbetracht dessen können symbiotische Keimungsprotokolle nicht nur auf MH-Arten, sondern auch auf photosynthetisierende Orchideen angewendet werden, um die Spezifität von Orchideen und Pilzen bei der Keimung und Protocormentwicklung zu untersuchen, eine weitgehend angewandte Methodik in Initiativen zur Erhaltung bedrohter Arten 9,10,11.
In dieser Methodenmontage beschreiben wir wichtige Schritte zur Entnahme, Fixierung und Lagerung von MH-Pflanzenproben für anatomische Studien (Abschnitt 1), Oberflächenanalyse und Probenauswahl (Abschnitt 2), Schnittmethoden (Freihand: Abschnitt 3, Mikrotomie: Abschnitt 4, Kryomikrotomie: Abschnitt 5), Färbung und Montage (Abschnitt 6), Fluoreszenz- und Konfokalmikroskopie von Pilzendophyten (Abschnitt 7), Rasterelektronenmikroskopie (Abschnitt 8), und Transmissionselektronenmikroskopie (Abschnitt 9). Darüber hinaus beschreiben wir eine symbiotische Keimungsmethode für Orchideensamen (MH und autotroph, Abschnitt 10), da die zuvor genannten bildgebenden Verfahren erfolgreich angewendet werden können, um die Pilzbesiedlung von Samen, Protocormen und Keimlingen im Keimprozess zu analysieren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63777/63777fig01.jpg"> Abbildung 1: Schematische Zusammenfassung bildgebender Verfahren. Die Schaltpläne geben Hinweise auf Protokollschritte, in denen sie detailliert sind. Abkürzungen: GMA = Glykolmethacrylat, OCT = optimale Schnitttemperaturverbindung, REM = Rasterelektronenmikroskopie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63777/63777fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Den hier im Detail beschriebenen Mikroskopietechniken (Abbildung 1) gehen folgende wesentliche Schritte voraus: Sammeln, Fixieren, Dehydrieren, Einbetten und Schneiden von Proben. Da die Schritte je nach gewählter Technik(en) unterschiedlich sind (Abbildung 1), ist es wichtig, vorausschauend zu denken und zu berücksichtigen, welche Fixiermittel vorbereitet und zur Sammelstelle transportiert werden sollen, wie die Proben vor der Fixierung vorbereitet werden müssen, welche Dehydratisierungsverfahren anzuwenden sind (Abschnitt 1) und welche Möglichkeiten und Schnittmethoden es gibt (Abschnitte 4, 5, und 9). Abbildung 1 fasst nacheinander alle Schritte zusammen, die für jede unten beschriebene Mikroskopietechnik erforderlich sind.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179124</td>
			<td>(for SEM stubs mounting)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar-agar (AA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1296</td>
			<td>(for seeds germination tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcofluor White Stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18909</td>
			<td>fluorescent dye (detects cellulose)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate Buffer Solution, 0.09M pH 4.8</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2488</td>
			<td>(for toluidine blue O staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive Double-Sided Carbon Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-285-81</td>
			<td>(for SEM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper Grids</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4776</td>
			<td>(for TEM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical-point dryer</td>
			<td>Balzers</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>(= stereomicroscope, any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Entellan</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>107960</td>
			<td>rapid mounting medium for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol, pure (&#8805;99.5%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>459836</td>
			<td>(= ethanol, for dehydration processes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution, 37%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252549</td>
			<td>(for NBF solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td>histological tissue fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin capsules for TEM</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-248-71</td>
			<td>(for resin polymerisation in TEM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin solution, 2% in H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1393</td>
			<td>(dilute for slides preparation - OCT adherence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution, 25%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6257</td>
			<td>(for Karnovsky&#8217;s solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoResin</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>14702231731</td>
			<td>glycol methacrylate (GMA) embedding kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>207772</td>
			<td>(for Lugol solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead(II) nitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>228621</td>
			<td>Pb(NO3)2 (for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR White acrylic resin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9774</td>
			<td>hydrophilic acrylic resin for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lugol solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>62650</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal stubs for specimen mounts</td>
			<td>Rave Scientific</td>
			<td></td>
			<td>(for SEM, different models)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>manual rotary microtome or other model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oatmeal agar (OMA)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>O3506</td>
			<td>(for seeds germination tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Compound, Tissue-Tek</td>
			<td>Sakura Finetek USA</td>
			<td>4583</td>
			<td>embedding medium for frozen tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201030</td>
			<td>OsO4 (for TEM postfixation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793</td>
			<td>sealing thermoplastic film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td>(for Karnovsky&#8217;s solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine solution, 0.1% in H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td>(for slides preparation - OCT adherence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep Slides</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0425</td>
			<td>poly-L-lysine coated glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Molding Cup Trays</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>17177A-3</td>
			<td>(6x8x5 mm, for embbeding samples in GMA resin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Molding Cup Trays</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>17177C-3</td>
			<td>(13x19x5 mm, for embbeding samples in GMA resin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221945</td>
			<td>(for Lugol solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato Dextrose Agar (PDA)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>70139</td>
			<td>(for seeds germination tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscope</td>
			<td>Jeol</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silane [(3-Aminopropyl)triethoxysilane]</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3648</td>
			<td>(for slides preparation - OCT adherence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silane-Prep Slides</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4651</td>
			<td>glass slides coated with silane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel orange, granular</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>10087</td>
			<td>(for dessicating processes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0250</td>
			<td>(for glutaraldehyde-sodium cacodylate buffer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881</td>
			<td>NaOH (for Karnovsky&#8217;s solution preparation and TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>425044</td>
			<td>NaClO (for seeds surface disinfection)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic, anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71640</td>
			<td>Na2HPO4 (for NBF solution and PB preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td>NaH2PO4&#183;H2O (for NBF and PB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sputter coater</td>
			<td>Balzers</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td>C12H22O11 (for cryoprotection and germination test)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan III</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4131</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan IV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>198102</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan Black B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>199664</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(3 mL, any brand, for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter Unit, Millex-GV 0.22 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033R</td>
			<td>PVDF, 33 mm, gamma sterilized (for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tek Bond Super Glue 793</td>
			<td>Tek Bond Saint-Gobain</td>
			<td>78072720018</td>
			<td>liquid cyanoacrylate adhesive, medium viscosity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3260</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Jeol</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triphenyltetrazolium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8877</td>
			<td>(for the tetrazolium test in seeds germination)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1804</td>
			<td>Na3(C6H5O7)&#183;2H2O (for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-607-645</td>
			<td>UO2(CH3COO)2 (for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td>TermoFisher Scientific</td>
			<td>W11261</td>
			<td>fluorescent dye-conjugated lectin (detects sialic acid and N-acetylglucosaminyl residues)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microscopy techniques for interpreting fungal colonization in mycoheterotrophic plants tissues and symbiotic germination of seeds

Strukturelle Botanik ist eine unverzichtbare Perspektive, um die Ökologie, Physiologie, Entwicklung und Evolution von Pflanzen vollständig zu verstehen. Bei der Erforschung mykoheterotropher Pflanzen (d.h. Pflanzen, die Kohlenstoff aus Pilzen gewinnen) können bemerkenswerte Aspekte ihrer strukturellen Anpassungen, die Muster der Gewebebesiedlung durch Pilze und die Morphoanatomie unterirdischer Organe ihre Entwicklungsstrategien und ihre Beziehungen zu Hyphen, der Quelle von Nährstoffen, aufklären. Eine weitere wichtige Rolle symbiotischer Pilze hängt mit der Keimung von Orchideensamen zusammen; Alle Orchidaceae-Arten sind während der Keimung und des Keimlingsstadiums (anfängliche Mykoheterotrophie) mykoheterotroph, auch diejenigen, die in erwachsenen Stadien Photosynthese betreiben. Aufgrund des Mangels an Nahrungsreserven in Orchideensamen sind Pilzsymbionten unerlässlich, um Substrate bereitzustellen und die Keimung zu ermöglichen. Die Analyse der Keimungsstadien nach strukturellen Perspektiven kann auch wichtige Fragen zur Interaktion der Pilze mit den Samen beantworten. Verschiedene bildgebende Verfahren können angewendet werden, um Pilzendophyten in Pflanzengeweben zu enthüllen, wie in diesem Artikel vorgeschlagen. Freihändige und dünne Schnitte von Pflanzenorganen können gefärbt und anschließend lichtmikroskopisch beobachtet werden. Ein mit Weizenkeimagglutinin konjugiertes Fluorochrom kann auf die Pilze aufgetragen und mit Calcofluor White co-inkubiert werden, um Pflanzenzellwände in der konfokalen Mikroskopie hervorzuheben. Darüber hinaus werden die Methoden der Raster- und Transmissionselektronenmikroskopie für mykoheterotrophe Orchideen detailliert beschrieben und die Möglichkeiten der Anwendung solcher Protokolle in verwandten Pflanzen untersucht. Die symbiotische Keimung von Orchideensamen (d.h. in Gegenwart von Mykorrhizapilzen) wird im Protokoll ausführlich beschrieben, ebenso wie Möglichkeiten, die aus verschiedenen Keimungsstadien erhaltenen Strukturen für Analysen mit Licht-, Konfokal- und Elektronenmikroskopie vorzubereiten.

Nach den wesentlichen Stadien der Fixierung von Pflanzengewebe ergeben Zellstrukturen, die dem Lebenszustand unter Berücksichtigung der Morphologie, des Volumens und der räumlichen Organisation von Zellkomponenten und Geweben so ähnlich wie möglich sind16. Beobachten Sie solche Merkmale in den Proben nach der chemischen Fixierung (Abbildung 4). Abbildung 4C-F stellt ausreichend fixierte Proben unter L...

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Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds

Dieses Protokoll zielt darauf ab, detaillierte Verfahren zum Sammeln, Fixieren und Pflegen mykoheterotropher Pflanzenproben bereitzustellen, wobei verschiedene Mikroskopietechniken wie Raster- und Transmissionselektronenmikroskopie, Licht-, Konfokal- und Fluoreszenzmikroskopie angewendet werden, um die Pilzbesiedlung in Pflanzengeweben und Samen zu untersuchen, die mit Mykorrhizapilzen gekeimt sind.

Mikroskopische Techniken zur Interpretation der Pilzbesiedlung in mykoheterotrophen Pflanzengeweben und der symbiotischen Keimung von Samen

Structural botany is an indispensable perspective to fully understand the ecology, physiology, development, and evolution of plants. When researching ...

Das Protokoll präsentiert verschiedene Mikroskopietechniken, die angewendet werden, um die Pilzbesiedlung in mykoheterotrophen Pflanzen zu verstehen, von der Entnahme bis zur Vorbereitung von Proben im Detail und umfasst wesentliche Schritte. Solche Techniken können auf verschiedene mykoheterotrophe Pflanzen und sogar auf andere Pflanzenmaterialien als Mykoheterotrophe angewendet werden. Diese Methode bezieht sich hauptsächlich auf die strukturelle Botanik und könnte auch Einblicke in Mykorrhiza-Interaktionen, Physiologie, Reproduktionsbiologie, Evolution und Ökologie mykoheterotropher Pflanzen geben.Sammeln Sie zunächst die mykoheterotrophen Pflanzen, indem Sie den Boden um die Pflanzenbasis herum erkunden und darauf achten, die unterirdischen Organe nicht zu beschädigen. Vermeiden Sie es auch, die Pflanzen vom Boden zu ziehen, um zu verhindern, dass die Luftorgane von den unterirdischen getrennt werden. Graben Sie vorsichtig mit einer Gartenkelle um Luftstrukturen herum, während Sie die unterirdischen Organe wie Wurzeln, Stängel, Rhizome und Speicherorgane erkunden, ohne diese Strukturen zu beschädigen.Entfernen Sie Bodenpartikel, um zerbrechliche Strukturen zu erhalten, und waschen Sie diese Organe vorsichtig mit Leitungswasser, um die verbleibenden Bodenpartikel abzuspülen, bevor Sie die Proben fixieren. Mykoheterotrophe Pflanzen, die mit Laubstreu assoziiert sind, erfordern besondere Aufmerksamkeit. Sammeln Sie daher sorgfältig die empfindlichen Organe, die durch ihre Hyphen mit dem zersetzenden Material verbunden sind, ohne sie aus den verbundenen Strukturen zu ziehen.Bewahren Sie Strukturen mit solchen Verbindungen und sammeln Sie den Abfall zur Analyse. Für die transmissionselektronenmikroskopische Analyse schneiden Sie die 3 bis 4 Millimeter dicken Proben in einem Tropfen Glutaraldehyd-Natriumcacodylatpuffer in kleinere Abschnitte von 1 bis 2 Millimeter Dicke. Verwerfen Sie die Schnittkanten außerhalb des Tropfens.Stellen Sie sicher, dass der Fixierungsprozess an der Sammelstelle unmittelbar nach der Sammlung der Pflanzen durchgeführt wird. Die Abschnitte werden sofort in ein Sammelröhrchen mit einem Fixiermittelvolumen überführt, das mehr als 10-mal größer ist als das Volumen der Proben, da es sich um ein additives Fixiermittel handelt. Zur Oberflächenanalyse der oberflächlichen Hyphen in den Organen, insbesondere bei unterirdischen Organen und solchen, die mit Laubstreu in Kontakt kommen.Beobachten Sie frisches oder festes Material unter dem Seziermikroskop bei einer 7,5-fachen oder höheren Vergrößerung. Suchen Sie nach den Interessengebieten, die von den oberflächlichen Hyphen und den Rhizomorphen geleitet werden. Wählen Sie die Proben aus, die Bereiche mit oberflächlichen Rhizomorphen enthalten, da diese geschnitten werden können, um Pelotone und Hyphenspulen innerhalb kortikaler Zellen in Wurzeln und Stängeln sichtbar zu machen.0,2 Milligramm pro Milliliter Weizenkeimagglutininfluorochrom-Konjugat und 1%Calcofluor-Weißlösungen in 0,1-Mol-Phosphatpuffer wie im Textmanuskript beschrieben hergestellt. Inkubieren Sie nun die Abschnitte auf Glasobjektträgern, indem Sie sie 30 Minuten lang mit Weizenkeimagglutinininfluorochrom-Konjugatlösung abdecken. Nach der Inkubation waschen Sie die Abschnitte mit 0,1 molaren Phosphatpuffer und inkubieren sie in der Calcofluorlösung als Trägermedium.Als nächstes legen Sie Deckblätter auf die Objektträger und beobachten Sie sie unter einem konfokalen oder fluoreszenzischen Lichtmikroskop mit den angegebenen Filtern. Nachdem Sie die Proben fixiert, dehydriert und in 70% Ethanol gelagert haben, belichten Sie jede gewünschte Oberfläche für die Rasterelektronenmikroskopie-Analyse, indem Sie eine scharfe und neue Rasierklinge verwenden, um Schnitte mit einer Einwegbewegung vorzunehmen. Verwenden Sie bei Bedarf ein Stereomikroskop, um die Proben auszuwählen, und berücksichtigen Sie den Bereich der Metallstummel bei der Bestimmung der Probengrößen.Ferner dehydrieren Sie die Proben in einer ethanolischen Serie. Bewahren Sie kleine und empfindliche Proben für 30 Minuten in jeder Konzentration und größere und dichtere Proben für 1 Stunde auf. Als nächstes falten Sie kleine Umschläge mit Seidenpapier, um Proben für die nächsten Schritte zu organisieren.Größere Proben können ohne Umschlag gehandhabt werden. Beschriften Sie die Umschläge mit einem Bleistift und führen Sie ein Protokoll der Proben. Legen Sie die Proben vorsichtig mit einem Pinsel in die Umschläge.Bewahren Sie diese Proben nun in absolutem Ethanol auf. Fahren Sie sofort mit der Trocknung kritischer Punkte fort, indem Sie einen kritischen Punkttrockner gemäß den Standardarbeitsanweisungen betreiben. Legen Sie dazu die Proben in absolutes Ethanol in einen Probenhalter und legen Sie es in die Druckkammer des Trockners des kritischen Punktes.Die Zwischenflüssigkeit löst sich am kritischen Kohlendioxidpunkt in die Übergangsflüssigkeit und trocknet so die Proben. Da die Rückabsorption der Luftfeuchtigkeit die Proben zerstören kann, lagern Sie sie unmittelbar nach der Trocknung des kritischen Punktes in einem Austrocknungsbehälter. Bevor Sie die Proben auf Metallstummel montieren, ziehen Sie die Handschuhe an, um die Stummel zu manipulieren.Tauchen Sie sie für 5 Minuten in Aceton, um Fett zu entfernen und trocknen zu lassen. Fixieren Sie die Proben unter einem Stereomikroskop mit einem leitfähigen doppelseitigen Kohleklebeband auf dem Stummel, und positionieren Sie sie. Die Stelle von oben ist die einzig mögliche Perspektive in rasterelektronenmikroskopischen Bildern.Um die Proben zu bearbeiten, verwenden Sie eine Feinspitzenpinzette. Das von der Pinzette berührte Probenteil ist in der Regel beschädigt. Seien Sie also vorsichtig und versuchen Sie, Teile zu berühren, die außerhalb der interessierenden Bereiche positioniert sind.Pflegen Sie die Stubs mit Proben in einer verschlossenen Petrischale mit Silikagel. Als nächstes fahren Sie mit der Sputterbeschichtung fort, um eine Gold- oder Platinschicht auf der Oberfläche der Proben in einer Niederdruckatmosphäre aus Inertgas abzuscheiden, indem Sie die Standardarbeitsanweisungen befolgen. Die Schichtdicke hängt von der Topographie der Probe ab und liegt in der Regel zwischen 15 und 40 Nanometern.Zum Schluss halten Sie die beschichteten Stummel in einer versiegelten Petrischale mit Silikagel, das Feuchtigkeit speichert. Die Proben können auf diese Weise wochenlang gelagert werden. Verwenden Sie ein Rasterelektronenmikroskop, um diese Proben zu analysieren.Ein Elektronenstrahl trifft während der Rasterelektronenmikroskopie auf die Vakuumprobe und die Signalemission aus dieser Wechselwirkung wird als Bilder interpretiert. Stellen Sie sicher, dass die Lösungen und Materialien, die bei der symbiotischen Keimung von Samen verwendet werden, steril sind. um eine Kontamination zu vermeiden.Beginnen Sie mit dem Autoklavieren für 20 Minuten bei 121 Grad Celsius. In einer laminaren Luftstromhaube die Früchte und Samen oberflächlich desinfizieren, indem Sie sie in eine Natriumhypochloritlösung mit 2% aktivem Chlor tauchen. Schlanke und zerbrechliche Samen können in eine 1:1 verdünnte Natriumhypochloritlösung getaucht werden.Nach der Desinfektion erholen Sie sich die Samen, indem Sie sie mit xerografischem Gewebe filtern. Waschen Sie die Früchte und Samen dreimal in autoklaviertem destilliertem Wasser, um die Hypochloritlösung zu entfernen, bevor Sie mit den Keimtests fortfahren. Bewahren Sie sie gegebenenfalls in Filterpapierhüllen in Glaskolben mit Kieselgel bei 4 Grad Celsius auf und verschließen Sie die Kolben hermetisch und verschließen Sie sie mit Frischhaltefolie, dann bewerten Sie die Wirksamkeit des Waschvorgangs, indem Sie einige Tropfen Wasser aus der letzten Wäsche in Kartoffeldextrose-Agar überführen.Für die symbiotische Keimung von Orchideensamen inkubieren Sie die Samen über 1 bis 2 Zentimeter autoklavierte Filterpapierscheiben, die in Petrischalen mit Haferflocken-Agar-Kulturmedium platziert sind. Beimpfen Sie nun die Mitte der Petrischale mit dem Fragment des Kulturmediums, das Myzel aus dem ausgewählten isolierten Pilz enthält. Verschließen Sie die Petrischalen mit Frischhaltefolie und brüten Sie sie je nach Pilzwachstum im Dunkeln bei etwa 25 Grad Celsius oder Raumtemperatur aus.Bereiten Sie einige Gerichte mit Samen und ohne Pilzimpfung als Negativkontrolle für den Keimtest zu. Analysieren Sie die Keimergebnisse wöchentlich, indem Sie quantitative und qualitative Daten sammeln und Protocorme und Sämlinge fotografieren. Die Rhizomorphe sind in der Regel leicht als dunkle, shoestringartige Strukturen zu erkennen.Freihand- oder andere Methoden zur Gewinnung von Abschnitten, die dicker als 10 Mikrometer sind, können Pelotone besser nachweisen und repräsentativere Bilder von Pilzmustern der Besiedlung liefern. Freihandschnitte können auch für die Hyphenanalyse in höherer Verstärkung geeignet sein. Details werden jedoch besser in dünneren Abschnitten erreicht.Die sekundären Zellwände in Xylemelementen können leicht durch die Lichtfarbe identifiziert werden, die Toluidine erwirbt. Phloemelemente, die nur aus primären Zellwänden bestehen, werden durch ihre dünneren und dunkleren Zellwände identifiziert. Artefakte durch Autofluoreszenz können in Glykolmethacrylat-Harzabschnitten gesehen werden.Diese Artefakte hängen normalerweise mit der Fluorchromkonzentration zusammen und können vermieden werden, indem die Proben häufiger mit dem Puffer gewaschen werden. Der freihändige Abschnitt der Wurzel zeigt innere und äußere Hyphen. Das gleiche Organ kann durch Rasterelektronenmikroskopie mit einer Fülle von Rhizomorphen und einzelnen Hyphen auf seiner Oberfläche gesehen werden.Die meisten Orchideenarten keimen innerhalb weniger Wochen nach der Infektion mit dem geimpften Pilz oder bis fast mehr als einen Monat. Licht in der Rasterelektronenmikroskopie kann auf Blumen, Früchte und Samen angewendet werden, um die Reproduktionsbiologie oder mykoheterotrophe Pflanzen zu untersuchen. Die symbiotische Keimung von Samen kann auch in autotrophen Orchideen getestet werden.

Research

JoVE Journal

Biology

Obtaining Hemocytes from the Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes and Observing their Adherence to Symbiotic and Non-Symbiotic Bacteria

Obtaining Hemocytes from the Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes and Observing their Adherence to Symbiotic and Non-Symbiotic Bacteria

Beziehen Blutzellen aus dem hawaiianischen Bobtail Squid Euprymna scolopes Und die Beobachtung ihrer Einhaltung Symbiotic und Non-symbiotischen Bakterien

Studies concerning the role of the immune system in mediating molecular signaling between beneficial bacteria and their hosts have, in recent years, made ...

Forschung

Biologie

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch-Clamp-und Perfusion Techniken zur Untersuchung von Ionenkanälen ausgedrückt in Xenopus Oozyten

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Tandem-Hochdruck-Schnell Einfrieren und Gefriersubstitution von Pflanzengeweben für die Transmissionselektronenmikroskopie

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Mess räumliche und zeitliche Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Signale in Arabidopsis-Pflanzen

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Die Analyse der Autophagie in<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Mithilfe von Starvation Pads in Kombination mit Fluoreszenzmikroskopie

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Rasterelektronenmikroskopie (SEM) Protokolle für Problematische Pflanze, Oomycete und Pilzproben

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

Lichtblatt Fluoreszenzmikroskopie von Pflanzenwurzeln wachsen auf der Oberfläche eines Gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Charakterisierung von Verkalkungen Events Verwendung von Live-optische und Elektronenmikroskopie-Techniken in einem Marine-Tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

Einfache und effektive Verwaltung und Visualisierung von Mikropartikeln im Herz-Kreislauf-System von kleinen Fischen mit Niere Injektion

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

Micron-scale Phenotyping Techniques of Maize Vascular Bundles Based on X-ray Microcomputed Tomography

Mikron-Skala Phänotypisierung Techniken der Mais Leitbündel basierend auf Microcomputed Röntgentomographie

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a ...