Name: microscopy techniques for interpreting fungal colonization in mycoheterotrophic plants tissues and symbiotic germination of seeds
Uploaded: 2022-05-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds at JoVE.com

המחברים מודים למימון מ-FAEPEX ו-FAPESP (2015/26479-6). MPP מודה לקייפס על מלגת התואר השני שלו (תהליך 88887.600591/2021-00) ו- CNPq. JLSM מודה ל- CNPq על מענקי פרודוקטיביות (303664/2020-7). המחברים מודים גם על הגישה לציוד ולסיוע הניתנים על ידי LME (המעבדה למיקרוסקופיית אלקטרונים - IB/Unicamp), INFABiC (המכון הלאומי למדע וטכנולוגיה על פוטוניקה יישומית לביולוגיה של התא - Unicamp), ו- LaBiVasc (המעבדה לביולוגיה של כלי הדם - DBEF/IB/Unicamp); LAMEB (UFSC) ואליאנה דה מדיירוס אוליביירה (UFSC) על תרומות לפרוטוקול cryoprotection; LME עבור תרומות לפרוטוקול TEM.

1. איסוף, תיקון ותחזוקה של דוגמאות
הערה: צמחי MH מלאים ניתן למצוא בדרך כלל ביער החשוך מתחת ל-12,13, בעיקר באזורים לחים ושופעי פסולת, בעוד שצמחי MH באופן חלקי ניתן למצוא ביערות פתוחים יותר12,13. לצמחי MH יש בדרך כל...

<ol>
	<li>Evert, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Esau&#8217;s Plant Anatomy: Meristems, Cells, and Tissues of the Plant Body: Their Structure, Function, and Development. , (2006).</li><li>Yeung, E. C. T., Stasolla, C., Sumner, M. J., Huang, B. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plant Microtechniques and Protocols. , (2015).</li><li>Sokoloff, D. D., Jura-Morawiec, J., Zoric, L., Fay, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+anatomy:+at+the+heart+of+modern+botany.">Plant anatomy: at the heart of modern botany.</a> Botanical Journal of the Linnean Society. 195 (3), 249-253 (2021).</li><li>Leake, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+myco-heterotrophic+(&#8216;saprophytic&#8217;)+plants.">The biology of myco-heterotrophic (&#8216;saprophytic&#8217;) plants.</a> New Phytologist. 127 (2), 171-216 (1994).</li><li>Bidartondo, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolutionary+ecology+of+myco-heterotrophy.">The evolutionary ecology of myco-heterotrophy.</a> New Phytologist. 167 (2), 335-352 (2005).</li><li>Imhof, S., Massicotte, H. B., Melville, L. H., Peterson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subterranean+morphology+and+mycorrhizal+structures.">Subterranean morphology and mycorrhizal structures.</a> Mycoheterotrophy. , 157-214 (2013).</li><li>Rasmussen, H. N., Rasmussen, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchid+mycorrhiza:+implications+of+a+mycophagous+life+style.">Orchid mycorrhiza: implications of a mycophagous life style.</a> Oikos. 118 (3), 334-345 (2009).</li><li>Rasmussen, H. N., Dixon, K. W., Jers&#225;kov&#225;, J., T&#283;&#353;itelov&#225;, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+and+seedling+establishment+in+orchids:+a+complex+of+requirements.">Germination and seedling establishment in orchids: a complex of requirements.</a> Annals of Botany. 116 (3), 391-402 (2015).</li><li>Zettler, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terrestrial+orchid+conservation+by+symbiotic+seed+germination:+techniques+and+perspectives.">Terrestrial orchid conservation by symbiotic seed germination: techniques and perspectives.</a> Selbyana. 18 (2), 188-194 (1997).</li><li>Stewart, S. L., Kane, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symbiotic+seed+germination+and+evidence+for+in+vitro+mycobiont+specificity+in+Spiranthes+brevilabris+(Orchidaceae)+and+its+implications+for+species-level+conservation.">Symbiotic seed germination and evidence for in vitro mycobiont specificity in Spiranthes brevilabris (Orchidaceae) and its implications for species-level conservation.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Plant. 43 (3), 178-186 (2007).</li><li>Zhao, D. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchid+reintroduction+based+on+seed+germination-promoting+mycorrhizal+fungi+derived+from+protocorms+or+seedlings.">Orchid reintroduction based on seed germination-promoting mycorrhizal fungi derived from protocorms or seedlings.</a> Frontiers in Plant Science. 12, 701152 (2021).</li><li>Selosse, M. A., Roy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+plants+that+feed+on+fungi:+facts+and+questions+about+mixotrophy.">Green plants that feed on fungi: facts and questions about mixotrophy.</a> Trends in Plant Science. 14 (2), 64-70 (2009).</li><li>Merckx, V. S. F. T., Mennes, C. B., Peay, K. G., Geml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+diversification.">Evolution and diversification.</a> Mycoheterotrophy: The Biology of Plants Living on Fungi. , 215-244 (2013).</li><li>Boon, M. E., Drijver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routine+Cytological+Staining+Techniques:+Theoretical+Background+and+Practice.">Routine Cytological Staining Techniques: Theoretical Background and Practice.</a> Macmillan International Higher Education. , (1986).</li><li>Karnovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+formaldehyde-glutaraldehyde+fixative+of+high+osmolality+for+use+in+electron+microscopy.">A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 27 (2), 137-138 (1964).</li><li>Hayat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fixation for Electron Microscopy. , (1981).</li><li>Roland, J. C., Vian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+preparation+and+staining+of+thin+sections.">General preparation and staining of thin sections.</a> Electron Microscopy of Plant Cells. 1, 675 (1991).</li><li>Gerrits, P. O., Horobin, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycol+methacrylate+embedding+for+light+microscopy:+basic+principles+and+trouble-shooting.">Glycol methacrylate embedding for light microscopy: basic principles and trouble-shooting.</a> Journal of Histotechnology. 19 (4), 297-311 (1996).</li><li>Zhang, Z., Niu, L., Chen, X., Xu, X., Ru, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+plant+cryosection.">Improvement of plant cryosection.</a> Frontiers in Biology. 7 (4), 374-377 (2012).</li><li>Bene&#352;, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+media+improving+freeze-sectioning+of+plant+material.">On the media improving freeze-sectioning of plant material.</a> Biologia Plantarum. 15 (1), 50-56 (1973).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+slides+and+coverslips+for+microscopy.">Preparation of slides and coverslips for microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (5), (2008).</li><li>Sakai, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+method+for+differential+staining+of+paraffin+embedded+plant+material+using+toluidine+blue+O.">Simple method for differential staining of paraffin embedded plant material using toluidine blue O.</a> Stain Technology. 48 (5), 247-249 (1973).</li><li>O&#8217;Brien, T., Feder, N., McCully, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polychromatic+staining+of+plant+cell+walls+by+toluidine+blue+O.">Polychromatic staining of plant cell walls by toluidine blue O.</a> Protoplasma. 59 (2), 368-373 (1964).</li><li>Ventrella, M. C., Almeida, A. L., Nery, L. A., Coelho, V. P. d. e. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#233;todos+Histoqu&#237;micos+Aplicados+&#224;s+Sementes.">M&#233;todos Histoqu&#237;micos Aplicados &#224;s Sementes.</a> Universidade Federal de Vi&#231;osa. , (2013).</li><li>Pearse, A. G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histochemistry, Theoretical and Applied. , (1960).</li><li>Andrade-Linares, D. R., Franken, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+endophytes+in+plant+roots:+taxonomy,+colonization+patterns,+and+functions.">Fungal endophytes in plant roots: taxonomy, colonization patterns, and functions.</a> Symbiotic Endophytes. , 311-334 (2013).</li><li>Wymer, C. L., Beven, A. F., Boudonck, K., Lloyd, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy+of+plant+cells.">Confocal microscopy of plant cells.</a> Confocal Microscopy Methods and Protocols. , 103-130 (1999).</li><li>Marques, J. P. R., Soares, M. K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+de+T&#233;cnicas+Aplicadas+&#224;+Histopatologia+Vegetal.">Manual de T&#233;cnicas Aplicadas &#224; Histopatologia Vegetal.</a> FEALQ. , (2021).</li><li>Navarro, B. L., Marques, J. P. R., Appezzato-da-Gl&#243;ria, B., Sp&#243;sito, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histopathology+of+Phakopsora+euvitis+on+Vitis+vinifera.">Histopathology of Phakopsora euvitis on Vitis vinifera.</a> European Journal of Plant Pathology. 154 (4), 1185-1193 (2019).</li><li>Marques, J. P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugarcane+cell+wall-associated+defense+responses+to+infection+by+Sporisorium+scitamineum.">Sugarcane cell wall-associated defense responses to infection by Sporisorium scitamineum.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 698 (2018).</li><li>Jeffree, C. E., Read, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ambient-and+low-temperature+scanning+electron+microscopy.">Ambient-and low-temperature scanning electron microscopy.</a> Electron Microscopy of Plant Cells. , 313-413 (1991).</li><li>Bozzola, J. J., Russell, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Electron Microscopy: Principles and Techniques for Biologists. , (1999).</li><li>Murray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+transmission+and+scanning+electron+microscopy.">Basic transmission and scanning electron microscopy.</a> Introduction to electron Microscopy for Biologists. , 3-18 (2008).</li><li>. Glossary of TEM terms Available from: <a target="_blank" href="https://www.jeol.co.jp/en/words/emterms/">https://www.jeol.co.jp/en/words/emterms/</a> (2021)</li><li>Seaton, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchid+seed+and+pollen:+a+toolkit+for+long-term+storage,+viability+assessment+and+conservation.">Orchid seed and pollen: a toolkit for long-term storage, viability assessment and conservation.</a> Orchid Propagation: From Laboratories to Greenhouses&#8212;Methods and Protocols. , 71-98 (2018).</li><li>Otero, J. T., Ackerman, J. D., Bayman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+mycorrhizal+preferences+between+two+tropical+orchids.">Differences in mycorrhizal preferences between two tropical orchids.</a> Molecular Ecology. 13 (8), 2393-2404 (2004).</li><li>Koch, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marasmioid+rhizomorphs+in+bird+nests:+Species+diversity,+functional+specificity,+and+new+species+from+the+tropics.">Marasmioid rhizomorphs in bird nests: Species diversity, functional specificity, and new species from the tropics.</a> Mycologia. 112 (6), 1086-1103 (2020).</li><li>Webster, J., Weber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Introduction to Fungi. , (2007).</li><li>Sisti, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+non-mycorrhizal+fungi+in+germination+of+the+mycoheterotrophic+orchid+Pogoniopsis+schenckii+Cogn.">The role of non-mycorrhizal fungi in germination of the mycoheterotrophic orchid Pogoniopsis schenckii Cogn.</a> Frontiers in Plant Science. 10, 1589 (2019).</li><li>Martos, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+recruitment+of+saprotrophic+fungi+as+mycorrhizal+partners+by+tropical+achlorophyllous+orchids.">Independent recruitment of saprotrophic fungi as mycorrhizal partners by tropical achlorophyllous orchids.</a> New Phytologist. 184 (3), 668-681 (2009).</li><li>Alves, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+development+and+genetic+structure+of+the+mycoheterotrophic+orchid+Pogoniopsis+schenckii+Cogn.">Reproductive development and genetic structure of the mycoheterotrophic orchid Pogoniopsis schenckii Cogn.</a> BMC Plant Biology. 21 (1), 332 (2021).</li><li>Merckx, V. S. F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycoheterotrophy:+an+introduction.">Mycoheterotrophy: an introduction.</a> Mycoheterotrophy: The Biology of Plants Living on Fungi. , 1-17 (2013).</li><li>Hall, J. L., Hawes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Electron Microscopy of Plant Cells. , (1991).</li></ol>

לניתוחי תמונות באנטומיה ובמורפולוגיה של צמחים יש פוטנציאל חשוב להגשים מטרות ולסייע בהבנת הקשרים בין צמחים מיקוהטרוטרופיים לבין אנדופיטים פטרייתיים חיוניים שלהם, כפי שהוכח על ידי מחקרים של איברים תת-קרקעיים 6,40, ניתוחים מבניים של נביטה סימביוטית של זרעים39,...

מחקר מבני בבוטניקה, המכסה מורפולוגיה ואנטומיה של צמחים, הוא בסיסי בהבנת האורגניזםכולו 1,2, ומספק נקודות מבט חיוניות לשילוב ותרומה לידע בנוגע לאקולוגיה, פיזיולוגיה, התפתחות ואבולוציה של צמחים3. שיטות במורפולוגיה ואנטומיה של צמחים כוללות כיום פרוטוקולים, ציוד וידע שפותחו לאחרונה כמו גם לפני יותר ממאה שנה2. לביצוע והתאמה מתמשכים של שיטות קלאסיות (למשל, מיקרוסקופיית אור) יחד עם טכניקות עדכניות יותר (למשל, מיקרוסקופיה קונפוקלית, מיקרוטומוגרפיה של קרני רנטגן) יש אותו בסיס חיוני: ידע תיאורטי המאפשר פיתוח מתודולוגיה.
הכלי העיקרי באנטומיה ובמורפולוגיה של צמחים הוא התמונה. למרות התפיסה המוטעית שניתוחים כאלה הם תצפיות פשוטות, הנותנות מקום לפרשנויות סובייקטיביות2, ניתוח והבנה של תמונות בתחום זה דורש ידע בשיטות המיושמות (הציוד, סוג הניתוח, הליכים מתודולוגיים), מרכיבי התא, היסטוכימיה וגוף הצמח (ארגון ותפקוד רקמות, אונטוגניה, התאמות מורפולוגיות). פירוש התמונות המתקבלות במגוון שיטות יכול להוביל לקורלציה בין צורה ותפקוד, פענוח ההרכב הכימי של מבנה, אימות בתיאור טקסה, הבנת זיהומים על ידי פיטופתוגנים והערכות אחרות מסוג זה.
כאשר חוקרים צמחים מיקוהטרוטרופיים (MH) (כלומר, צמחים שאינם פוטוסינתטיים המקבלים פחמן מפטריות מיקוריזאליות4,5), היבטים יוצאי דופן של ההתאמות המבניות שלהם, דפוסי התיישבות הרקמות על ידי פטריות, והמורפואאנטומיה של איברים תת-קרקעיים יכולים להאיר את אסטרטגיות ההתפתחות שלהם ואת הקשרים שלהם עם hyphae, שהם המקור לחומרים מזינים. האיברים התת-קרקעיים של צמחי MH מראים בדרך כלל התאמות חשובות הקשורות לקשר שלהם עם פטריות אדמה, ולכן חיוני לבצע חקירות אנטומיות ומורפולוגיות אלה6. אין להתעלם מאיברים אוויריים של מיני MH, שכן אנדופיטים יכולים להימצא גם ברקמות אלה, גם אם הם אינם פטריות מיקוריזאליות (תצפיות אישיות, טרם פורסמו).
מלבד החיוניות המבוססת היטב של קשר פטריות מיקוריזאליות עם מיני MH במהלך כל מחזור החיים שלהם7, לכל מיני הסחלבים, אפילו האוטוטרופיים, יש שלב מיקוהטרוטרופי מחייב ראשוני בסביבות טבעיות. זה קורה כי העובר של הסחלבים הוא מובחן וחסר אנדוספרם או cotyledons, ובכך להיות מסוגל לפתח ולהתבסס בסביבות טבעיות ללא תמיכה תזונתיים של שותפים פטרייתיים 4,8. בהתחשב בכך, פרוטוקולי נביטה סימביוטיים יכולים להיות מיושמים לא רק על מיני MH אלא גם על פוטוסינתזה של סחלבים, במטרה לחקור את הספציפיות של פטריית הסחלבים בנביטה ובפיתוח פרוטוקורם, מתודולוגיה מיושמת במידה רבה ביוזמות לשימור מינים בסכנת הכחדה 9,10,11.
בהרכבת שיטות זו, אנו מתארים שלבים חשובים הכרוכים באיסוף, תיקון ואחסון דגימות צמחי MH למחקרים אנטומיים (סעיף 1), ניתוח פני שטח ובחירת דגימות (סעיף 2), שיטות חתך (יד חופשית: סעיף 3, מיקרוטומיה: סעיף 4, קריומיקרוטומיה: סעיף 5), צביעה והרכבה (סעיף 6), מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וקונפוקלית של אנדופיטים פטרייתיים (סעיף 7), מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת (סעיף 8), ומיקרוסקופיית אלקטרונים (סעיף 9). בנוסף, אנו מתארים שיטת נביטה סימביוטית לזרעי סחלב (MH ואוטוטרופי, סעיף 10), שכן ניתן ליישם בהצלחה את שיטות ההדמיה שהוזכרו קודם לכן כדי לנתח התיישבות פטרייתית של זרעים, פרוטוקורמים ושתילים בתהליך הנביטה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63777/63777fig01.jpg"> איור 1: סיכום סכמטי של שיטות הדמיה. הסכמות מספקות אינדיקציות לשלבי הפרוטוקול שבהם הן מפורטות. קיצורים: GMA = גליקול מתקרילט, OCT = תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית, SEM = מיקרוסקופ אלקטרונים סורק. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63777/63777fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
לטכניקות המיקרוסקופיה המתוארות כאן בפירוט (איור 1) קדמו השלבים החיוניים הבאים: איסוף, תיקון, התייבשות, הטמעה וחיתוך דגימות. מכיוון שהשלבים משתנים (איור 1) בהתאם לטכניקות שנבחרו, חשוב לחשוב קדימה, בהתחשב בקיבועים שיש להכין ולהעביר לאתר האיסוף, כיצד יש להכין את הדגימות לפני התיקון, את תהליכי ההתייבשות שיש להשתמש בהם (סעיף 1), ואת אפשרויות ההטמעה ושיטות החיתוך השונות (סעיפים 4, 5, ו-9). איור 1 מסכם ברצף את כל השלבים הנדרשים עבור כל טכניקת מיקרוסקופיה המתוארת ביסודיות להלן.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179124</td>
			<td>(for SEM stubs mounting)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar-agar (AA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1296</td>
			<td>(for seeds germination tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcofluor White Stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18909</td>
			<td>fluorescent dye (detects cellulose)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate Buffer Solution, 0.09M pH 4.8</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2488</td>
			<td>(for toluidine blue O staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive Double-Sided Carbon Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-285-81</td>
			<td>(for SEM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper Grids</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4776</td>
			<td>(for TEM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical-point dryer</td>
			<td>Balzers</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>(= stereomicroscope, any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Entellan</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>107960</td>
			<td>rapid mounting medium for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol, pure (&#8805;99.5%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>459836</td>
			<td>(= ethanol, for dehydration processes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution, 37%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252549</td>
			<td>(for NBF solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td>histological tissue fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin capsules for TEM</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-248-71</td>
			<td>(for resin polymerisation in TEM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin solution, 2% in H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1393</td>
			<td>(dilute for slides preparation - OCT adherence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution, 25%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6257</td>
			<td>(for Karnovsky&#8217;s solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoResin</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>14702231731</td>
			<td>glycol methacrylate (GMA) embedding kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>207772</td>
			<td>(for Lugol solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead(II) nitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>228621</td>
			<td>Pb(NO3)2 (for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR White acrylic resin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9774</td>
			<td>hydrophilic acrylic resin for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lugol solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>62650</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal stubs for specimen mounts</td>
			<td>Rave Scientific</td>
			<td></td>
			<td>(for SEM, different models)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>manual rotary microtome or other model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oatmeal agar (OMA)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>O3506</td>
			<td>(for seeds germination tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Compound, Tissue-Tek</td>
			<td>Sakura Finetek USA</td>
			<td>4583</td>
			<td>embedding medium for frozen tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201030</td>
			<td>OsO4 (for TEM postfixation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793</td>
			<td>sealing thermoplastic film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td>(for Karnovsky&#8217;s solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine solution, 0.1% in H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td>(for slides preparation - OCT adherence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep Slides</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0425</td>
			<td>poly-L-lysine coated glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Molding Cup Trays</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>17177A-3</td>
			<td>(6x8x5 mm, for embbeding samples in GMA resin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Molding Cup Trays</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>17177C-3</td>
			<td>(13x19x5 mm, for embbeding samples in GMA resin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221945</td>
			<td>(for Lugol solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato Dextrose Agar (PDA)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>70139</td>
			<td>(for seeds germination tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscope</td>
			<td>Jeol</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silane [(3-Aminopropyl)triethoxysilane]</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3648</td>
			<td>(for slides preparation - OCT adherence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silane-Prep Slides</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4651</td>
			<td>glass slides coated with silane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel orange, granular</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>10087</td>
			<td>(for dessicating processes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0250</td>
			<td>(for glutaraldehyde-sodium cacodylate buffer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881</td>
			<td>NaOH (for Karnovsky&#8217;s solution preparation and TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>425044</td>
			<td>NaClO (for seeds surface disinfection)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic, anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71640</td>
			<td>Na2HPO4 (for NBF solution and PB preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td>NaH2PO4&#183;H2O (for NBF and PB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sputter coater</td>
			<td>Balzers</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td>C12H22O11 (for cryoprotection and germination test)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan III</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4131</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan IV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>198102</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan Black B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>199664</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(3 mL, any brand, for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter Unit, Millex-GV 0.22 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033R</td>
			<td>PVDF, 33 mm, gamma sterilized (for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tek Bond Super Glue 793</td>
			<td>Tek Bond Saint-Gobain</td>
			<td>78072720018</td>
			<td>liquid cyanoacrylate adhesive, medium viscosity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3260</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Jeol</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triphenyltetrazolium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8877</td>
			<td>(for the tetrazolium test in seeds germination)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1804</td>
			<td>Na3(C6H5O7)&#183;2H2O (for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-607-645</td>
			<td>UO2(CH3COO)2 (for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td>TermoFisher Scientific</td>
			<td>W11261</td>
			<td>fluorescent dye-conjugated lectin (detects sialic acid and N-acetylglucosaminyl residues)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microscopy techniques for interpreting fungal colonization in mycoheterotrophic plants tissues and symbiotic germination of seeds

בוטניקה מבנית היא נקודת מבט חיונית להבנה מלאה של האקולוגיה, הפיזיולוגיה, ההתפתחות והאבולוציה של צמחים. כאשר חוקרים צמחים מיקוהטרוטרופיים (כלומר, צמחים המקבלים פחמן מפטריות), היבטים יוצאי דופן של ההסתגלות המבנית שלהם, דפוסי התיישבות הרקמות על ידי פטריות והמורפואאנטומיה של איברים תת-קרקעיים יכולים להאיר את אסטרטגיות ההתפתחות שלהם ואת הקשרים שלהם עם hyphae, המקור של חומרים מזינים. תפקיד חשוב נוסף של פטריות סימביוטיות קשור לנביטת זרעי סחלב; כל מיני הסחלבים הם מיקוהטרוטרופיים בשלב הנביטה והשתילים (מיקוהטרוטרופיה ראשונית), אפילו אלה שמבצעים פוטוסינתזה בשלבים בוגרים. בשל היעדר עתודות תזונתיות בזרעי סחלב, סימביונטים פטרייתיים חיוניים כדי לספק מצעים ולאפשר נביטה. ניתוח שלבי הנביטה על ידי פרספקטיבות מבניות יכול גם לענות על שאלות חשובות לגבי האינטראקציה של הפטריות עם הזרעים. ניתן ליישם טכניקות הדמיה שונות כדי לחשוף אנדופיטים של פטריות ברקמות צמחים, כפי שמוצע במאמר זה. ניתן להכתים חלקים חופשיים ודקים של איברי הצמח ואז לצפות בהם באמצעות מיקרוסקופיה קלה. פלואורוכרום המצומד לאגלוטינין של נבט חיטה יכול להיות מיושם על הפטריות ולדגור יחד עם Calcofluor White כדי להדגיש את דפנות תאי הצמח במיקרוסקופיה קונפוקלית. בנוסף, המתודולוגיות של מיקרוסקופיית אלקטרונים סריקה והעברה מפורטות עבור סחלבים מיקוהטרוטרופיים, ונבחנות האפשרויות ליישם פרוטוקולים כאלה בצמחים קשורים. נביטה סימביוטית של זרעי סחלב (כלומר, בנוכחות פטריות מיקוריזאליות) מתוארת בפרוטוקול בפירוט, יחד עם אפשרויות להכנת המבנים המתקבלים משלבי נביטה שונים לניתוחים עם אור, קונפוקל ומיקרוסקופיית אלקטרונים.

בעקבות השלבים החיוניים של קיבוע רקמת הצמח מניב מבנים תאיים דומים ככל האפשר למצב החי, בהתחשב במורפולוגיה, נפח וארגון מרחבי של רכיבים תאיים ורקמות16. שימו לב לתכונות כאלה בדגימות לאחר קיבוע כימי (איור 4). איור 4C-F מייצג דגימות קבו?...

Watch this Scientific Journal Video about Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds at JoVE.com

Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds

פרוטוקול זה נועד לספק נהלים מפורטים לאיסוף, תיקון ותחזוקה של דגימות צמחים מיקוהטרוטרופיים, תוך יישום טכניקות מיקרוסקופיה שונות כגון מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת והולכה, מיקרוסקופיית אור, קונפוקלית ופלואורסצנטית כדי לחקור התיישבות פטרייתית ברקמות צמחים ובזרעים שנבטו בפטריות מיקוריזאליות.

טכניקות מיקרוסקופיה לפענוח התיישבות פטרייתית ברקמות צמחים מיקוהטרוטרופיים ונביטה סימביוטית של זרעים

Structural botany is an indispensable perspective to fully understand the ecology, physiology, development, and evolution of plants. When researching ...

הפרוטוקול מציג טכניקות מיקרוסקופיה מגוונות המיושמות כדי להבין את ההתיישבות הפטרייתית בצמחים מיקוהטרוטרופיים, החל מאיסוף וכלה בהכנת דגימות בפירוט וכוללות שלבים חיוניים. טכניקות כאלה יכולות להיות מיושמות על צמחים מיקוהטרוטרופיים שונים, ואפילו על חומרים של צמח שאינם mycoheterotrophics. שיטה זו קשורה בעיקר לבוטניקה מבנית ויכולה גם לספק תובנות על אינטראקציות מיקוריזאליות, פיזיולוגיה, ביולוגיה של הרבייה, אבולוציה ואקולוגיה של צמחים מיקוהטרוטרופיים.כדי להתחיל, לאסוף את הצמחים mycoheterotrophic על ידי חקירת הקרקע סביב בסיס הצמח, נזהר לא לפגוע באיברים תת קרקעיים. כמו כן, הימנעו ממשיכת הצמחים מהקרקע כדי למנוע ניתוק האיברים האוויריים מהתת-קרקעיים. בזהירות, חפרו סביב מבנים אוויריים באמצעות תרנגולת גינון תוך כדי חקר האיברים התת-קרקעיים כמו שורשים, גבעולים, קני שורש ואיברי אחסון מבלי לפגוע במבנים אלה.הסר חלקיקי אדמה כדי לשמר מבנים שבירים ושטוף בעדינות איברים אלה במי ברז כדי לשטוף את חלקיקי הקרקע הנותרים לפני תיקון הדגימות. צמחים מיקוהטרוטרופיים הקשורים לפסולת עלים דורשים תשומת לב נוספת. לפיכך, לאסוף בזהירות את האיברים העדינים המחוברים לחומר המתפרק באמצעות המקף שלהם מבלי למשוך אותם מהמבנים המחוברים.לשמר מבנים עם קשרים כאלה ולאסוף את המלטה לניתוח. לצורך ניתוח מיקרוסקופיית אלקטרונים, יש לחלק את הדגימות בעובי 3 עד 4 מילימטרים בתוך טיפה של חיץ נתרן קקודילאט גלוטראלדהיד למקטעים קטנים יותר בעובי של 1 עד 2 מילימטרים. השליכו את הקצוות החתוכים מחוץ לטיפה.הקפידו על ביצוע תהליך הקיבוע באתר האיסוף מיד לאחר איסוף הצמחים. מיד להעביר את החלקים לצינור איסוף עם נפח של fixative יותר מ 10 פעמים גדול יותר מאשר נפח של דגימות כפי שהוא מקבע תוסף. לניתוח פני השטח של הקורים השטחיים באיברים, במיוחד אלה התת-קרקעיים ואלה הבאים במגע עם פסולת עלים.שימו לב לחומר טרי או קבוע מתחת למיקרוסקופ המנתח בהגדלה של פי 7.5 ומעלה. חפש את תחומי העניין המונחים על ידי hyphae שטחי ואת rhizomorphs. בחר את הדגימות המכילות אזורים של ריזומורפים שטחיים מכיוון שניתן לחלק אותם כדי לדמיין פלוטונים וסלילי hyphae בתוך תאי קליפת המוח בשורשים ובגבעולים.הכינו 0.2 מיליגרם למיליליטר של נבט חיטה אגלוטינין פלואורוכרום מצומד ותמיסות לבנות של 1% קלקופולור במאגר פוספט טוחן 0.1 כמתואר בכתב היד של הטקסט. עכשיו, לדגור את החלקים על שקופיות זכוכית על ידי כיסוי כראוי עם נבט חיטה agglutinin fluorochrome מצומד פתרון במשך 30 דקות. לאחר הדגירה, לשטוף את החלקים עם 0.1 טוחנת פוספט חיץ לדגור אותם בתמיסת calcofluor כמדיום הרכבה.לאחר מכן, הנח את החלקות הכיסוי על השקופיות והתבונן בהן תחת מיקרוסקופ אור קונפוקלי או פלואורסצנטי באמצעות המסננים שצוינו. לאחר תיקון הדגימות, ביצוע התייבשות ואחסונן ב-70% אתנול, יש לחשוף כל משטח רצוי לסריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים על ידי שימוש בסכין גילוח חד וחדש לביצוע חתכים בתנועה חד-כיוונית. במידת הצורך, השתמש במיקרוסקופ סטריאו כדי לבחור את הדגימות ולהתחשב באזור גושי המתכת בעת קביעת גודל הדגימה.יתר על כן, לייבש את הדגימות בסדרה אתנולית. שמרו דגימות קטנות ועדינות למשך 30 דקות בכל ריכוז ודגימות גדולות וצפופות יותר למשך שעה. לאחר מכן, קפלו מעטפות קטנות באמצעות נייר טישו כדי לארגן דוגמאות לשלבים הבאים.ניתן לטפל בדגימות גדולות יותר ללא מעטפה. תייג את המעטפות באמצעות עיפרון ונהל יומן של הדגימות. בזהירות הניחו את הדוגמאות בתוך המעטפות בעזרת מכחול.עכשיו, לשמור את הדגימות האלה אתנול מוחלט. המשך מיידי בייבוש נקודתי קריטי על ידי הפעלת מייבש נקודה קריטית על פי נהלי ההפעלה הסטנדרטיים. לשם כך, הניחו את הדגימות באתנול מוחלט במחזיק דגימה והניחו אותו בתוך תא הלחץ של מייבש הנקודות הקריטיות.נוזל הביניים מתמוסס לתוך נוזל המעבר בנקודת הפחמן הדו-חמצני הקריטית, ובכך מייבש את הדגימות. מכיוון שספיגה מחדש של לחות אטמוספרית יכולה להרוס את הדגימות, אחסנו אותן במיכל ייבוש מיד לאחר ייבוש בנקודה קריטית. לפני הרכבת הדגימות על stubs מתכת, לשים את הכפפות על מנת לתפעל את stubs.לטבול אותם אצטון במשך 5 דקות כדי לחסל כל שומן ולתת להם להתייבש. תחת מיקרוסקופ סטריאו, תקן את הדגימות על המוט באמצעות סרט דבק פחמן דו-צדדי מוליך ומקם אותן. האתר מלמעלה הוא הפרספקטיבה היחידה האפשרית בסריקת תמונות מיקרוסקופיית אלקטרונים.כדי לתפעל את הדגימות, השתמש בפינצטה נקודה עדינה. החלק לדוגמה נגע על ידי פינצטה הוא פגום בדרך כלל. אז היזהר ונסה לגעת בחלקים הממוקמים הרחק מתחומי העניין.מתחזקים את הסטוצים עם דגימות בצלחת פטרי אטומה עם ג'ל סיליקה. לאחר מכן, המשך עם ציפוי sputter כדי להפקיד שכבה של זהב או פלטינה על פני השטח של דגימות באטמוספירה בלחץ נמוך של גז אינרטי על ידי ביצוע נהלי ההפעלה הסטנדרטיים. עובי הציפוי תלוי בטופוגרפיה של הדגימה והוא בדרך כלל בין 15 ל-40 ננומטר.לבסוף, שמרו על השקעים המצופים בצלחת פטרי אטומה עם ג'ל סיליקה השומר על הלחות. ניתן לאחסן את הדגימות בדרך זו במשך שבועות. השתמש במיקרוסקופ אלקטרונים סורק כדי לנתח דגימות אלה.קרן אלקטרונים פוגעת בדגימת ה-in vacuo במהלך סריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים ופליטת האות מאינטראקציה כזו מתפרשת כתמונות. ודא שהתמיסות והחומרים המשמשים לנביטה סימביוטית של זרעים הם סטריליים. כדי למנוע זיהום.התחל על ידי autoclaving אותם במשך 20 דקות ב 121 מעלות צלזיוס. במכסה מנוע זרימת אוויר למינרי, יש לחטא באופן שטחי את הפירות והזרעים על ידי טבילתם בתמיסת נתרן היפוכלוריט המכילה 2% כלור פעיל. זרעים דקים ושבירים ניתן לטבול בתמיסת נתרן היפוכלוריט מדולל ביחס של 1:1.לאחר החיטוי משחזרים את הזרעים על ידי סינון שלהם באמצעות בד זירוגרפי. שטפו את הפירות והזרעים שלוש פעמים במים מזוקקים כדי להסיר את תמיסת ההיפוכלוריט לפני שתמשיכו בבדיקות הנביטה. במידת הצורך, אחסנו אותם במעטפות נייר סינון בתוך צלוחיות זכוכית עם ג'ל סיליקה ב -4 מעלות צלזיוס וסגרו הרמטית את הצלוחיות ואטמו אותן בסרט נצמד, ואז העריכו את יעילות תהליך הכביסה על ידי העברת כמה טיפות מים מהכביסה האחרונה לאגר דקסטרוז תפוחי אדמה.לנביטה סימביוטית של זרעי סחלבים, דגרו את הזרעים מעל דיסקיות נייר סינון אוטומטיות בגודל 1 עד 2 ס"מ שהונחו בצלחות פטרי המכילות מדיום תרבית אגר שיבולת שועל. כעת, חסן את מרכז צלחת הפטרי עם שבר של מדיום תרבית המכיל תפטיר מהפטרייה המבודדת שנבחרה. אוטמים את צלחות הפטרי עם סרט נצמד ודוגמים אותן בחושך בסביבות 25 מעלות צלזיוס או בטמפרטורת החדר, תלוי בצמיחת הפטריות.הכן כמה מנות עם זרעים וללא חיסון פטרייתי כמו שליטה שלילית עבור בדיקת נביטה. נתח את תוצאות הנביטה מדי שבוע על ידי איסוף נתונים כמותיים ואיכותיים וצילום פרוטוקורמים ושתילים. ניתן לזהות בקלות את הריזומורפים בדרך כלל כמבנים כהים, דמויי שרוך.יד חופשית או שיטות אחרות להשגת מקטעים בעובי של יותר מ-10 מיקרומטר יכולות להפיק טוב יותר פלוטונים ולספק תמונות מייצגות יותר של תבניות פטרייתיות של התיישבות. קטעי יד חופשית יכולים להתאים גם לניתוח hyphae בהגברה גבוהה יותר. אמנם, פרטים מושגים טוב יותר בחלקים דקים יותר.ניתן לזהות בקלות את דפנות התא המשניות באלמנטים קסילם על ידי צבע האור שטולואידין רוכש. בינתיים, אלמנטים פלומיים המורכבים רק מדפנות התא הראשוניות מזוהים על ידי דפנות התא הדקות והכהות יותר שלהם. ממצאים על ידי אוטופלואורסצנציה ניתן לראות בקטעי שרף גליקול מתקרילט.ממצאים אלה קשורים בדרך כלל לריכוז פלואורוכרום וניתן להימנע מהם על ידי שטיפת הדגימות מספר רב יותר של פעמים עם המאגר. החלק החופשי של השורש מציג מקף פנימי וחיצוני. ניתן לראות את אותו איבר על ידי סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים עם שפע של ריזומורפים וקורים בודדים על פני השטח שלו.רוב מיני הסחלבים נובטים תוך מספר שבועות לאחר שנדבקו בפטרייה המחוסנת או עד כמעט יותר מחודש. אור במיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת יכול להיות מיושם על פרחים, פירות וזרעים כדי לחקור את ביולוגיית הרבייה או צמחים מיקוהטרוטרופיים. נביטה סימביוטית של זרעים יכולה להיבדק גם בסחלבים אוטוטרופיים.

Research

JoVE Journal

Biology

Obtaining Hemocytes from the Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes and Observing their Adherence to Symbiotic and Non-Symbiotic Bacteria

Obtaining Hemocytes from the Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes and Observing their Adherence to Symbiotic and Non-Symbiotic Bacteria

קבלת Hemocytes מן הוואי Bobtail קלמארי Euprymna scolopes והתבוננות דבקותם חיידקים סימביוטיים שאינן הסימביוטי

Studies concerning the role of the immune system in mediating molecular signaling between beneficial bacteria and their hosts have, in recent years, made ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

הצמד תיקון וטכניקות זלוף עבור לימוד תעלות יונים מתבטא Xenopus ביציות

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

הקפאה בלחץ גבוהה טנדם ומהיר הקפאת חילוף של צמח רקמות למיקרוסקופים אלקטרונים חודרים

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

מדידת מרחב ובזמן Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אותות בצמחים ארבידופסיס

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

ניתוח של Autophagy ב<em&gt; Chrysogenum Penicillium</em&gt; על ידי שימוש ברפידות רעב בשילוב עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

מיקרוסקופ אלקטרוני סורק הפרוטוקולים (SEM) עבור בעייתי הצמח, Oomycete, וכן דוגמאות פטרייתיים

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

מיקרוסקופ פלואורסצנטי גיליון אור של שורשי הצמח גדל על פני השטח של ג&#39;ל

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

אפיון של אירועים קלציפיקציה שימוש אופטי חיה מיקרוסקופית אלקטרונים טכניקות בתוך ימית תולעת-שפופרת

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

ניהול פשוטה ויעילה והדמיה של Microparticles במערכת הדם של דגים קטנים באמצעות הזרקת כליות

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

Micron-scale Phenotyping Techniques of Maize Vascular Bundles Based on X-ray Microcomputed Tomography

טכניקות Phenotyping בקנה מידה מיקרון של חבילות וסקולריים תירס מבוסס על צילום רנטגן טומוגרפיה Microcomputed

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a ...