Name: microscopy techniques for interpreting fungal colonization in mycoheterotrophic plants tissues and symbiotic germination of seeds
Uploaded: 2022-05-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds at JoVE.com

著者らは、FAEPEXおよびFAPESP(2015/26479-6)からの資金提供に感謝する。MPPは、修士号奨学金(プロセス88887.600591 / 2021-00)とCNPqに感謝します。 JLSMは、生産性助成金(303664 / 2020-7)に対してCNPqに感謝します。著者らはまた、LME(電子顕微鏡研究所-IB /ユニキャンプ)、INFABiC(細胞生物学に適用されるフォトニクスに関する国立科学技術研究所-ユニキャンプ)、およびLaBiVasc(血管生物学研究所-DBEF / IB /ユニキャンプ)によって提供される機器と支援へのアクセスに感謝します。LAMEB(UFSC)およびエリアナ・デ・メデイロス・オリベイラ(UFSC)は、凍結保護プロトコルへの貢献に対して。TEMプロトコルへの貢献のためのLME。

1.サンプルの収集、修正、および保守
注:完全にMHの植物は通常、主に湿気の多いゴミの多い地域の暗い森の下層12,13に見られますが、部分的にMHの植物はより開放的な森林で見つけることができます12,13。MH植物は通常、さまざまな形や大きさのよく発達した地下器官を持っ...

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植物の解剖学と形態学における画像解析は、地下器官の研究6,40、種子の共生発芽の構造解析39、および空中および生殖構造41によって実証されるように、目的を達成し、マイコ従属栄養植物とその不可欠な真菌内生植物の関係を理解するのに役立つ重要な可能性を秘めています。.構造植物学は、過去10年間で植物...

植物の形態学と解剖学を網羅する植物学の構造研究は、生物全体を理解する上で基礎であり1,2、植物の生態・生理・発生・進化に関する知識を統合し、貢献するために不可欠な視点を提供します3。植物の形態学と解剖学の方法は、現在、最近および1世紀以上前に開発されたプロトコル、機器、および知識で構成されています2。古典的な方法(光学顕微鏡など)の継続的な実行と適応は、より最近の技術(共焦点顕微鏡、X線マイクロトモグラフィーなど)と同じ本質的な基礎を持っています:方法論の開発を可能にする理論的知識。
植物の解剖学と形態学の主なツールは画像です。このような分析は単純な観察であるという誤解にもかかわらず、主観的な解釈にスペースを与えます2、この領域の画像を分析および理解するには、適用される方法(機器、分析の種類、方法論的手順)、細胞成分、組織化学、および植物体(組織の組織と機能、個体発生、形態学的適応)。さまざまな 方法で得られた画像を 解釈することで、形態と機能の相関、構造の化学組成の解読、分類群の記述の裏付け、植物病原体による感染の理解などにつながります。
菌従属栄養植物(菌根菌から炭素を得る非光合成植物4,5)を研究する場合、その構造適応、真菌による組織コロニー形成のパターン、および地下器官の形態解剖学的構造の顕著な側面は、それらの発生戦略と栄養素の源である菌糸との関係を啓発することができます。MH植物の地下器官は通常、土壌真菌との関連に関連する重要な適応を示すため、これらの解剖学的および形態学的調査を行うことが不可欠です6。MH種の空中器官は、菌根菌でなくても、これらの組織にも内生菌が存在する可能性があるため、無視してはなりません(個人的な観察、まだ公開されていません)。
菌根菌とMH種との関連がライフサイクル全体にわたって確立された必須性に加えて7、すべてのラン種は、独立栄養種でさえ、自然環境において最初の絶対的な菌従属栄養段階を持っています。これは、ランの胚が未分化であり、胚乳や子葉を欠いているため、真菌パートナーの栄養サポートなしに自然環境で発達および確立することができないために発生します4,8。それを考慮すると、共生発芽プロトコルはMH種だけでなく、光合成ランにも適用でき、発芽と原始球の発生におけるラン菌特異性を調査することを目的としており、絶滅危惧種の保全イニシアチブに広く適用されている方法論です9,10,11。
この方法の組み立てでは、解剖学的研究のためのMH植物サンプルの収集、固定、および保管(セクション1)、表面分析とサンプル選択(セクション2)、セクショニング方法(フリーハンド:セクション3、ミクロトミー:セクション4、クライオミクロトミー:セクション5)、染色とマウント(セクション6)、真菌内生植物の蛍光および共焦点顕微鏡(セクション7)、走査型電子顕微鏡(セクション8)、 透過型電子顕微鏡(セクション9)。さらに、ラン種子の共生発芽法(MHと独立栄養、セクション10)について述べ、前述のイメージング法は、発芽過程における種子、原球菌、および苗の真菌コロニー形成の分析にうまく適用できるためです。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63777/63777fig01.jpg"> 図1:イメージング方法の概略図。回路図は、それらが詳述されているプロトコルステップの指示を提供します。略語:GMA =グリコールメタクリレート、OCT =最適な切断温度化合物、SEM =走査型電子顕微鏡。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63777/63777fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
ここで詳細に説明する顕微鏡技術(図1)の前には、サンプルの収集、固定、脱水、埋め込み、および切片作成という重要なステップがあります。手順は選択した技術に応じて可変であるため(図1)、準備して収集サイトに輸送する固定液、固定前のサンプルの準備方法、使用する脱水プロセス(セクション1)、およびさまざまな埋め込みの可能性とセクショニング方法(セクション4、5、 および9)。 図1 は、以下に徹底的に説明する各顕微鏡技術に必要なすべてのステップを順番にまとめたものです。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179124</td>
			<td>(for SEM stubs mounting)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar-agar (AA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1296</td>
			<td>(for seeds germination tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcofluor White Stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18909</td>
			<td>fluorescent dye (detects cellulose)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate Buffer Solution, 0.09M pH 4.8</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2488</td>
			<td>(for toluidine blue O staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive Double-Sided Carbon Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-285-81</td>
			<td>(for SEM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper Grids</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4776</td>
			<td>(for TEM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical-point dryer</td>
			<td>Balzers</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>(= stereomicroscope, any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Entellan</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>107960</td>
			<td>rapid mounting medium for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol, pure (&#8805;99.5%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>459836</td>
			<td>(= ethanol, for dehydration processes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution, 37%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252549</td>
			<td>(for NBF solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td>histological tissue fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin capsules for TEM</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-248-71</td>
			<td>(for resin polymerisation in TEM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin solution, 2% in H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1393</td>
			<td>(dilute for slides preparation - OCT adherence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution, 25%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6257</td>
			<td>(for Karnovsky&#8217;s solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoResin</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>14702231731</td>
			<td>glycol methacrylate (GMA) embedding kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>207772</td>
			<td>(for Lugol solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead(II) nitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>228621</td>
			<td>Pb(NO3)2 (for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR White acrylic resin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9774</td>
			<td>hydrophilic acrylic resin for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lugol solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>62650</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal stubs for specimen mounts</td>
			<td>Rave Scientific</td>
			<td></td>
			<td>(for SEM, different models)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>manual rotary microtome or other model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oatmeal agar (OMA)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>O3506</td>
			<td>(for seeds germination tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Compound, Tissue-Tek</td>
			<td>Sakura Finetek USA</td>
			<td>4583</td>
			<td>embedding medium for frozen tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201030</td>
			<td>OsO4 (for TEM postfixation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793</td>
			<td>sealing thermoplastic film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td>(for Karnovsky&#8217;s solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine solution, 0.1% in H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td>(for slides preparation - OCT adherence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep Slides</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0425</td>
			<td>poly-L-lysine coated glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Molding Cup Trays</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>17177A-3</td>
			<td>(6x8x5 mm, for embbeding samples in GMA resin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Molding Cup Trays</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>17177C-3</td>
			<td>(13x19x5 mm, for embbeding samples in GMA resin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221945</td>
			<td>(for Lugol solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato Dextrose Agar (PDA)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>70139</td>
			<td>(for seeds germination tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscope</td>
			<td>Jeol</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silane [(3-Aminopropyl)triethoxysilane]</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3648</td>
			<td>(for slides preparation - OCT adherence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silane-Prep Slides</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4651</td>
			<td>glass slides coated with silane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel orange, granular</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>10087</td>
			<td>(for dessicating processes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0250</td>
			<td>(for glutaraldehyde-sodium cacodylate buffer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881</td>
			<td>NaOH (for Karnovsky&#8217;s solution preparation and TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>425044</td>
			<td>NaClO (for seeds surface disinfection)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic, anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71640</td>
			<td>Na2HPO4 (for NBF solution and PB preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td>NaH2PO4&#183;H2O (for NBF and PB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sputter coater</td>
			<td>Balzers</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td>C12H22O11 (for cryoprotection and germination test)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan III</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4131</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan IV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>198102</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan Black B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>199664</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(3 mL, any brand, for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter Unit, Millex-GV 0.22 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033R</td>
			<td>PVDF, 33 mm, gamma sterilized (for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tek Bond Super Glue 793</td>
			<td>Tek Bond Saint-Gobain</td>
			<td>78072720018</td>
			<td>liquid cyanoacrylate adhesive, medium viscosity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3260</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Jeol</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triphenyltetrazolium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8877</td>
			<td>(for the tetrazolium test in seeds germination)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1804</td>
			<td>Na3(C6H5O7)&#183;2H2O (for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-607-645</td>
			<td>UO2(CH3COO)2 (for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td>TermoFisher Scientific</td>
			<td>W11261</td>
			<td>fluorescent dye-conjugated lectin (detects sialic acid and N-acetylglucosaminyl residues)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microscopy techniques for interpreting fungal colonization in mycoheterotrophic plants tissues and symbiotic germination of seeds

構造植物学は、植物の生態、生理、発達、進化を完全に理解するために不可欠な視点です。菌従属栄養植物(菌類から炭素を得る植物)を研究する場合、その構造適応、菌類による組織コロニー形成のパターン、地下器官の形態解剖学的構造などの顕著な側面は、その発生戦略と栄養源である菌糸との関係を解明することができます。共生菌のもう一つの重要な役割は、ランの種子の発芽に関連しています。すべてのラン科種は、発芽および実生段階(初期マイコヘテロトロフィー)の間に菌従属栄養性であり、成虫段階で光合成するものでさえあります。ランの種子には栄養貯蔵が不足しているため、真菌共生生物は基質を提供し、発芽を可能にするために不可欠です。構造的な観点から発芽段階を分析することは、真菌と種子との相互作用に関する重要な質問に答えることもできます。この記事で提案されているように、植物組織中の真菌内生植物を明らかにするために、さまざまなイメージング技術を適用できます。植物器官のフリーハンドおよび薄い切片を染色し、光学顕微鏡を使用して観察することができます。小麦胚芽凝集素に結合した蛍光色素を真菌に適用し、Calcofluor Whiteと共生して、共焦点顕微鏡で植物細胞壁を強調することができます。さらに、菌従属栄養ランの走査型および透過型電子顕微鏡の方法論が詳述されており、そのようなプロトコルを関連植物に適用する可能性が探求されています。ラン種子の共生発芽(すなわち、菌根菌の存在下で)は、光、共焦点、および電子顕微鏡による分析のために発芽の異なる段階から得られた構造を調製する可能性とともに、プロトコルに詳細に記載されている。

植物組織を固定する重要な段階に続いて、細胞成分および組織の形態、体積、および空間的組織を考慮して、生きている状態に可能な限り類似した細胞構造をもたらす16。化学的固定後のサンプルでそのような特性を観察します(図4)。図4C-Fは、光学顕微鏡下で適切に固定されたサンプルを表しています。...

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Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds

このプロトコルは、菌根菌で発芽した植物組織および種子における真菌コロニー形成を研究するために、走査型および透過型電子顕微鏡、光学顕微鏡、共焦点顕微鏡、蛍光顕微鏡などのさまざまな顕微鏡技術を適用して、マイコ従属栄養植物サンプルを収集、固定、および維持するための詳細な手順を提供することを目的としています。

菌従属栄養植物組織における真菌のコロニー形成と種子の共生発芽を解釈するための顕微鏡技術

Structural botany is an indispensable perspective to fully understand the ecology, physiology, development, and evolution of plants. When researching ...

このプロトコルは、サンプルの収集から調製まで、真菌従属栄養植物の真菌コロニー形成を理解するために適用される多様な顕微鏡技術を提示し、重要なステップを含みます。このような技術は、様々な菌従属栄養植物に適用することができ、さらには菌従属栄養植物以外の植物の材料にも適用することができる。この方法は主に構造植物学に関連しており、菌根相互作用、生理学、生殖生物学、進化、および菌従属栄養植物の生態学への洞察も提供する可能性があります。はじめに、地下器官を傷つけないように注意しながら、植物ベースの周りの土壌を探索することによって、菌従属栄養植物を集めます。また、地下の臓器から空中の臓器が外れないように、植物を地面から引っ張ることは避けてください。慎重に、ガーデニングこてを使用して空中構造物を掘り起こし、根、茎、根茎、貯蔵器官などの地下器官を損傷することなく探索します。汚れやすい構造を保存するために土壌粒子を取り除き、サンプルを固定する前に、これらの臓器を水道水で繊細に洗い流して残りの土壌粒子を洗い流します。落葉に関連する菌従属栄養植物は特別な注意を必要とします。したがって、分解材料に接続されている繊細な臓器を、接続された構造から引っ張ることなく、菌糸を通して慎重に収集します。そのような接続を持つ構造を保存し、分析のためにゴミを集めます。透過型電子顕微鏡分析では、厚さ3〜4ミリメートルのサンプルをグルタルアルデヒドカコジル酸ナトリウムバッファーの滴の中に入れて、厚さ1〜2ミリメートルの小さな切片に分割します。ドロップの外側のカットエッジを破棄します。植物の収集直後に収集場所で固定プロセスを実施するようにしてください。添加剤の固定液であるため、サンプルの体積の10倍以上の固定液の量を持つ収集チューブに切片を直ちに移します。臓器、特に地下のものや落葉と接触している臓器の表在菌糸の表面分析用。新鮮な材料または固定された材料を解剖顕微鏡で7.5倍以上の倍率で観察します。表在性菌糸と根茎によって導かれる関心のある領域を検索します。表面根茎の領域を含むサンプルを選択して、根と茎の皮質細胞内のペロトンと菌糸コイルを視覚化することができます。テキスト原稿に記載されているように、小麦胚芽凝集フルオロクロムコンジュゲートのミリリットルあたり0.2ミリグラムと0.1モルのリン酸緩衝液中の1%カルコフルオロア白色溶液を調製します。次に、スライドガラス上の切片を小麦胚芽凝集活性色素コンジュゲート溶液で30分間適切に覆ってインキュベートします。インキュベーション後、切片を0.1モルのリン酸緩衝液で洗浄し、封入媒体としてカルコフルール溶液中でインキュベートします。次に、スライドにカバースリップを置き、指示されたフィルターを使用して共焦点または蛍光光学顕微鏡で観察します。サンプルを固定し、脱水を行い、70%エタノールに保存した後、鋭利で新しいかみそりの刃を使用して一方向の動きで切り込みを入れ、走査型電子顕微鏡分析に必要な表面を露出させます。必要に応じて、実体顕微鏡を使用してサンプルを選択し、サンプルサイズを決定する際に金属スタブ領域を考慮します。さらに、エタノール系列でサンプルを脱水する。小さくて繊細なサンプルを各濃度で30分間維持し、大きくて密度の高いサンプルを1時間維持します。次に、ティッシュペーパーを使用して小さな封筒を折り、次のステップのためにサンプルを整理します。より大きなサンプルは封筒なしで扱うことができます。鉛筆を使用して封筒にラベルを付け、サンプルのログを保管します。慎重に、絵筆を使用して封筒の中にサンプルを置きます。次に、これらのサンプルを絶対エタノールに保管します。標準的な操作手順に従って臨界点乾燥機を操作することにより、臨界点乾燥を直ちに進めます。このためには、サンプルをサンプルホルダーの絶対エタノールに入れ、臨界点乾燥機の圧力チャンバー内に置きます。中間流体は臨界二酸化炭素点で遷移流体に溶解し、サンプルを乾燥させます。大気中の湿度を再吸収するとサンプルが破壊される可能性があるため、臨界点乾燥後すぐに乾燥容器に保管してください。サンプルを金属スタブに取り付ける前に、手袋を着用してスタブを操作します。アセトンに5分間浸して脂肪を取り除き、乾かします。実体顕微鏡下で、導電性両面カーボン粘着テープを使用してサンプルをスタブに固定し、配置します。上からのサイトは、走査型電子顕微鏡画像で唯一の可能な遠近法です。サンプルを操作するには、ファインポイントピンセットを使用します。ピンセットが触れたサンプル部分は通常損傷しています。したがって、注意して、関心のある領域から離れた場所にある部品に触れてみてください。シリカゲルを含む密封されたペトリ皿にサンプルを含むスタブを維持します。次に、標準操作手順に従って不活性ガスの低圧雰囲気下で試料の表面に金または白金の層を堆積させるスパッタコーティングを進めます。コーティングの厚さはサンプルのトポグラフィーに依存し、通常は15〜40ナノメートルです。最後に、コーティングされたスタブを、湿度を保持するシリカゲルで密封されたペトリ皿に維持します。サンプルはこの方法で数週間保存できます。走査型電子顕微鏡を使用して、これらのサンプルを分析します。走査型電子顕微鏡中に電子ビームが真空中の試料に当たり、そのような相互作用からの信号放出は画像として解釈されます。種子の共生発芽に使用される溶液と材料が無菌であることを確認してください。汚染を避けるために。摂氏121度で20分間オートクレーブすることから始めます。層流フードで、果物と種子を2%活性塩素を含む次亜塩素酸ナトリウム溶液に浸して表面的に消毒します。スリムで壊れやすい種子は、1:1の希釈次亜塩素酸ナトリウム溶液に浸すことができます。消毒後、ゼログラフィック布を使用して種子をろ過して種子を回収します。発芽試験に進む前に、オートクレーブ滅菌した蒸留水で果物と種子を3回洗浄して次亜塩素酸塩溶液を除去します。必要に応じて、摂氏4度のシリカゲルを含むガラスフラスコ内の濾紙封筒に保管し、フラスコを密閉して粘着フィルムで密封し、最後の洗浄からジャガイモデキストロース寒天に数滴の水を移して洗浄プロセスの有効性を評価します。ランの種子の共生発芽のために、オートミール寒天培地を含むペトリ皿に入れた1〜2センチメートルのオートクレーブ処理されたろ紙ディスクで種子をインキュベートします。次に、ペトリ皿の中央に、選択した単離された真菌からの菌糸体を含む培養液の断片を接種します。ペトリ皿を粘着フィルムで密封し、真菌の成長に応じて、摂氏約25度または室温で暗闇でインキュベートします。発芽試験のための陰性対照として、種子と真菌接種なしでいくつかの皿を準備します。定量的および定性的なデータを収集し、原球と苗を撮影することにより、発芽結果を毎週分析します。根茎は通常、暗い靴ひものような構造として簡単に認識できます。フリーハンドまたは10マイクロメートルより厚い切片を得る他の方法は、プロトンをよりよく証明し、コロニー形成の真菌パターンのより代表的な画像を提供することができる。フリーハンド切片は、高増幅における菌糸分析にも適しています。ただし、詳細は薄いセクションでより適切に達成されます。木部要素の二次細胞壁は、トルイジンが獲得する明るい色によって容易に識別することができる。一方、一次細胞壁のみで構成される師部要素は、細胞壁が薄くて暗いことで識別されます。自家蛍光によるアーチファクトは、グリコールメタクリレート樹脂切片に見られます。これらのアーチファクトは通常、蛍光色素濃度に関連しており、バッファーでサンプルを複数回洗浄することで回避できます。根のフリーハンドセクションは、内部および外部の菌糸を示しています。同じ器官は、その表面に豊富な根粒菌と個々の菌糸を備えた走査型電子顕微鏡によって見ることができます。ほとんどのラン種は、接種された真菌に感染してから数週間以内、またはほぼ1か月以上まで発芽します。走査型電子顕微鏡の光を花、果実、種子に適用して、生殖生物学やマイコ従属栄養植物を調べることができます。種子の共生発芽は、独立栄養ランでも試験することができます。

Research

JoVE Journal

Biology

Obtaining Hemocytes from the Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes and Observing their Adherence to Symbiotic and Non-Symbiotic Bacteria

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ハワイのボブテイルイカから血球の入手 Euprymna scolopesと共生と非共生細菌への遵守を観察

Studies concerning the role of the immune system in mediating molecular signaling between beneficial bacteria and their hosts have, in recent years, made ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

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イオンチャネル研究のためのパッチクランプおよび灌流のテクニックで表さアフリカツメガエル卵母細胞

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

タンデム高圧凍結および透過型電子顕微鏡のための植物組織の急速凍結置換

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

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時空のCaを測定する<sup&gt; 2 +</supシロイヌナズナ植物における&gt;シグナル

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

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オートファジーの解析で<em&gt;ペニシリウム·クリソゲヌム</em&gt;蛍光顕微鏡と組み合わせて飢餓パッドを使用した

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Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

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問題のあるプラント、卵菌類、および真菌サンプルのための電子顕微鏡（SEM）プロトコルをスキャン

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

ゲルの表面上に成長する植物の根の光シート蛍光顕微鏡

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

マリンTubewormでライブ光学および電子顕微鏡技術を用いた石灰化イベントのキャラクタリゼーション

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

シンプルで効果的な管理と腎臓の注入を使用する小型魚の循環システムの微粒子の可視化

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

Micron-scale Phenotyping Techniques of Maize Vascular Bundles Based on X-ray Microcomputed Tomography

X 線マイクロ断層レントゲン写真撮影に基づいてトウモロコシの維管束のミクロン スケール表現型解析技術

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a ...