Name: microscopy techniques for interpreting fungal colonization in mycoheterotrophic plants tissues and symbiotic germination of seeds
Uploaded: 2022-05-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds at JoVE.com

Gli autori ringraziano i finanziamenti di FAEPEX e FAPESP (2015/26479-6). MPP ringrazia Capes per la sua borsa di studio di master (processo 88887.600591/2021-00) e CNPq. JLSM ringrazia CNPq per le sovvenzioni di produttività (303664/2020-7). Gli autori ringraziano anche l'accesso alle attrezzature e all'assistenza fornita da LME (Laboratorio di Microscopia Elettronica - IB/Unicamp), INFABiC (Istituto Nazionale di Scienza e Tecnologia sulla Fotonica Applicata alla Biologia Cellulare - Unicamp), e LaBiVasc (Laboratorio di Biologia Vascolare - DBEF/IB/Unicamp); LAMEB (UFSC) e Eliana de Medeiros Oliveira (UFSC) per i contributi al protocollo di crioprotezione; LME per contributi al protocollo TEM.

1. Raccolta, fissaggio e conservazione dei campioni
NOTA: Le piante completamente MH si trovano di solito nel sottobosco della foresta oscura 12,13, principalmente in aree umide e abbondanti di rifiuti, mentre le piante parzialmente MH possono essere trovate nelle foreste più aperte12,13. Le piante MH di solito hanno organi sotterranei ben sviluppati in una vari...

<ol>
	<li>Evert, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Esau&#8217;s Plant Anatomy: Meristems, Cells, and Tissues of the Plant Body: Their Structure, Function, and Development. , (2006).</li><li>Yeung, E. C. T., Stasolla, C., Sumner, M. J., Huang, B. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plant Microtechniques and Protocols. , (2015).</li><li>Sokoloff, D. D., Jura-Morawiec, J., Zoric, L., Fay, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+anatomy:+at+the+heart+of+modern+botany.">Plant anatomy: at the heart of modern botany.</a> Botanical Journal of the Linnean Society. 195 (3), 249-253 (2021).</li><li>Leake, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+myco-heterotrophic+(&#8216;saprophytic&#8217;)+plants.">The biology of myco-heterotrophic (&#8216;saprophytic&#8217;) plants.</a> New Phytologist. 127 (2), 171-216 (1994).</li><li>Bidartondo, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolutionary+ecology+of+myco-heterotrophy.">The evolutionary ecology of myco-heterotrophy.</a> New Phytologist. 167 (2), 335-352 (2005).</li><li>Imhof, S., Massicotte, H. B., Melville, L. H., Peterson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subterranean+morphology+and+mycorrhizal+structures.">Subterranean morphology and mycorrhizal structures.</a> Mycoheterotrophy. , 157-214 (2013).</li><li>Rasmussen, H. N., Rasmussen, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchid+mycorrhiza:+implications+of+a+mycophagous+life+style.">Orchid mycorrhiza: implications of a mycophagous life style.</a> Oikos. 118 (3), 334-345 (2009).</li><li>Rasmussen, H. N., Dixon, K. W., Jers&#225;kov&#225;, J., T&#283;&#353;itelov&#225;, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+and+seedling+establishment+in+orchids:+a+complex+of+requirements.">Germination and seedling establishment in orchids: a complex of requirements.</a> Annals of Botany. 116 (3), 391-402 (2015).</li><li>Zettler, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terrestrial+orchid+conservation+by+symbiotic+seed+germination:+techniques+and+perspectives.">Terrestrial orchid conservation by symbiotic seed germination: techniques and perspectives.</a> Selbyana. 18 (2), 188-194 (1997).</li><li>Stewart, S. L., Kane, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symbiotic+seed+germination+and+evidence+for+in+vitro+mycobiont+specificity+in+Spiranthes+brevilabris+(Orchidaceae)+and+its+implications+for+species-level+conservation.">Symbiotic seed germination and evidence for in vitro mycobiont specificity in Spiranthes brevilabris (Orchidaceae) and its implications for species-level conservation.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Plant. 43 (3), 178-186 (2007).</li><li>Zhao, D. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchid+reintroduction+based+on+seed+germination-promoting+mycorrhizal+fungi+derived+from+protocorms+or+seedlings.">Orchid reintroduction based on seed germination-promoting mycorrhizal fungi derived from protocorms or seedlings.</a> Frontiers in Plant Science. 12, 701152 (2021).</li><li>Selosse, M. A., Roy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+plants+that+feed+on+fungi:+facts+and+questions+about+mixotrophy.">Green plants that feed on fungi: facts and questions about mixotrophy.</a> Trends in Plant Science. 14 (2), 64-70 (2009).</li><li>Merckx, V. S. F. T., Mennes, C. B., Peay, K. G., Geml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+diversification.">Evolution and diversification.</a> Mycoheterotrophy: The Biology of Plants Living on Fungi. , 215-244 (2013).</li><li>Boon, M. E., Drijver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routine+Cytological+Staining+Techniques:+Theoretical+Background+and+Practice.">Routine Cytological Staining Techniques: Theoretical Background and Practice.</a> Macmillan International Higher Education. , (1986).</li><li>Karnovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+formaldehyde-glutaraldehyde+fixative+of+high+osmolality+for+use+in+electron+microscopy.">A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 27 (2), 137-138 (1964).</li><li>Hayat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fixation for Electron Microscopy. , (1981).</li><li>Roland, J. C., Vian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+preparation+and+staining+of+thin+sections.">General preparation and staining of thin sections.</a> Electron Microscopy of Plant Cells. 1, 675 (1991).</li><li>Gerrits, P. O., Horobin, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycol+methacrylate+embedding+for+light+microscopy:+basic+principles+and+trouble-shooting.">Glycol methacrylate embedding for light microscopy: basic principles and trouble-shooting.</a> Journal of Histotechnology. 19 (4), 297-311 (1996).</li><li>Zhang, Z., Niu, L., Chen, X., Xu, X., Ru, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+plant+cryosection.">Improvement of plant cryosection.</a> Frontiers in Biology. 7 (4), 374-377 (2012).</li><li>Bene&#352;, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+media+improving+freeze-sectioning+of+plant+material.">On the media improving freeze-sectioning of plant material.</a> Biologia Plantarum. 15 (1), 50-56 (1973).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+slides+and+coverslips+for+microscopy.">Preparation of slides and coverslips for microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (5), (2008).</li><li>Sakai, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+method+for+differential+staining+of+paraffin+embedded+plant+material+using+toluidine+blue+O.">Simple method for differential staining of paraffin embedded plant material using toluidine blue O.</a> Stain Technology. 48 (5), 247-249 (1973).</li><li>O&#8217;Brien, T., Feder, N., McCully, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polychromatic+staining+of+plant+cell+walls+by+toluidine+blue+O.">Polychromatic staining of plant cell walls by toluidine blue O.</a> Protoplasma. 59 (2), 368-373 (1964).</li><li>Ventrella, M. C., Almeida, A. L., Nery, L. A., Coelho, V. P. d. e. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#233;todos+Histoqu&#237;micos+Aplicados+&#224;s+Sementes.">M&#233;todos Histoqu&#237;micos Aplicados &#224;s Sementes.</a> Universidade Federal de Vi&#231;osa. , (2013).</li><li>Pearse, A. G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histochemistry, Theoretical and Applied. , (1960).</li><li>Andrade-Linares, D. R., Franken, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+endophytes+in+plant+roots:+taxonomy,+colonization+patterns,+and+functions.">Fungal endophytes in plant roots: taxonomy, colonization patterns, and functions.</a> Symbiotic Endophytes. , 311-334 (2013).</li><li>Wymer, C. L., Beven, A. F., Boudonck, K., Lloyd, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy+of+plant+cells.">Confocal microscopy of plant cells.</a> Confocal Microscopy Methods and Protocols. , 103-130 (1999).</li><li>Marques, J. P. R., Soares, M. K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+de+T&#233;cnicas+Aplicadas+&#224;+Histopatologia+Vegetal.">Manual de T&#233;cnicas Aplicadas &#224; Histopatologia Vegetal.</a> FEALQ. , (2021).</li><li>Navarro, B. L., Marques, J. P. R., Appezzato-da-Gl&#243;ria, B., Sp&#243;sito, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histopathology+of+Phakopsora+euvitis+on+Vitis+vinifera.">Histopathology of Phakopsora euvitis on Vitis vinifera.</a> European Journal of Plant Pathology. 154 (4), 1185-1193 (2019).</li><li>Marques, J. P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugarcane+cell+wall-associated+defense+responses+to+infection+by+Sporisorium+scitamineum.">Sugarcane cell wall-associated defense responses to infection by Sporisorium scitamineum.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 698 (2018).</li><li>Jeffree, C. E., Read, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ambient-and+low-temperature+scanning+electron+microscopy.">Ambient-and low-temperature scanning electron microscopy.</a> Electron Microscopy of Plant Cells. , 313-413 (1991).</li><li>Bozzola, J. J., Russell, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Electron Microscopy: Principles and Techniques for Biologists. , (1999).</li><li>Murray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+transmission+and+scanning+electron+microscopy.">Basic transmission and scanning electron microscopy.</a> Introduction to electron Microscopy for Biologists. , 3-18 (2008).</li><li>. Glossary of TEM terms Available from: <a target="_blank" href="https://www.jeol.co.jp/en/words/emterms/">https://www.jeol.co.jp/en/words/emterms/</a> (2021)</li><li>Seaton, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchid+seed+and+pollen:+a+toolkit+for+long-term+storage,+viability+assessment+and+conservation.">Orchid seed and pollen: a toolkit for long-term storage, viability assessment and conservation.</a> Orchid Propagation: From Laboratories to Greenhouses&#8212;Methods and Protocols. , 71-98 (2018).</li><li>Otero, J. T., Ackerman, J. D., Bayman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+mycorrhizal+preferences+between+two+tropical+orchids.">Differences in mycorrhizal preferences between two tropical orchids.</a> Molecular Ecology. 13 (8), 2393-2404 (2004).</li><li>Koch, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marasmioid+rhizomorphs+in+bird+nests:+Species+diversity,+functional+specificity,+and+new+species+from+the+tropics.">Marasmioid rhizomorphs in bird nests: Species diversity, functional specificity, and new species from the tropics.</a> Mycologia. 112 (6), 1086-1103 (2020).</li><li>Webster, J., Weber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Introduction to Fungi. , (2007).</li><li>Sisti, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+non-mycorrhizal+fungi+in+germination+of+the+mycoheterotrophic+orchid+Pogoniopsis+schenckii+Cogn.">The role of non-mycorrhizal fungi in germination of the mycoheterotrophic orchid Pogoniopsis schenckii Cogn.</a> Frontiers in Plant Science. 10, 1589 (2019).</li><li>Martos, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+recruitment+of+saprotrophic+fungi+as+mycorrhizal+partners+by+tropical+achlorophyllous+orchids.">Independent recruitment of saprotrophic fungi as mycorrhizal partners by tropical achlorophyllous orchids.</a> New Phytologist. 184 (3), 668-681 (2009).</li><li>Alves, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+development+and+genetic+structure+of+the+mycoheterotrophic+orchid+Pogoniopsis+schenckii+Cogn.">Reproductive development and genetic structure of the mycoheterotrophic orchid Pogoniopsis schenckii Cogn.</a> BMC Plant Biology. 21 (1), 332 (2021).</li><li>Merckx, V. S. F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycoheterotrophy:+an+introduction.">Mycoheterotrophy: an introduction.</a> Mycoheterotrophy: The Biology of Plants Living on Fungi. , 1-17 (2013).</li><li>Hall, J. L., Hawes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Electron Microscopy of Plant Cells. , (1991).</li></ol>

Le analisi delle immagini nell'anatomia e morfologia delle piante hanno un importante potenziale per raggiungere gli obiettivi e aiutare a comprendere le relazioni tra le piante micoeterotrofe e i loro indispensabili endofiti fungini, come dimostrato dagli studi sugli organi sotterranei6,40, dalle analisi strutturali della germinazione simbiotica dei semi39 e dalle strutture aeree e riproduttive 41 . La botanica str...

La ricerca strutturale in botanica, che copre la morfologia e l'anatomia delle piante, è fondamentale per comprendere l'intero organismo1,2 e fornisce prospettive indispensabili per integrare e contribuire alla conoscenza riguardante l'ecologia, la fisiologia, lo sviluppo e l'evoluzione delle piante3. I metodi in morfologia e anatomia vegetale comprendono attualmente protocolli, attrezzature e conoscenze sviluppate di recente e più di un secolo fa2. L'esecuzione e l'adattamento continui di metodi classici (ad esempio, microscopia ottica) insieme a tecniche più recenti (ad esempio, microscopia confocale, microtomografia a raggi X) hanno la stessa base essenziale: conoscenze teoriche che consentono lo sviluppo di una metodologia.
Lo strumento principale nell'anatomia e nella morfologia delle piante è l'immagine. Nonostante l'idea errata che tali analisi siano semplici osservazioni, dando spazio a interpretazioni soggettive2, l'analisi e la comprensione delle immagini in quest'area richiede la conoscenza dei metodi applicati (l'attrezzatura, il tipo di analisi, le procedure metodologiche), i componenti cellulari, l'istochimica e il corpo vegetale (organizzazione e funzione dei tessuti, ontogenesi, adattamenti morfologici). L'interpretazione delle immagini ottenute attraverso una varietà di metodi può portare a correlare forma e funzione, decifrare la composizione chimica di una struttura, corroborare nella descrizione dei taxa, comprendere le infezioni da fitopatogeni e altre valutazioni simili.
Quando si studiano piante micoeterotrofe (MH) (cioè piante non fotosintetiche che ottengono carbonio dai funghi micorrizici4,5), aspetti notevoli dei loro adattamenti strutturali, i modelli di colonizzazione dei tessuti da parte dei funghi e la morfoanatomia degli organi sotterranei possono illuminare le loro strategie di sviluppo e le relazioni con le ife, che sono la fonte di nutrienti. Gli organi sotterranei delle piante MH di solito mostrano importanti adattamenti legati alla loro associazione con i funghi del suolo, quindi è essenziale eseguire queste indagini anatomiche e morfologiche6. Gli organi aerei delle specie MH non devono essere ignorati, poiché gli endofiti possono essere presenti anche in questi tessuti, anche se non sono funghi micorrizici (osservazioni personali, non ancora pubblicate).
Oltre alla consolidata essenzialità dell'associazione dei funghi micorrizici con le specie MH durante il loro intero ciclo vitale7, ogni specie di orchidea, anche quelle autotrofe, ha un primo stadio micoeterotrofico obbligato in ambienti naturali. Si verifica perché l'embrione delle orchidee è indifferenziato e manca di un endosperma o di cotiledoni, essendo quindi incapace di svilupparsi e stabilirsi in ambienti naturali senza il supporto nutrizionale di partner fungini 4,8. Considerando che, i protocolli di germinazione simbiotica possono essere applicati non solo alle specie MH ma anche alle orchidee fotosintetizzanti, con l'obiettivo di indagare la specificità orchidea-fungo nella germinazione e nello sviluppo del protocormo, una metodologia ampiamente applicata nelle iniziative per la conservazione delle specie minacciate 9,10,11.
In questo assemblaggio di metodi, descriviamo importanti passaggi coinvolti nella raccolta, fissazione e conservazione di campioni di piante MH per studi anatomici (sezione 1), analisi superficiale e selezione dei campioni (sezione 2), metodi di sezionamento (mano libera: sezione 3, microtomia: sezione 4, criomicrotomia: sezione 5), colorazione e montaggio (sezione 6), fluorescenza e microscopia confocale di endofiti fungini (sezione 7), microscopia elettronica a scansione (sezione 8), e microscopia elettronica a trasmissione (sezione 9). Inoltre, descriviamo un metodo di germinazione simbiotica per i semi di orchidea (MH e autotrofico, sezione 10), poiché i metodi di imaging precedentemente menzionati possono essere applicati con successo per analizzare la colonizzazione fungina di semi, protocormi e piantine nel processo di germinazione.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63777/63777fig01.jpg"> Figura 1: Riepilogo schematico dei metodi di imaging. Gli schemi forniscono indicazioni sui passaggi del protocollo in cui sono dettagliati. Abbreviazioni: GMA = glicole metacrilato, OCT = composto con temperatura di taglio ottimale, SEM = microscopia elettronica a scansione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63777/63777fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
Le tecniche di microscopia qui descritte in dettaglio (Figura 1) sono precedute dalle seguenti fasi essenziali: raccolta, fissaggio, disidratazione, incorporamento e sezionamento dei campioni. Poiché le fasi sono variabili (Figura 1) a seconda della tecnica o delle tecniche scelte, è importante pensare in anticipo, considerando i fissativi da preparare e trasportare al sito di raccolta, come i campioni devono essere preparati prima del fissaggio, i processi di disidratazione da utilizzare (sezione 1) e le diverse possibilità di incorporamento e metodi di sezionamento (sezioni 4, 5, e 9). La Figura 1 riassume sequenzialmente tutti i passaggi necessari per ciascuna tecnica di microscopia descritti dettagliatamente di seguito.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179124</td>
			<td>(for SEM stubs mounting)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar-agar (AA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1296</td>
			<td>(for seeds germination tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcofluor White Stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18909</td>
			<td>fluorescent dye (detects cellulose)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate Buffer Solution, 0.09M pH 4.8</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2488</td>
			<td>(for toluidine blue O staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive Double-Sided Carbon Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-285-81</td>
			<td>(for SEM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper Grids</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4776</td>
			<td>(for TEM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical-point dryer</td>
			<td>Balzers</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>(= stereomicroscope, any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Entellan</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>107960</td>
			<td>rapid mounting medium for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol, pure (&#8805;99.5%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>459836</td>
			<td>(= ethanol, for dehydration processes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution, 37%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252549</td>
			<td>(for NBF solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td>histological tissue fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin capsules for TEM</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-248-71</td>
			<td>(for resin polymerisation in TEM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin solution, 2% in H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1393</td>
			<td>(dilute for slides preparation - OCT adherence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution, 25%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6257</td>
			<td>(for Karnovsky&#8217;s solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoResin</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>14702231731</td>
			<td>glycol methacrylate (GMA) embedding kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>207772</td>
			<td>(for Lugol solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead(II) nitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>228621</td>
			<td>Pb(NO3)2 (for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR White acrylic resin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9774</td>
			<td>hydrophilic acrylic resin for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lugol solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>62650</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal stubs for specimen mounts</td>
			<td>Rave Scientific</td>
			<td></td>
			<td>(for SEM, different models)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>manual rotary microtome or other model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oatmeal agar (OMA)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>O3506</td>
			<td>(for seeds germination tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Compound, Tissue-Tek</td>
			<td>Sakura Finetek USA</td>
			<td>4583</td>
			<td>embedding medium for frozen tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201030</td>
			<td>OsO4 (for TEM postfixation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793</td>
			<td>sealing thermoplastic film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td>(for Karnovsky&#8217;s solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine solution, 0.1% in H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td>(for slides preparation - OCT adherence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep Slides</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0425</td>
			<td>poly-L-lysine coated glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Molding Cup Trays</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>17177A-3</td>
			<td>(6x8x5 mm, for embbeding samples in GMA resin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Molding Cup Trays</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>17177C-3</td>
			<td>(13x19x5 mm, for embbeding samples in GMA resin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221945</td>
			<td>(for Lugol solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato Dextrose Agar (PDA)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>70139</td>
			<td>(for seeds germination tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscope</td>
			<td>Jeol</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silane [(3-Aminopropyl)triethoxysilane]</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3648</td>
			<td>(for slides preparation - OCT adherence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silane-Prep Slides</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4651</td>
			<td>glass slides coated with silane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel orange, granular</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>10087</td>
			<td>(for dessicating processes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0250</td>
			<td>(for glutaraldehyde-sodium cacodylate buffer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881</td>
			<td>NaOH (for Karnovsky&#8217;s solution preparation and TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>425044</td>
			<td>NaClO (for seeds surface disinfection)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic, anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71640</td>
			<td>Na2HPO4 (for NBF solution and PB preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td>NaH2PO4&#183;H2O (for NBF and PB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sputter coater</td>
			<td>Balzers</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td>C12H22O11 (for cryoprotection and germination test)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan III</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4131</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan IV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>198102</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan Black B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>199664</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(3 mL, any brand, for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter Unit, Millex-GV 0.22 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033R</td>
			<td>PVDF, 33 mm, gamma sterilized (for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tek Bond Super Glue 793</td>
			<td>Tek Bond Saint-Gobain</td>
			<td>78072720018</td>
			<td>liquid cyanoacrylate adhesive, medium viscosity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3260</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Jeol</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triphenyltetrazolium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8877</td>
			<td>(for the tetrazolium test in seeds germination)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1804</td>
			<td>Na3(C6H5O7)&#183;2H2O (for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-607-645</td>
			<td>UO2(CH3COO)2 (for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td>TermoFisher Scientific</td>
			<td>W11261</td>
			<td>fluorescent dye-conjugated lectin (detects sialic acid and N-acetylglucosaminyl residues)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microscopy techniques for interpreting fungal colonization in mycoheterotrophic plants tissues and symbiotic germination of seeds

La botanica strutturale è una prospettiva indispensabile per comprendere appieno l'ecologia, la fisiologia, lo sviluppo e l'evoluzione delle piante. Quando si studiano piante micoeterotrofiche (cioè piante che ottengono carbonio dai funghi), aspetti notevoli dei loro adattamenti strutturali, i modelli di colonizzazione dei tessuti da parte dei funghi e la morfoanatomia degli organi sotterranei possono illuminare le loro strategie di sviluppo e le loro relazioni con le ife, la fonte di nutrienti. Un altro ruolo importante dei funghi simbionti è legato alla germinazione dei semi di orchidea; tutte le specie di Orchidaceae sono micoeterotrofiche durante la germinazione e la fase di semina (micoeterotrofia iniziale), anche quelle che fotosintetizzano negli stadi adulti. A causa della mancanza di riserve nutrizionali nei semi di orchidee, i simbionti fungini sono essenziali per fornire substrati e consentire la germinazione. L'analisi delle fasi di germinazione da prospettive strutturali può anche rispondere a domande importanti riguardanti l'interazione dei funghi con i semi. Diverse tecniche di imaging possono essere applicate per svelare gli endofiti dei funghi nei tessuti vegetali, come proposto in questo articolo. Le sezioni a mano libera e sottili degli organi vegetali possono essere colorate e quindi osservate con microscopia ottica. Un fluorocromo coniugato all'agglutinina del germe di grano può essere applicato ai funghi e co-incubato con Calcofluor White per evidenziare le pareti cellulari delle piante in microscopia confocale. Inoltre, le metodologie di scansione e microscopia elettronica a trasmissione sono dettagliate per orchidee micoeterotrofe e vengono esplorate le possibilità di applicare tali protocolli in piante correlate. La germinazione simbiotica dei semi di orchidea (cioè in presenza di funghi micorrizici) è descritta nel protocollo in dettaglio, insieme alle possibilità di preparare le strutture ottenute da diversi stadi di germinazione per analisi con microscopia ottica, confocale ed elettronica.

Seguendo le fasi essenziali di fissaggio del tessuto vegetale si ottengono strutture cellulari il più possibile simili allo stato vivente, considerando la morfologia, il volume e l'organizzazione spaziale dei componenti cellulari e dei tessuti16. Osservare tali tratti nei campioni dopo la fissazione chimica (Figura 4). La figura 4C-F rappresenta campioni adeguatamente fissati al microscopio ottico. Segui...

Watch this Scientific Journal Video about Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds at JoVE.com

Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds

Questo protocollo mira a fornire procedure dettagliate per la raccolta, la fissazione e il mantenimento di campioni di piante micoeterotrofiche, applicando diverse tecniche di microscopia come la microscopia elettronica a scansione e trasmissione, la microscopia ottica, confocale e a fluorescenza per studiare la colonizzazione fungina nei tessuti delle piante e nei semi germinati con funghi micorrizici.

Tecniche di microscopia per l'interpretazione della colonizzazione fungina nei tessuti delle piante micoeterotrofiche e della germinazione simbiotica dei semi

Structural botany is an indispensable perspective to fully understand the ecology, physiology, development, and evolution of plants. When researching ...

Il protocollo presenta diverse tecniche di microscopia applicate per comprendere la colonizzazione fungina nelle piante micoeterotrofiche, dalla raccolta alla preparazione dei campioni in dettaglio e include passaggi essenziali. Tali tecniche possono essere applicate a varie piante micoeterotrofe e persino a materiali di una pianta diversi dai micoeterotrofi. Questo metodo è principalmente legato alla botanica strutturale e potrebbe anche fornire approfondimenti sulle interazioni micorriziche, la fisiologia, la biologia riproduttiva, l'evoluzione e l'ecologia delle piante micoeterotrofiche.Per iniziare, raccogli le piante micoeterotrofe esplorando il terreno intorno alla base vegetale, facendo attenzione a non danneggiare gli organi sotterranei. Inoltre, evitare di tirare le piante da terra per evitare di scollegare gli organi aerei da quelli sotterranei. Con attenzione, scava intorno alle strutture aeree usando una cazzuola da giardinaggio mentre esplori gli organi sotterranei come radici, steli, rizomi e organi di stoccaggio senza danneggiare queste strutture.Rimuovere le particelle di terreno per preservare le strutture fragili e lavare delicatamente questi organi con acqua di rubinetto per risciacquare le particelle di terreno rimanenti prima di fissare i campioni. Le piante micoeterotrofiche associate alla lettiera di foglie richiedono particolare attenzione. Quindi, raccogli con cura i delicati organi collegati al materiale in decomposizione attraverso le loro ife senza estrarli dalle strutture collegate.Preservare le strutture con tali connessioni e raccogliere i rifiuti per l'analisi. Per l'analisi al microscopio elettronico a trasmissione, sezionare i campioni spessi da 3 a 4 millimetri all'interno di una goccia di tampone di cacodilato di sodio glutaraldeide in sezioni più piccole di spessore da 1 a 2 millimetri. Scartare i bordi tagliati all'esterno della goccia.Assicurarsi di condurre il processo di fissazione nel sito di raccolta immediatamente dopo la raccolta delle piante. Trasferire immediatamente le sezioni in una provetta di raccolta con un volume di fissativo superiore a 10 volte superiore al volume dei campioni in quanto è un fissativo additivo. Per l'analisi superficiale delle ife superficiali negli organi, specialmente in quelli sotterranei e in quelli a contatto con la lettiera fogliare.Osservare materiale fresco o fisso al microscopio da dissezione con un ingrandimento di 7,5x o superiore. Ricerca delle aree di interesse guidata dalle ife superficiali e dai rizomorfi. Selezionare i campioni contenenti aree di rizomorfi superficiali in quanto questi possono essere sezionati per visualizzare i pelotoni e le bobine di ife all'interno delle cellule corticali nelle radici e negli steli.Preparare 0,2 milligrammi per millilitro di germe di grano agglutinina fluorocromo coniugato e 1% calcofluor soluzioni bianche in 0,1 molare tampone fosfato come descritto nel manoscritto di testo. Ora, incubare le sezioni su vetrini coprendoli adeguatamente con germe di grano agglutinina fluorocromo soluzione coniugata per 30 minuti. Dopo l'incubazione, lavare le sezioni con tampone fosfato molare 0,1 e incubarle nella soluzione di calcofluor come mezzo di montaggio.Quindi, posizionare i vetrini di copertura sui vetrini e osservarlo al microscopio a luce confocale o a fluorescenza utilizzando i filtri indicati. Dopo aver fissato i campioni, eseguito la disidratazione e conservato in etanolo al 70%, esporre qualsiasi superficie desiderata per l'analisi al microscopio elettronico a scansione utilizzando una lama di rasoio affilata e nuova per eseguire tagli con un movimento unidirezionale. Se necessario, utilizzare uno stereomicroscopio per selezionare i campioni e considerare l'area dei mozziconi metallici mentre si determinano le dimensioni del campione.Inoltre, disidratare i campioni in una serie etanolica. Mantenere campioni piccoli e delicati per 30 minuti in ogni concentrazione e campioni più grandi e più densi per 1 ora. Quindi, piegare piccole buste usando carta velina per organizzare i campioni per i passaggi successivi.I campioni più grandi possono essere gestiti senza busta. Etichettare le buste con una matita e tenere un registro dei campioni. Con attenzione, posizionare i campioni all'interno delle buste usando un pennello.Ora, conservare questi campioni in etanolo assoluto. Procedere immediatamente con l'essiccazione dei punti critici azionando un essiccatore per punti critici secondo le procedure operative standard. Per questo, posizionare i campioni in etanolo assoluto in un portacampioni e posizionarlo all'interno della camera di pressione dell'essiccatore di punti critici.Il fluido intermedio si dissolve nel fluido di transizione nel punto critico di anidride carbonica, asciugando così i campioni. Poiché il riassorbimento dell'umidità atmosferica può distruggere i campioni, conservarli in un contenitore di essiccazione immediatamente dopo l'essiccazione del punto critico. Prima di montare i campioni su mozziconi di metallo, indossare i guanti per manipolare i mozziconi.Immergerli nell'acetone per 5 minuti per eliminare l'eventuale grasso e lasciarli asciugare. Sotto uno stereomicroscopio, fissare i campioni sul mozzicone usando un nastro biadesivo conduttivo al carbonio e posizionarli. Il sito dall'alto è l'unica prospettiva possibile nelle immagini di microscopia elettronica a scansione.Per manipolare i campioni, utilizzare pinzette a punta fine. La parte del campione toccata dalle pinzette è solitamente danneggiata. Quindi fai attenzione e prova a toccare le parti posizionate lontano dalle aree di interesse.Mantenere i mozziconi con campioni in una capsula di Petri sigillata con gel di silice. Successivamente, procedere con lo sputter coating per depositare uno strato di oro o platino sulla superficie dei campioni in un'atmosfera a bassa pressione di gas inerte seguendo le procedure operative standard. Lo spessore del rivestimento dipende dalla topografia del campione e di solito è compreso tra 15 e 40 nanometri.Infine, mantenere i mozziconi rivestiti in una piastra di Petri sigillata con gel di silice che trattiene l'umidità. I campioni possono essere conservati in questo modo per settimane. Utilizzare un microscopio elettronico a scansione per analizzare questi campioni.Un fascio di elettroni colpisce il campione nel vuoto durante la microscopia elettronica a scansione e l'emissione del segnale da tale interazione viene interpretata come immagini. Assicurarsi che le soluzioni e i materiali utilizzati nella germinazione simbiotica dei semi siano sterili. per evitare la contaminazione.Inizia con l'autoclave per 20 minuti a 121 gradi Celsius. In una cappa a flusso d'aria laminare, disinfettare superficialmente i frutti e i semi immergendoli in una soluzione di ipoclorito di sodio contenente il 2% di cloro attivo. I semi sottili e fragili possono essere immersi in una soluzione di ipoclorito di sodio diluito 1: 1.Dopo la disinfezione recuperare i semi filtrandoli con tessuto xerografico. Lavare tre volte i frutti e i semi in acqua distillata autoclavata per rimuovere la soluzione di ipoclorito prima di procedere con i test di germinazione. Se necessario, conservarli in buste di carta da filtro all'interno di boccette di vetro con gel di silice a 4 gradi Celsius e chiudere ermeticamente i palloni e sigillarli con pellicola trasparente, quindi valutare l'efficacia del processo di lavaggio trasferendo alcune gocce d'acqua dall'ultimo lavaggio all'agar destrosio di patate.Per la germinazione simbiotica dei semi di orchidea, incubare i semi su dischi di carta da filtro autoclavati da 1 a 2 centimetri posti in piastre di Petri contenenti terreno di coltura di agar di farina d'avena. Ora, inoculare il centro della capsula di Petri con il frammento di terreno di coltura contenente micelio dal fungo isolato scelto. Sigillare le piastre di Petri con pellicola trasparente e incubarle al buio a circa 25 gradi Celsius o temperatura ambiente, a seconda della crescita fungina.Preparare alcuni piatti con semi e senza inoculazione fungina come controllo negativo per il test di germinazione. Analizza settimanalmente i risultati della germinazione raccogliendo dati quantitativi e qualitativi e fotografando protocormi e piantine. I rizomorfi possono essere facilmente riconosciuti di solito come strutture scure, simili a stringhe di scarpe.A mano libera o altri metodi per ottenere sezioni più spesse di 10 micrometri possono migliorare i pelotoni e fornire immagini più rappresentative dei modelli fungini di colonizzazione. Le sezioni a mano libera possono anche essere adatte per l'analisi delle ife in amplificazione più elevata. Tuttavia, i dettagli sono meglio raggiunti nelle sezioni più sottili.Le pareti cellulari secondarie negli elementi xilematici possono essere facilmente identificate dal colore chiaro acquisito dalla toluidina. Nel frattempo, gli elementi floematici composti solo da pareti cellulari primarie sono identificati dalle loro pareti cellulari più sottili e più scure. Gli artefatti per autofluorescenza possono essere visti nelle sezioni di resina glicole metacrilato.Questi artefatti sono solitamente correlati alla concentrazione di fluorocromo e possono essere evitati lavando i campioni un numero maggiore di volte con il tampone. La sezione a mano libera della radice mostra ife interne ed esterne. Lo stesso organo può essere visto mediante microscopia elettronica a scansione con un'abbondanza di rizomorfi e singole ife sulla sua superficie.La maggior parte delle specie di orchidee germinano entro alcune settimane dopo essere state infettate dal fungo inoculato o fino a quasi più di un mese. La luce nella microscopia elettronica a scansione può essere applicata a fiori, frutti e semi per studiare la biologia riproduttiva o le piante micoeterotrofiche. La germinazione simbiotica dei semi può anche essere testata nelle orchidee autotrofe.

Research

JoVE Journal

Biology

Obtaining Hemocytes from the Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes and Observing their Adherence to Symbiotic and Non-Symbiotic Bacteria

Obtaining Hemocytes from the Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes and Observing their Adherence to Symbiotic and Non-Symbiotic Bacteria

Ottenere ematociti concentrati dal hawaiano Bobtail Squid Euprymna scolopes L&#39;osservazione e la loro aderenza ai batteri simbionti e non Symbiotic

Studies concerning the role of the immune system in mediating molecular signaling between beneficial bacteria and their hosts have, in recent years, made ...

Ricerca

Biologia

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch clamp e Tecniche di perfusione per la valutazione dei canali ioni Espresso in Xenopus Ovociti

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Tandem congelamento ad alta pressione e congelamento rapido Sostituzione di tessuti vegetali per la microscopia elettronica a trasmissione

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Misurazione spaziale e temporale Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Segnali in Arabidopsis Piante

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analisi di autofagia in<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Utilizzando Starvation Pads in combinazione con microscopia a fluorescenza

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Microscopia elettronica a scansione (SEM) Protocolli per problematico Plant, oomicete, e campioni fungine

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

Luce Foglio microscopia a fluorescenza delle radici delle piante che crescono sulle superficie di un gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Caratterizzazione di calcificazione eventi utilizzando dal vivo ottica ed elettronica Microscopia tecniche in un tubeworm Marine

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

Amministrazione semplice ed efficace e la visualizzazione di microparticelle nell'apparato circolatorio di piccoli pesci mediante l'inserimento di rene

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

Micron-scale Phenotyping Techniques of Maize Vascular Bundles Based on X-ray Microcomputed Tomography

Micron-scala Phenotyping tecniche di mais fasci vascolari basato su x-Ray Microcomputed Tomography

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a ...