Name: microscopy techniques for interpreting fungal colonization in mycoheterotrophic plants tissues and symbiotic germination of seeds
Uploaded: 2022-05-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds at JoVE.com

저자는 FAEPEX 및 FAPESP (2015/26479-6)의 자금 지원에 감사드립니다. MPP는 석사 학위 장학금(프로세스 88887.600591/2021-00)에 대해 Capes에게 감사를 표하고 CNPq. JLSM은 생산성 보조금(303664/2020-7)에 대해 CNPq에 감사드립니다. 저자는 또한 LME (전자 현미경 실험실 - IB / Unicamp), INFABiC (세포 생물학에 적용된 포토닉스에 관한 국립 과학 기술 연구소 - Unicamp) 및 LaBiVasc (혈관 생물학 실험실 - DBEF / IB / Unicamp); LAMEB (UFSC) 및 엘리아나 데 메데이로스 올리베이라 (UFSC) 냉동 보호 프로토콜에 대한 기여; TEM 프로토콜에 대한 기여에 대한 LME.

1. 샘플 수집, 고정 및 유지 관리
참고 : 완전 MH 식물은 일반적으로 주로 습하고 쓰레기가 풍부한 지역의 어두운 숲 지하층 12,13에서 발견 될 수있는 반면, 부분적으로 MH 식물은 더 개방 된 숲(12,13)에서 발견 될 수 있습니다. MH 식물은 일반적으로 다양한 모양과 크기의 잘 발달 ?...

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	<li>Evert, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Esau&#8217;s Plant Anatomy: Meristems, Cells, and Tissues of the Plant Body: Their Structure, Function, and Development. , (2006).</li><li>Yeung, E. C. T., Stasolla, C., Sumner, M. J., Huang, B. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plant Microtechniques and Protocols. , (2015).</li><li>Sokoloff, D. D., Jura-Morawiec, J., Zoric, L., Fay, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+anatomy:+at+the+heart+of+modern+botany.">Plant anatomy: at the heart of modern botany.</a> Botanical Journal of the Linnean Society. 195 (3), 249-253 (2021).</li><li>Leake, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+myco-heterotrophic+(&#8216;saprophytic&#8217;)+plants.">The biology of myco-heterotrophic (&#8216;saprophytic&#8217;) plants.</a> New Phytologist. 127 (2), 171-216 (1994).</li><li>Bidartondo, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolutionary+ecology+of+myco-heterotrophy.">The evolutionary ecology of myco-heterotrophy.</a> New Phytologist. 167 (2), 335-352 (2005).</li><li>Imhof, S., Massicotte, H. B., Melville, L. H., Peterson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subterranean+morphology+and+mycorrhizal+structures.">Subterranean morphology and mycorrhizal structures.</a> Mycoheterotrophy. , 157-214 (2013).</li><li>Rasmussen, H. N., Rasmussen, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchid+mycorrhiza:+implications+of+a+mycophagous+life+style.">Orchid mycorrhiza: implications of a mycophagous life style.</a> Oikos. 118 (3), 334-345 (2009).</li><li>Rasmussen, H. N., Dixon, K. W., Jers&#225;kov&#225;, J., T&#283;&#353;itelov&#225;, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+and+seedling+establishment+in+orchids:+a+complex+of+requirements.">Germination and seedling establishment in orchids: a complex of requirements.</a> Annals of Botany. 116 (3), 391-402 (2015).</li><li>Zettler, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terrestrial+orchid+conservation+by+symbiotic+seed+germination:+techniques+and+perspectives.">Terrestrial orchid conservation by symbiotic seed germination: techniques and perspectives.</a> Selbyana. 18 (2), 188-194 (1997).</li><li>Stewart, S. L., Kane, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symbiotic+seed+germination+and+evidence+for+in+vitro+mycobiont+specificity+in+Spiranthes+brevilabris+(Orchidaceae)+and+its+implications+for+species-level+conservation.">Symbiotic seed germination and evidence for in vitro mycobiont specificity in Spiranthes brevilabris (Orchidaceae) and its implications for species-level conservation.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Plant. 43 (3), 178-186 (2007).</li><li>Zhao, D. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchid+reintroduction+based+on+seed+germination-promoting+mycorrhizal+fungi+derived+from+protocorms+or+seedlings.">Orchid reintroduction based on seed germination-promoting mycorrhizal fungi derived from protocorms or seedlings.</a> Frontiers in Plant Science. 12, 701152 (2021).</li><li>Selosse, M. A., Roy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+plants+that+feed+on+fungi:+facts+and+questions+about+mixotrophy.">Green plants that feed on fungi: facts and questions about mixotrophy.</a> Trends in Plant Science. 14 (2), 64-70 (2009).</li><li>Merckx, V. S. F. T., Mennes, C. B., Peay, K. G., Geml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+diversification.">Evolution and diversification.</a> Mycoheterotrophy: The Biology of Plants Living on Fungi. , 215-244 (2013).</li><li>Boon, M. E., Drijver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routine+Cytological+Staining+Techniques:+Theoretical+Background+and+Practice.">Routine Cytological Staining Techniques: Theoretical Background and Practice.</a> Macmillan International Higher Education. , (1986).</li><li>Karnovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+formaldehyde-glutaraldehyde+fixative+of+high+osmolality+for+use+in+electron+microscopy.">A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 27 (2), 137-138 (1964).</li><li>Hayat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fixation for Electron Microscopy. , (1981).</li><li>Roland, J. C., Vian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+preparation+and+staining+of+thin+sections.">General preparation and staining of thin sections.</a> Electron Microscopy of Plant Cells. 1, 675 (1991).</li><li>Gerrits, P. O., Horobin, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycol+methacrylate+embedding+for+light+microscopy:+basic+principles+and+trouble-shooting.">Glycol methacrylate embedding for light microscopy: basic principles and trouble-shooting.</a> Journal of Histotechnology. 19 (4), 297-311 (1996).</li><li>Zhang, Z., Niu, L., Chen, X., Xu, X., Ru, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+plant+cryosection.">Improvement of plant cryosection.</a> Frontiers in Biology. 7 (4), 374-377 (2012).</li><li>Bene&#352;, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+media+improving+freeze-sectioning+of+plant+material.">On the media improving freeze-sectioning of plant material.</a> Biologia Plantarum. 15 (1), 50-56 (1973).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+slides+and+coverslips+for+microscopy.">Preparation of slides and coverslips for microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (5), (2008).</li><li>Sakai, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+method+for+differential+staining+of+paraffin+embedded+plant+material+using+toluidine+blue+O.">Simple method for differential staining of paraffin embedded plant material using toluidine blue O.</a> Stain Technology. 48 (5), 247-249 (1973).</li><li>O&#8217;Brien, T., Feder, N., McCully, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polychromatic+staining+of+plant+cell+walls+by+toluidine+blue+O.">Polychromatic staining of plant cell walls by toluidine blue O.</a> Protoplasma. 59 (2), 368-373 (1964).</li><li>Ventrella, M. C., Almeida, A. L., Nery, L. A., Coelho, V. P. d. e. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#233;todos+Histoqu&#237;micos+Aplicados+&#224;s+Sementes.">M&#233;todos Histoqu&#237;micos Aplicados &#224;s Sementes.</a> Universidade Federal de Vi&#231;osa. , (2013).</li><li>Pearse, A. G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histochemistry, Theoretical and Applied. , (1960).</li><li>Andrade-Linares, D. R., Franken, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+endophytes+in+plant+roots:+taxonomy,+colonization+patterns,+and+functions.">Fungal endophytes in plant roots: taxonomy, colonization patterns, and functions.</a> Symbiotic Endophytes. , 311-334 (2013).</li><li>Wymer, C. L., Beven, A. F., Boudonck, K., Lloyd, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy+of+plant+cells.">Confocal microscopy of plant cells.</a> Confocal Microscopy Methods and Protocols. , 103-130 (1999).</li><li>Marques, J. P. R., Soares, M. K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+de+T&#233;cnicas+Aplicadas+&#224;+Histopatologia+Vegetal.">Manual de T&#233;cnicas Aplicadas &#224; Histopatologia Vegetal.</a> FEALQ. , (2021).</li><li>Navarro, B. L., Marques, J. P. R., Appezzato-da-Gl&#243;ria, B., Sp&#243;sito, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histopathology+of+Phakopsora+euvitis+on+Vitis+vinifera.">Histopathology of Phakopsora euvitis on Vitis vinifera.</a> European Journal of Plant Pathology. 154 (4), 1185-1193 (2019).</li><li>Marques, J. P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugarcane+cell+wall-associated+defense+responses+to+infection+by+Sporisorium+scitamineum.">Sugarcane cell wall-associated defense responses to infection by Sporisorium scitamineum.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 698 (2018).</li><li>Jeffree, C. E., Read, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ambient-and+low-temperature+scanning+electron+microscopy.">Ambient-and low-temperature scanning electron microscopy.</a> Electron Microscopy of Plant Cells. , 313-413 (1991).</li><li>Bozzola, J. J., Russell, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Electron Microscopy: Principles and Techniques for Biologists. , (1999).</li><li>Murray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+transmission+and+scanning+electron+microscopy.">Basic transmission and scanning electron microscopy.</a> Introduction to electron Microscopy for Biologists. , 3-18 (2008).</li><li>. Glossary of TEM terms Available from: <a target="_blank" href="https://www.jeol.co.jp/en/words/emterms/">https://www.jeol.co.jp/en/words/emterms/</a> (2021)</li><li>Seaton, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchid+seed+and+pollen:+a+toolkit+for+long-term+storage,+viability+assessment+and+conservation.">Orchid seed and pollen: a toolkit for long-term storage, viability assessment and conservation.</a> Orchid Propagation: From Laboratories to Greenhouses&#8212;Methods and Protocols. , 71-98 (2018).</li><li>Otero, J. T., Ackerman, J. D., Bayman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+mycorrhizal+preferences+between+two+tropical+orchids.">Differences in mycorrhizal preferences between two tropical orchids.</a> Molecular Ecology. 13 (8), 2393-2404 (2004).</li><li>Koch, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marasmioid+rhizomorphs+in+bird+nests:+Species+diversity,+functional+specificity,+and+new+species+from+the+tropics.">Marasmioid rhizomorphs in bird nests: Species diversity, functional specificity, and new species from the tropics.</a> Mycologia. 112 (6), 1086-1103 (2020).</li><li>Webster, J., Weber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Introduction to Fungi. , (2007).</li><li>Sisti, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+non-mycorrhizal+fungi+in+germination+of+the+mycoheterotrophic+orchid+Pogoniopsis+schenckii+Cogn.">The role of non-mycorrhizal fungi in germination of the mycoheterotrophic orchid Pogoniopsis schenckii Cogn.</a> Frontiers in Plant Science. 10, 1589 (2019).</li><li>Martos, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+recruitment+of+saprotrophic+fungi+as+mycorrhizal+partners+by+tropical+achlorophyllous+orchids.">Independent recruitment of saprotrophic fungi as mycorrhizal partners by tropical achlorophyllous orchids.</a> New Phytologist. 184 (3), 668-681 (2009).</li><li>Alves, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+development+and+genetic+structure+of+the+mycoheterotrophic+orchid+Pogoniopsis+schenckii+Cogn.">Reproductive development and genetic structure of the mycoheterotrophic orchid Pogoniopsis schenckii Cogn.</a> BMC Plant Biology. 21 (1), 332 (2021).</li><li>Merckx, V. S. F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycoheterotrophy:+an+introduction.">Mycoheterotrophy: an introduction.</a> Mycoheterotrophy: The Biology of Plants Living on Fungi. , 1-17 (2013).</li><li>Hall, J. L., Hawes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Electron Microscopy of Plant Cells. , (1991).</li></ol>

식물 해부학 및 형태학의 이미지 분석은지하 기관6,40, 종자의 공생 발아에 대한 구조 분석39, 공중 및 생식 구조41에 의해 입증된 바와 같이 목표를 달성하고 진균종속영양 식물과 필수 진균 내생 식물 간의 관계를 이해하는 데 도움이 되는 중요한 잠재력을 가지고 있습니다. . 구조 식물학은 지난 10년 동안 식물 과학?...

식물 형태학 및 해부학을 다루는 식물학의 구조 연구는 전체 유기체를 이해하는 데 기본이며1,2, 식물의 생태, 생리학, 발달 및 진화에 관한 지식을 통합하고 기여하는 데 필수적인 관점을 제공합니다3. 식물 형태학 및 해부학의 방법은 현재 최근에 개발 된 프로토콜, 장비 및 지식뿐만 아니라 100 년 이상 전에 개발 된 것으로 구성됩니다2. 보다 최근의 기술(예: 컨포칼 현미경, X선 마이크로단층 촬영)과 함께 고전적인 방법(예: 광학 현미경)의 지속적인 실행 및 적응은 방법론 개발을 가능하게 하는 이론적 지식이라는 동일한 필수 기반을 가지고 있습니다.
식물 해부학 및 형태학의 주요 도구는 이미지입니다. 이러한 분석이 주관적인 해석에 공간을 제공하는 단순한 관찰이라는 오해에도불구하고2,이 영역의 이미지를 분석하고 이해하려면 적용된 방법 (장비, 분석 유형, 방법 론적 절차), 세포 구성 요소, 조직 화학 및 식물체 (조직 조직 및 기능, 개체 발생, 형태 학적 적응). 다양한 방법을 통해 얻은 이미지를 해석하면 형태와 기능을 상호 연관시키고, 구조의 화학적 구성을 해독하고, 분류군을 설명하고, 식물 병원체에 의한 감염을 이해하고, 기타 그러한 평가를 수행 할 수 있습니다.
균사 종속 영양 (MH) 식물 (즉, 균근 균류 4,5에서 탄소를 얻는 비 광합성 식물)을 연구 할 때 구조적 적응의 현저한 측면, 곰팡이에 의한 조직 식민지화 패턴 및 지하 기관의 형태 해부학은 개발 전략과 영양소의 원천 인균사와의 관계를 계몽 할 수 있습니다. MH 식물의 지하 기관은 일반적으로 토양 곰팡이와의 연관성과 관련된 중요한 적응을 보여 주므로 이러한 해부학 적 및 형태 학적 조사를 수행하는 것이 필수적입니다6. MH 종의 공중 기관은 균근 진균이 아니더라도 내생 식물이 이러한 조직에 존재할 수 있으므로 무시해서는 안됩니다 (개인 관찰, 아직 발표되지 않음).
전체 수명주기 동안 MH 종과 균근 진균 결합의 잘 확립 된 필수 성 외에도7, 모든 난초 종, 심지어 독립 영양 종조차도 자연 환경에서 초기 의무 진균 종속 영양 단계를 가지고 있습니다. 난초의 배아가 미분화되고 배젖이나 자엽이 없기 때문에 곰팡이 파트너 4,8의 영양 지원 없이는 자연 환경에서 발달하고 확립 할 수 없기 때문에 발생합니다. 이를 고려할 때, 공생 발아 프로토콜은 MH 종뿐만 아니라 광합성 난초에도 적용될 수 있으며, 발아 및 프로토 코름 발달에서 난초-곰팡이 특이성을 조사하는 것을 목표로하며, 멸종 위기 종 보존을위한 이니셔티브에 광범위하게 적용되는 방법론 9,10,11.
이 방법 어셈블리에서는 해부학 적 연구 (섹션 1), 표면 분석 및 샘플 선택 (섹션 2), 절편 방법 (자유형 : 섹션 3, 미세 절제술 : 섹션 4, 저온 미세 절제술 : 섹션 5), 염색 및 장착 (섹션 6), 곰팡이 내생 식물의 형광 및 공초점 현미경 (섹션 7), 주사 전자 현미경 (섹션 8), 및 투과 전자 현미경 (섹션 9). 또한 앞서 언급한 이미징 방법을 발아 과정에서 종자, 원생 및 묘목의 곰팡이 집락을 분석하는 데 성공적으로 적용할 수 있기 때문에 난초 종자(MH 및 독립 영양, 섹션 10)에 대한 공생 발아 방법을 설명합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63777/63777fig01.jpg"> 그림 1: 이미징 방법의 개략적 요약. 회로도는 자세히 설명된 프로토콜 단계의 표시를 제공합니다. 약어 : GMA = 글리콜 메타 크릴 레이트, OCT = 최적 절단 온도 화합물, SEM = 주사 전자 현미경. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63777/63777fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
여기에 자세히 설명된 현미경 기술(그림 1)은 샘플 수집, 고정, 탈수, 매립 및 절편과 같은 필수 단계가 선행됩니다. 선택한 기술에 따라 단계가 다양하기 때문에(그림 1), 준비 및 수집 장소로 운송할 고정제, 고정 전에 샘플을 준비하는 방법, 사용할 탈수 공정(섹션 1), 다양한 매립 가능성 및 절단 방법(섹션 4, 5, 및 9). 그림 1 은 아래에 자세히 설명된 각 현미경 기술에 필요한 모든 단계를 순차적으로 요약한 것입니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179124</td>
			<td>(for SEM stubs mounting)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar-agar (AA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1296</td>
			<td>(for seeds germination tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcofluor White Stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18909</td>
			<td>fluorescent dye (detects cellulose)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate Buffer Solution, 0.09M pH 4.8</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2488</td>
			<td>(for toluidine blue O staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive Double-Sided Carbon Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-285-81</td>
			<td>(for SEM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper Grids</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4776</td>
			<td>(for TEM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical-point dryer</td>
			<td>Balzers</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>(= stereomicroscope, any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Entellan</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>107960</td>
			<td>rapid mounting medium for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol, pure (&#8805;99.5%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>459836</td>
			<td>(= ethanol, for dehydration processes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution, 37%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252549</td>
			<td>(for NBF solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td>histological tissue fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin capsules for TEM</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-248-71</td>
			<td>(for resin polymerisation in TEM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin solution, 2% in H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1393</td>
			<td>(dilute for slides preparation - OCT adherence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution, 25%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6257</td>
			<td>(for Karnovsky&#8217;s solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoResin</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>14702231731</td>
			<td>glycol methacrylate (GMA) embedding kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>207772</td>
			<td>(for Lugol solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead(II) nitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>228621</td>
			<td>Pb(NO3)2 (for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR White acrylic resin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9774</td>
			<td>hydrophilic acrylic resin for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lugol solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>62650</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal stubs for specimen mounts</td>
			<td>Rave Scientific</td>
			<td></td>
			<td>(for SEM, different models)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>manual rotary microtome or other model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oatmeal agar (OMA)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>O3506</td>
			<td>(for seeds germination tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Compound, Tissue-Tek</td>
			<td>Sakura Finetek USA</td>
			<td>4583</td>
			<td>embedding medium for frozen tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201030</td>
			<td>OsO4 (for TEM postfixation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793</td>
			<td>sealing thermoplastic film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td>(for Karnovsky&#8217;s solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine solution, 0.1% in H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td>(for slides preparation - OCT adherence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep Slides</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0425</td>
			<td>poly-L-lysine coated glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Molding Cup Trays</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>17177A-3</td>
			<td>(6x8x5 mm, for embbeding samples in GMA resin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Molding Cup Trays</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>17177C-3</td>
			<td>(13x19x5 mm, for embbeding samples in GMA resin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221945</td>
			<td>(for Lugol solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato Dextrose Agar (PDA)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>70139</td>
			<td>(for seeds germination tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscope</td>
			<td>Jeol</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silane [(3-Aminopropyl)triethoxysilane]</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3648</td>
			<td>(for slides preparation - OCT adherence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silane-Prep Slides</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4651</td>
			<td>glass slides coated with silane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel orange, granular</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>10087</td>
			<td>(for dessicating processes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0250</td>
			<td>(for glutaraldehyde-sodium cacodylate buffer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881</td>
			<td>NaOH (for Karnovsky&#8217;s solution preparation and TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>425044</td>
			<td>NaClO (for seeds surface disinfection)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic, anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71640</td>
			<td>Na2HPO4 (for NBF solution and PB preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td>NaH2PO4&#183;H2O (for NBF and PB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sputter coater</td>
			<td>Balzers</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td>C12H22O11 (for cryoprotection and germination test)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan III</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4131</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan IV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>198102</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan Black B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>199664</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(3 mL, any brand, for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter Unit, Millex-GV 0.22 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033R</td>
			<td>PVDF, 33 mm, gamma sterilized (for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tek Bond Super Glue 793</td>
			<td>Tek Bond Saint-Gobain</td>
			<td>78072720018</td>
			<td>liquid cyanoacrylate adhesive, medium viscosity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3260</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Jeol</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triphenyltetrazolium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8877</td>
			<td>(for the tetrazolium test in seeds germination)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1804</td>
			<td>Na3(C6H5O7)&#183;2H2O (for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-607-645</td>
			<td>UO2(CH3COO)2 (for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td>TermoFisher Scientific</td>
			<td>W11261</td>
			<td>fluorescent dye-conjugated lectin (detects sialic acid and N-acetylglucosaminyl residues)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microscopy techniques for interpreting fungal colonization in mycoheterotrophic plants tissues and symbiotic germination of seeds

구조 식물학은 식물의 생태, 생리학, 발달 및 진화를 완전히 이해하는 데 없어서는 안될 관점입니다. 진균 종속 영양 식물 (즉, 곰팡이에서 탄소를 얻는 식물)을 연구 할 때 구조적 적응의 놀라운 측면, 곰팡이에 의한 조직 식민지화 패턴 및 지하 기관의 형태 해부학은 발달 전략과 영양소 공급원 인 균사와의 관계를 계몽 할 수 있습니다. 공생 균류의 또 다른 중요한 역할은 난초 씨앗의 발아와 관련이 있습니다. 모든 난초과과 종은 발아 및 묘목 단계(초기 진균이영양)에서 진균종속영양성이며 심지어 성체기에서 광합성을 하는 종도 있습니다. 난초 씨앗에 영양 매장량이 부족하기 때문에 곰팡이 공생체는 기질을 제공하고 발아를 가능하게하는 데 필수적입니다. 구조적 관점에서 발아 단계를 분석하면 곰팡이와 씨앗의 상호 작용에 관한 중요한 질문에 답할 수 있습니다. 이 기사에서 제안한 것처럼 식물 조직에서 곰팡이 내생식물을 밝히기 위해 다양한 이미징 기술을 적용할 수 있습니다. 식물 장기의 자유형 및 얇은 부분을 염색 한 다음 광학 현미경을 사용하여 관찰 할 수 있습니다. 밀 배아 응집소에 접합 된 형광 색소를 곰팡이에 적용하고 Calcofluor White와 함께 배양하여 컨포칼 현미경에서 식물 세포벽을 강조 표시 할 수 있습니다. 또한, 주사 및 투과 전자 현미경의 방법론은 mycoheterotrophic 난초에 대해 자세히 설명되어 있으며, 관련 식물에 이러한 프로토콜을 적용 할 가능성을 탐구합니다. 난초 종자의 공생 발아 (즉, 균근 진균이있는 경우)는 빛, 공초점 및 전자 현미경으로 분석하기 위해 발아의 여러 단계에서 얻은 구조를 준비 할 수있는 가능성과 함께 프로토콜에 자세히 설명되어 있습니다.

식물 조직을 고정하는 필수 단계에 이어 세포 구성 요소 및 조직의 형태, 부피 및 공간 조직을 고려하여 가능한 한 유사한 세포 구조가 살아있는 상태와 유사합니다16. 화학적 고정 후 샘플에서 이러한 특성을 관찰하십시오(그림 4). 그림 4C-F는 광학 현미경 하에서 적절하게 고정된 샘플을 나타냅니다. 설명된 ?...

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Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds

이 프로토콜은 균근 진균으로 발아된 식물 조직 및 종자에서 진균 집락을 연구하기 위해 주사 및 투과 전자 현미경, 빛, 공초점 및 형광 현미경과 같은 다양한 현미경 기술을 적용하여 진균종속영양 식물 샘플을 수집, 고정 및 유지하기 위한 자세한 절차를 제공하는 것을 목표로 합니다.

균종속영양 식물 조직의 곰팡이 집락화 및 종자의 공생 발아를 해석하기 위한 현미경 기술

Structural botany is an indispensable perspective to fully understand the ecology, physiology, development, and evolution of plants. When researching ...

이 프로토콜은 샘플 수집에서 준비에 이르기까지 진균종속영양 식물의 곰팡이 집락화를 이해하기 위해 적용되는 다양한 현미경 기술을 제시하고 필수 단계를 포함합니다. 이러한 기술은 다양한 진균 종속 영양 식물, 심지어 진균 종속 영양 이외의 식물 재료에도 적용될 수 있습니다. 이 방법은 주로 구조 식물학과 관련이 있으며 균근 상호 작용, 생리학, 생식 생물학, 진화 및 진균 종속 영양 식물의 생태학에 대한 통찰력을 제공 할 수도 있습니다.시작하려면 지하 장기를 손상시키지 않도록주의하면서 식물 기반 주변의 토양을 탐색하여 진균 종속 영양 식물을 수집하십시오. 또한 지하 기관에서 공중 기관이 분리되는 것을 방지하기 위해 땅에서 식물을 당기지 마십시오. 조심스럽게 원예 흙손을 사용하여 공중 구조물 주변을 파고 뿌리, 줄기, 뿌리 줄기 및 저장 기관과 같은 지하 기관을 이러한 구조물을 손상시키지 않고 탐험하십시오.깨지기 쉬운 구조를 보존하기 위해 토양 입자를 제거하고 샘플을 고정하기 전에 수돗물로 이러한 장기를 섬세하게 씻어 나머지 토양 입자를 헹굽니다. 잎 깔짚과 관련된 Mycoheterotrophic 식물은 특별한주의를 요구합니다. 따라서 연결된 구조물에서 끌어 당기지 않고 균사를 통해 분해 물질에 연결된 섬세한 기관을 조심스럽게 수집하십시오.이러한 연결이있는 구조물을 보존하고 분석을 위해 깔짚을 수집하십시오. 투과 전자 현미경 분석을 위해, 글루타르알데히드 나트륨 카코딜레이트 완충액 한 방울 안에 있는 3 내지 4-밀리미터 두께의 샘플을 1 내지 2-밀리미터 두께의 더 작은 섹션으로 분할한다. 드롭 외부의 절단면을 버립니다.식물 수집 직후 수집 장소에서 고정 과정을 수행하십시오. 첨가제 고정물이므로 시료의 부피보다 10배 이상 큰 고정제 부피의 수집 튜브로 섹션을 즉시 옮깁니다. 장기의 표면 균사, 특히 지하 균사 및 잎 깔짚과 접촉하는 균사의 표면 분석.해부 현미경으로 신선하거나 고정된 물질을 7.5배 이상의 배율로 관찰합니다. 표면 균사와 rhizomorphs에 의해 안내되는 관심 영역을 검색하십시오. 표면성 근형의 영역을 포함하는 샘플을 선택하여 뿌리와 줄기의 피질 세포 내에서 펠로톤과 균사 코일을 시각화할 수 있습니다.텍스트 원고에 설명 된대로 0.1 몰 인산염 완충액에 밀 배아 응집소 형광 색소 접합체 밀리리터 당 0.2 밀리그램과 1 % 칼코 플루오르 백색 용액을 준비하십시오. 이제 유리 슬라이드의 섹션을 밀 배아 응집소 형광 색소 접합체 용액으로 30 분 동안 적절하게 덮어서 배양하십시오. 배양 후, 0.1 몰 인산염 완충액으로 섹션을 세척하고 장착 매체로서 칼코 플루오르 용액에서 배양한다.그런 다음 슬라이드 위에 커버 슬립을 놓고 표시된 필터를 사용하여 컨포칼 또는 형광 현미경으로 관찰합니다. 샘플을 고정하고 탈수를 수행하고 70 % 에탄올에 보관 한 후 날카 롭고 새로운 면도날을 사용하여 일방 통행으로 절단하여 주사 전자 현미경 분석을 위해 원하는 표면을 노출시킵니다. 필요한 경우 실체 현미경을 사용하여 샘플을 선택하고 샘플 크기를 결정하는 동안 금속 스터브 영역을 고려하십시오.또한, 에탄올 계열의 샘플을 탈수시킨다. 작고 섬세한 샘플은 각 농도에서 30분 동안 유지하고 크고 밀도가 높은 샘플은 1시간 동안 유지합니다. 그런 다음 티슈 페이퍼를 사용하여 작은 봉투를 접어 다음 단계를 위해 샘플을 구성합니다.더 큰 샘플은 봉투 없이 처리할 수 있습니다. 연필을 사용하여 봉투에 라벨을 붙이고 샘플 로그를 보관하십시오. 조심스럽게 붓을 사용하여 봉투 안에 샘플을 넣으십시오.이제이 샘플을 절대 에탄올에 보관하십시오. 표준 작동 절차에 따라 임계점 건조기를 작동하여 임계점 건조를 즉시 진행하십시오. 이를 위해 시료 홀더의 무수 에탄올에 시료를 넣고 임계점 건조기의 압력 챔버 안에 두십시오.중간 유체는 임계 이산화탄소 지점에서 전이 유체에 용해되어 샘플을 건조시킵니다. 대기 습도의 재흡수는 샘플을 파괴할 수 있으므로 임계점 건조 직후 건조 용기에 보관하십시오. 금속 스터브에 샘플을 장착하기 전에 장갑을 끼고 스텁을 조작하십시오.아세톤에 5 분 동안 담그면 지방이 제거되고 건조됩니다. 실체 현미경으로 전도성 양면 탄소 접착 테이프를 사용하여 샘플을 스터브에 고정하고 위치를 지정합니다. 위의 사이트는 주사 전자 현미경 이미지에서 가능한 유일한 관점입니다.샘플을 조작하려면 미세 포인트 핀셋을 사용하십시오. 핀셋으로 만진 샘플 부품은 일반적으로 손상됩니다. 따라서 조심하고 관심 영역에서 멀리 떨어진 부분을 만지십시오.실리카겔로 밀봉 된 페트리 접시에 샘플이있는 스텁을 유지하십시오. 다음으로, 표준 작동 절차에 따라 불활성 가스의 저압 분위기에서 샘플 표면에 금 또는 백금 층을 증착하기 위해 스퍼터 코팅을 진행합니다. 코팅 두께는 샘플의 지형에 따라 다르며 일반적으로 15-40 나노 미터입니다.마지막으로, 코팅된 스터브를 실리카겔이 습도를 유지하는 밀봉된 페트리 접시에 보관합니다. 샘플은 몇 주 동안 이런 식으로 보관할 수 있습니다. 주사 전자 현미경을 사용하여 이러한 샘플을 분석하십시오.주사 전자 현미경 검사 중에 전자빔이 진공 내 샘플에 부딪히고 이러한 상호 작용으로 인한 신호 방출은 이미지로 해석됩니다. 씨앗의 공생 발아에 사용되는 용액과 재료가 멸균되었는지 확인하십시오. 오염을 피하기 위해.섭씨 121도에서 20분 동안 오토클레이브하여 시작합니다. 층류 후드에서 과일과 씨앗을 2% 활성 염소를 포함하는 차아염소산나트륨 용액에 담그어 표면적으로 소독합니다. 얇고 깨지기 쉬운 씨앗은 1:1 희석된 차아염소산나트륨 용액에 담글 수 있습니다.소독 후 종자를 xerographic 직물을 사용하여 여과하여 회복시킵니다. 발아 시험을 진행하기 전에 고압 멸균 증류수에서 과일과 씨앗을 세 번 씻어 차아 염소산염 용액을 제거하십시오. 필요한 경우 섭씨 4 도의 실리카겔이 함유 된 유리 플라스크 내부의 여과지 봉투에 보관하고 플라스크를 밀폐하고 달라 붙는 필름으로 밀봉 한 다음 마지막 세척에서 감자 포도당 한천으로 몇 방울의 물을 옮겨 세척 과정의 효과를 평가하십시오.난초 씨앗의 공생 발아를 위해, 오트밀 한천 배양 배지가 들어있는 페트리 접시에 놓인 1-2 센티미터의 오토 클레이브 여과지 디스크 위에 씨앗을 배양하십시오. 이제 페트리 접시의 중앙에 선택한 분리 된 균체에서 균사체가 들어있는 배양 배지 조각을 접종하십시오. 페트리 접시를 달라 붙는 필름으로 밀봉하고 곰팡이 성장에 따라 섭씨 25도 또는 실온의 어둠 속에서 배양하십시오.발아 테스트를위한 음성 대조군으로 씨앗과 곰팡이 접종없이 일부 요리를 준비하십시오. 정량적 및 정성적 데이터를 수집하고 원형과 묘목을 촬영하여 매주 발아 결과를 분석합니다. rhizomorphs는 일반적으로 어둡고 신발 끈과 같은 구조로 쉽게 인식 할 수 있습니다.10 마이크로 미터보다 두꺼운 섹션을 얻는 자유형 또는 기타 방법은 펠로톤을 더 잘 표현하고 식민지화의 곰팡이 패턴에 대한보다 대표적인 이미지를 제공 할 수 있습니다. 자유형 섹션은 또한 더 높은 증폭에서 균사 분석에 적합할 수 있습니다. 그러나 세부 사항은 더 얇은 섹션에서 더 잘 달성됩니다.목부 요소의 2 차 세포벽은 톨루이딘이 획득 한 밝은 색으로 쉽게 식별 할 수 있습니다. 한편, 일차 세포벽으로만 구성된 체관 요소는 더 얇고 어두운 세포벽으로 식별됩니다. 자가형광에 의한 인공물은 글리콜 메타크릴레이트 수지 절편에서 볼 수 있다.이러한 인공물은 일반적으로 형광 색소 농도와 관련이 있으며 완충액으로 샘플을 더 많이 세척하여 피할 수 있습니다. 뿌리의 자유형 부분은 내부 및 외부 균사를 보여줍니다. 동일한 기관은 표면에 풍부한 rhizomorphs와 개별 균사가있는 주사 전자 현미경으로 볼 수 있습니다.대부분의 난초 종은 접종 된 곰팡이에 감염된 후 몇 주 이내에 또는 거의 한 달 이상 발아합니다. 주사 전자 현미경의 빛은 생식 생물학 또는 진균 종속 영양 식물을 조사하기 위해 꽃, 과일 및 씨앗에 적용될 수 있습니다. 씨앗의 공생 발아는 독립 영양 난초에서도 테스트 할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

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연구

생물학

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