Name: microscopy techniques for interpreting fungal colonization in mycoheterotrophic plants tissues and symbiotic germination of seeds
Uploaded: 2022-05-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds at JoVE.com

Forfatterne takker finansiering fra FAEPEX og FAPESP (2015/26479-6). MPP takker Capes for hans mastergradsstipend (prosess 88887.600591/2021-00) og CNPq. JLSM takker CNPq for produktivitetstilskudd (303664/2020-7). Forfatterne takker også tilgangen til utstyr og assistanse fra LME (Laboratory of Electron Microscopy - IB / Unicamp), INFABiC (National Institute of Science and Technology on Photonics Applied to Cell Biology - Unicamp) og LaBiVasc (Laboratory of Vascular Biology - DBEF / IB / Unicamp); LAMEB (UFSC) og Eliana de Medeiros Oliveira (UFSC) for bidrag til kryobeskyttelsesprotokollen; LME for bidrag til TEM-protokollen.

1. Innsamling, fiksering og vedlikehold av prøver
MERK: Fullt MH-planter kan vanligvis finnes i den mørke skogen under 12,13, hovedsakelig i fuktige og søppelrike områder, mens delvis MH-planter finnes i mer åpne skoger 12,13. MH-planter har vanligvis velutviklede underjordiske organer i en rekke former og størrelser.
<ol><li>Når du samler MH-arter, ut...

<ol>
	<li>Evert, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Esau&#8217;s Plant Anatomy: Meristems, Cells, and Tissues of the Plant Body: Their Structure, Function, and Development. , (2006).</li><li>Yeung, E. C. T., Stasolla, C., Sumner, M. J., Huang, B. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plant Microtechniques and Protocols. , (2015).</li><li>Sokoloff, D. D., Jura-Morawiec, J., Zoric, L., Fay, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+anatomy:+at+the+heart+of+modern+botany.">Plant anatomy: at the heart of modern botany.</a> Botanical Journal of the Linnean Society. 195 (3), 249-253 (2021).</li><li>Leake, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+myco-heterotrophic+(&#8216;saprophytic&#8217;)+plants.">The biology of myco-heterotrophic (&#8216;saprophytic&#8217;) plants.</a> New Phytologist. 127 (2), 171-216 (1994).</li><li>Bidartondo, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolutionary+ecology+of+myco-heterotrophy.">The evolutionary ecology of myco-heterotrophy.</a> New Phytologist. 167 (2), 335-352 (2005).</li><li>Imhof, S., Massicotte, H. B., Melville, L. H., Peterson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subterranean+morphology+and+mycorrhizal+structures.">Subterranean morphology and mycorrhizal structures.</a> Mycoheterotrophy. , 157-214 (2013).</li><li>Rasmussen, H. N., Rasmussen, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchid+mycorrhiza:+implications+of+a+mycophagous+life+style.">Orchid mycorrhiza: implications of a mycophagous life style.</a> Oikos. 118 (3), 334-345 (2009).</li><li>Rasmussen, H. N., Dixon, K. W., Jers&#225;kov&#225;, J., T&#283;&#353;itelov&#225;, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+and+seedling+establishment+in+orchids:+a+complex+of+requirements.">Germination and seedling establishment in orchids: a complex of requirements.</a> Annals of Botany. 116 (3), 391-402 (2015).</li><li>Zettler, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terrestrial+orchid+conservation+by+symbiotic+seed+germination:+techniques+and+perspectives.">Terrestrial orchid conservation by symbiotic seed germination: techniques and perspectives.</a> Selbyana. 18 (2), 188-194 (1997).</li><li>Stewart, S. L., Kane, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symbiotic+seed+germination+and+evidence+for+in+vitro+mycobiont+specificity+in+Spiranthes+brevilabris+(Orchidaceae)+and+its+implications+for+species-level+conservation.">Symbiotic seed germination and evidence for in vitro mycobiont specificity in Spiranthes brevilabris (Orchidaceae) and its implications for species-level conservation.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Plant. 43 (3), 178-186 (2007).</li><li>Zhao, D. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchid+reintroduction+based+on+seed+germination-promoting+mycorrhizal+fungi+derived+from+protocorms+or+seedlings.">Orchid reintroduction based on seed germination-promoting mycorrhizal fungi derived from protocorms or seedlings.</a> Frontiers in Plant Science. 12, 701152 (2021).</li><li>Selosse, M. A., Roy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+plants+that+feed+on+fungi:+facts+and+questions+about+mixotrophy.">Green plants that feed on fungi: facts and questions about mixotrophy.</a> Trends in Plant Science. 14 (2), 64-70 (2009).</li><li>Merckx, V. S. F. T., Mennes, C. B., Peay, K. G., Geml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+diversification.">Evolution and diversification.</a> Mycoheterotrophy: The Biology of Plants Living on Fungi. , 215-244 (2013).</li><li>Boon, M. E., Drijver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routine+Cytological+Staining+Techniques:+Theoretical+Background+and+Practice.">Routine Cytological Staining Techniques: Theoretical Background and Practice.</a> Macmillan International Higher Education. , (1986).</li><li>Karnovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+formaldehyde-glutaraldehyde+fixative+of+high+osmolality+for+use+in+electron+microscopy.">A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 27 (2), 137-138 (1964).</li><li>Hayat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fixation for Electron Microscopy. , (1981).</li><li>Roland, J. C., Vian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+preparation+and+staining+of+thin+sections.">General preparation and staining of thin sections.</a> Electron Microscopy of Plant Cells. 1, 675 (1991).</li><li>Gerrits, P. O., Horobin, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycol+methacrylate+embedding+for+light+microscopy:+basic+principles+and+trouble-shooting.">Glycol methacrylate embedding for light microscopy: basic principles and trouble-shooting.</a> Journal of Histotechnology. 19 (4), 297-311 (1996).</li><li>Zhang, Z., Niu, L., Chen, X., Xu, X., Ru, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+plant+cryosection.">Improvement of plant cryosection.</a> Frontiers in Biology. 7 (4), 374-377 (2012).</li><li>Bene&#352;, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+media+improving+freeze-sectioning+of+plant+material.">On the media improving freeze-sectioning of plant material.</a> Biologia Plantarum. 15 (1), 50-56 (1973).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+slides+and+coverslips+for+microscopy.">Preparation of slides and coverslips for microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (5), (2008).</li><li>Sakai, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+method+for+differential+staining+of+paraffin+embedded+plant+material+using+toluidine+blue+O.">Simple method for differential staining of paraffin embedded plant material using toluidine blue O.</a> Stain Technology. 48 (5), 247-249 (1973).</li><li>O&#8217;Brien, T., Feder, N., McCully, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polychromatic+staining+of+plant+cell+walls+by+toluidine+blue+O.">Polychromatic staining of plant cell walls by toluidine blue O.</a> Protoplasma. 59 (2), 368-373 (1964).</li><li>Ventrella, M. C., Almeida, A. L., Nery, L. A., Coelho, V. P. d. e. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#233;todos+Histoqu&#237;micos+Aplicados+&#224;s+Sementes.">M&#233;todos Histoqu&#237;micos Aplicados &#224;s Sementes.</a> Universidade Federal de Vi&#231;osa. , (2013).</li><li>Pearse, A. G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histochemistry, Theoretical and Applied. , (1960).</li><li>Andrade-Linares, D. R., Franken, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+endophytes+in+plant+roots:+taxonomy,+colonization+patterns,+and+functions.">Fungal endophytes in plant roots: taxonomy, colonization patterns, and functions.</a> Symbiotic Endophytes. , 311-334 (2013).</li><li>Wymer, C. L., Beven, A. F., Boudonck, K., Lloyd, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy+of+plant+cells.">Confocal microscopy of plant cells.</a> Confocal Microscopy Methods and Protocols. , 103-130 (1999).</li><li>Marques, J. P. R., Soares, M. K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+de+T&#233;cnicas+Aplicadas+&#224;+Histopatologia+Vegetal.">Manual de T&#233;cnicas Aplicadas &#224; Histopatologia Vegetal.</a> FEALQ. , (2021).</li><li>Navarro, B. L., Marques, J. P. R., Appezzato-da-Gl&#243;ria, B., Sp&#243;sito, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histopathology+of+Phakopsora+euvitis+on+Vitis+vinifera.">Histopathology of Phakopsora euvitis on Vitis vinifera.</a> European Journal of Plant Pathology. 154 (4), 1185-1193 (2019).</li><li>Marques, J. P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugarcane+cell+wall-associated+defense+responses+to+infection+by+Sporisorium+scitamineum.">Sugarcane cell wall-associated defense responses to infection by Sporisorium scitamineum.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 698 (2018).</li><li>Jeffree, C. E., Read, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ambient-and+low-temperature+scanning+electron+microscopy.">Ambient-and low-temperature scanning electron microscopy.</a> Electron Microscopy of Plant Cells. , 313-413 (1991).</li><li>Bozzola, J. J., Russell, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Electron Microscopy: Principles and Techniques for Biologists. , (1999).</li><li>Murray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+transmission+and+scanning+electron+microscopy.">Basic transmission and scanning electron microscopy.</a> Introduction to electron Microscopy for Biologists. , 3-18 (2008).</li><li>. Glossary of TEM terms Available from: <a target="_blank" href="https://www.jeol.co.jp/en/words/emterms/">https://www.jeol.co.jp/en/words/emterms/</a> (2021)</li><li>Seaton, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchid+seed+and+pollen:+a+toolkit+for+long-term+storage,+viability+assessment+and+conservation.">Orchid seed and pollen: a toolkit for long-term storage, viability assessment and conservation.</a> Orchid Propagation: From Laboratories to Greenhouses&#8212;Methods and Protocols. , 71-98 (2018).</li><li>Otero, J. T., Ackerman, J. D., Bayman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+mycorrhizal+preferences+between+two+tropical+orchids.">Differences in mycorrhizal preferences between two tropical orchids.</a> Molecular Ecology. 13 (8), 2393-2404 (2004).</li><li>Koch, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marasmioid+rhizomorphs+in+bird+nests:+Species+diversity,+functional+specificity,+and+new+species+from+the+tropics.">Marasmioid rhizomorphs in bird nests: Species diversity, functional specificity, and new species from the tropics.</a> Mycologia. 112 (6), 1086-1103 (2020).</li><li>Webster, J., Weber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Introduction to Fungi. , (2007).</li><li>Sisti, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+non-mycorrhizal+fungi+in+germination+of+the+mycoheterotrophic+orchid+Pogoniopsis+schenckii+Cogn.">The role of non-mycorrhizal fungi in germination of the mycoheterotrophic orchid Pogoniopsis schenckii Cogn.</a> Frontiers in Plant Science. 10, 1589 (2019).</li><li>Martos, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+recruitment+of+saprotrophic+fungi+as+mycorrhizal+partners+by+tropical+achlorophyllous+orchids.">Independent recruitment of saprotrophic fungi as mycorrhizal partners by tropical achlorophyllous orchids.</a> New Phytologist. 184 (3), 668-681 (2009).</li><li>Alves, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+development+and+genetic+structure+of+the+mycoheterotrophic+orchid+Pogoniopsis+schenckii+Cogn.">Reproductive development and genetic structure of the mycoheterotrophic orchid Pogoniopsis schenckii Cogn.</a> BMC Plant Biology. 21 (1), 332 (2021).</li><li>Merckx, V. S. F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycoheterotrophy:+an+introduction.">Mycoheterotrophy: an introduction.</a> Mycoheterotrophy: The Biology of Plants Living on Fungi. , 1-17 (2013).</li><li>Hall, J. L., Hawes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Electron Microscopy of Plant Cells. , (1991).</li></ol>

Bildeanalyser i planteanatomi og morfologi har et viktig potensial for å oppfylle mål og bidra til å forstå forholdet mellom mykoheterotrofe planter og deres uunnværlige soppendofytter, som demonstrert ved studier av underjordiske organer 6,40, strukturelle analyser av symbiotisk spiring av frø39, og luft- og reproduktive strukturer 41 . Strukturell botanikk, til tross for å ha mistet sin prestisje og plass t...

Strukturforskning i botanikk, som dekker plantemorfologi og anatomi, er grunnleggende for å forstå hele organismen1,2, og gir uunnværlige perspektiver for å integrere og bidra til kunnskap om økologi, fysiologi, utvikling og evolusjon av planter3. Metoder i plantemorfologi og anatomi omfatter i dag protokoller, utstyr og kunnskap utviklet nylig så vel som for mer enn et århundre siden2. Den kontinuerlige utførelsen og tilpasningen av klassiske metoder (f.eks. Lysmikroskopi) sammen med nyere teknikker (f.eks. Konfokalmikroskopi, røntgenmikrotomografi) har samme viktige grunnlag: teoretisk kunnskap som muliggjør utvikling av en metodikk.
Hovedverktøyet i planteanatomi og morfologi er bildet. Til tross for misforståelsen om at slike analyser er enkle observasjoner, gir plass til subjektive tolkninger2, krever analyse og forståelse av bilder på dette området kunnskap om metodene som brukes (utstyret, type analyse, metodologiske prosedyrer), cellekomponenter, histokjemi og plantekroppen (vevsorganisasjon og funksjon, ontogeni, morfologiske tilpasninger). Tolkning av bildene oppnådd ved hjelp av en rekke metoder kan føre til korrelerende form og funksjon, dechiffrere den kjemiske sammensetningen av en struktur, bekrefte i å beskrive taxa, forstå infeksjoner av fytopatogener og andre slike vurderinger.
Når man forsker på mykoheterotrofe (MH) planter (dvs. ikke-fotosyntetiske planter som får karbon fra mykorrhizal sopp4,5), kan bemerkelsesverdige aspekter av deres strukturelle tilpasninger, mønstrene for vevkolonisering av sopp og morfoanatomi av underjordiske organer opplyse deres utviklingsstrategier og forhold til hyfer, som er kilden til næringsstoffer. De underjordiske organene til MH-planter viser vanligvis viktige tilpasninger knyttet til deres tilknytning til jordsvamp, derfor er det viktig å utføre disse anatomiske og morfologiske undersøkelsene6. MH-arters luftorganer bør ikke ignoreres, da endofytter også kan være tilstede i disse vevene, selv om de ikke er mykorrhizale sopp (personlige observasjoner, ikke publisert ennå).
I tillegg til den veletablerte essensen av mykorrhizal soppforening med MH-arter i løpet av hele livssyklusen7, har hver orkidéart, selv de autotrofe, et innledende obligatorisk mykoheterotrofisk stadium i naturlige miljøer. Det oppstår fordi orkideenes embryo er utifferentiert og mangler endosperm eller cotyledoner, og dermed ikke er i stand til å utvikle og etablere seg i naturlige miljøer uten næringsstøtte fra sopppartnere 4,8. Tatt i betraktning at symbiotiske spiringsprotokoller kan brukes ikke bare på MH-arter, men også på fotosyntetiserende orkideer, med sikte på å undersøke orkidé-soppspesifisitet i spiring og protocormutvikling, en enormt anvendt metodikk i initiativer for bevaring av truede arter 9,10,11.
I denne metodesamlingen beskriver vi viktige trinn involvert i innsamling, fiksering og lagring av MH-planteprøver for anatomiske studier (seksjon 1), overflateanalyse og prøvevalg (seksjon 2), seksjoneringsmetoder (frihånd: seksjon 3, mikrotomi: seksjon 4, kryomikrotomi: seksjon 5), farging og montering (seksjon 6), fluorescens og konfokal mikroskopi av soppendofytter (seksjon 7), skanning elektronmikroskopi (seksjon 8), og transmisjonselektronmikroskopi (pkt. 9). I tillegg beskriver vi en symbiotisk spiringsmetode for orkidéfrø (MH og autotrofisk, seksjon 10), da de tidligere nevnte avbildningsmetodene med hell kan brukes til å analysere soppkolonisering av frø, protokormer og frøplanter i spiringsprosessen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63777/63777fig01.jpg"> Figur 1: Skjematisk oppsummering av bildemetoder. Skjemaene gir indikasjoner på protokolltrinn der de er detaljerte. Forkortelser: GMA = glykolmetakrylat, OCT = optimal skjæretemperaturforbindelse, SEM = skanningelektronmikroskopi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63777/63777fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
Mikroskopiteknikkene beskrevet her i detalj (figur 1) innledes av følgende viktige trinn: innsamling, festing, dehydrering, innebygging og seksjonering av prøver. Siden trinnene er variable (figur 1) avhengig av valgt(e) teknikk(er), er det viktig å tenke fremover, med tanke på fikseringsmidlene som skal klargjøres og transporteres til innsamlingsstedet, hvordan prøvene må klargjøres før fiksering, dehydreringsprosessene som skal brukes (avsnitt 1), og ulike innbyggingsmuligheter og snittingsmetoder (§§ 4, 5, og 9). Figur 1 oppsummerer sekvensielt alle trinnene som kreves for hver mikroskopiteknikk grundig beskrevet nedenfor.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179124</td>
			<td>(for SEM stubs mounting)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar-agar (AA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1296</td>
			<td>(for seeds germination tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcofluor White Stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18909</td>
			<td>fluorescent dye (detects cellulose)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate Buffer Solution, 0.09M pH 4.8</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2488</td>
			<td>(for toluidine blue O staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive Double-Sided Carbon Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-285-81</td>
			<td>(for SEM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper Grids</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4776</td>
			<td>(for TEM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical-point dryer</td>
			<td>Balzers</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>(= stereomicroscope, any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Entellan</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>107960</td>
			<td>rapid mounting medium for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol, pure (&#8805;99.5%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>459836</td>
			<td>(= ethanol, for dehydration processes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution, 37%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252549</td>
			<td>(for NBF solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td>histological tissue fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin capsules for TEM</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-248-71</td>
			<td>(for resin polymerisation in TEM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin solution, 2% in H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1393</td>
			<td>(dilute for slides preparation - OCT adherence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution, 25%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6257</td>
			<td>(for Karnovsky&#8217;s solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoResin</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>14702231731</td>
			<td>glycol methacrylate (GMA) embedding kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>207772</td>
			<td>(for Lugol solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead(II) nitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>228621</td>
			<td>Pb(NO3)2 (for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR White acrylic resin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9774</td>
			<td>hydrophilic acrylic resin for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lugol solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>62650</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal stubs for specimen mounts</td>
			<td>Rave Scientific</td>
			<td></td>
			<td>(for SEM, different models)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>manual rotary microtome or other model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oatmeal agar (OMA)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>O3506</td>
			<td>(for seeds germination tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Compound, Tissue-Tek</td>
			<td>Sakura Finetek USA</td>
			<td>4583</td>
			<td>embedding medium for frozen tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201030</td>
			<td>OsO4 (for TEM postfixation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793</td>
			<td>sealing thermoplastic film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td>(for Karnovsky&#8217;s solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine solution, 0.1% in H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td>(for slides preparation - OCT adherence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep Slides</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0425</td>
			<td>poly-L-lysine coated glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Molding Cup Trays</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>17177A-3</td>
			<td>(6x8x5 mm, for embbeding samples in GMA resin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Molding Cup Trays</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>17177C-3</td>
			<td>(13x19x5 mm, for embbeding samples in GMA resin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221945</td>
			<td>(for Lugol solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato Dextrose Agar (PDA)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>70139</td>
			<td>(for seeds germination tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscope</td>
			<td>Jeol</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silane [(3-Aminopropyl)triethoxysilane]</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3648</td>
			<td>(for slides preparation - OCT adherence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silane-Prep Slides</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4651</td>
			<td>glass slides coated with silane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel orange, granular</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>10087</td>
			<td>(for dessicating processes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0250</td>
			<td>(for glutaraldehyde-sodium cacodylate buffer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881</td>
			<td>NaOH (for Karnovsky&#8217;s solution preparation and TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>425044</td>
			<td>NaClO (for seeds surface disinfection)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic, anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71640</td>
			<td>Na2HPO4 (for NBF solution and PB preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td>NaH2PO4&#183;H2O (for NBF and PB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sputter coater</td>
			<td>Balzers</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td>C12H22O11 (for cryoprotection and germination test)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan III</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4131</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan IV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>198102</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan Black B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>199664</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(3 mL, any brand, for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter Unit, Millex-GV 0.22 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033R</td>
			<td>PVDF, 33 mm, gamma sterilized (for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tek Bond Super Glue 793</td>
			<td>Tek Bond Saint-Gobain</td>
			<td>78072720018</td>
			<td>liquid cyanoacrylate adhesive, medium viscosity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3260</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Jeol</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triphenyltetrazolium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8877</td>
			<td>(for the tetrazolium test in seeds germination)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1804</td>
			<td>Na3(C6H5O7)&#183;2H2O (for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-607-645</td>
			<td>UO2(CH3COO)2 (for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td>TermoFisher Scientific</td>
			<td>W11261</td>
			<td>fluorescent dye-conjugated lectin (detects sialic acid and N-acetylglucosaminyl residues)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microscopy techniques for interpreting fungal colonization in mycoheterotrophic plants tissues and symbiotic germination of seeds

Strukturell botanikk er et uunnværlig perspektiv for å forstå økologi, fysiologi, utvikling og evolusjon av planter fullt ut. Når man forsker på mykoheterotrofe planter (dvs. planter som får karbon fra sopp), kan bemerkelsesverdige aspekter av deres strukturelle tilpasninger, mønstrene for vevkolonisering av sopp og morfoanatomien til underjordiske organer opplyse deres utviklingsstrategier og deres forhold til hyfer, kilden til næringsstoffer. En annen viktig rolle for symbiotiske sopp er relatert til spiring av orkidéfrø; alle Orchidaceae-arter er mykoheterotrofe under spiring og frøplantestadium (innledende mykoheterotrofi), selv de som fotosyntetiserer i voksne stadier. På grunn av mangel på næringsreserver i orkidéfrø, er soppsymbionter avgjørende for å gi substrater og muliggjøre spiring. Å analysere spiringsstadier ved strukturelle perspektiver kan også svare på viktige spørsmål angående soppens interaksjon med frøene. Ulike bildebehandlingsteknikker kan brukes til å avdekke soppendofytter i plantevev, som foreslått i denne artikkelen. Frihånd og tynne deler av planteorganer kan farges og deretter observeres ved hjelp av lysmikroskopi. En fluorokrom konjugert til hvetekimagglutinin kan påføres sopp og inkuberes med Calcofluor White for å markere plantecellevegger i konfokalmikroskopi. I tillegg er metodene for skanning og transmisjonselektronmikroskopi detaljert for mykoheterotrofe orkideer, og mulighetene for å anvende slike protokoller i relaterte planter blir utforsket. Symbiotisk spiring av orkidéfrø (dvs. i nærvær av mykorrhizal sopp) er beskrevet i protokollen i detalj, sammen med muligheter for å forberede strukturer oppnådd fra forskjellige stadier av spiring for analyser med lys, konfokal og elektronmikroskopi.

Etter de essensielle stadiene av å fikse plantevev gir cellulære strukturer så lik levende tilstand som mulig, med tanke på morfologi, volum og romlig organisering av cellulære komponenter og vev16. Observer slike egenskaper i prøvene etter kjemisk fiksering (figur 4). Figur 4C-F representerer tilstrekkelig faste prøver under lysmikroskopi. Å følge fikseringsprosedyrene som er beskrevet og skaffe...

Watch this Scientific Journal Video about Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds at JoVE.com

Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds

Denne protokollen tar sikte på å gi detaljerte prosedyrer for innsamling, fiksering og vedlikehold av mykoheterotrofe planteprøver, ved å bruke forskjellige mikroskopiteknikker som skanning og transmisjonselektronmikroskopi, lys, konfokal og fluorescensmikroskopi for å studere soppkolonisering i plantevev og frø spiret med mykorrhizal sopp.

Mikroskopi teknikker for tolkning av soppkolonisering i mykoheterotrofe plantevev og symbiotisk spiring av frø

Structural botany is an indispensable perspective to fully understand the ecology, physiology, development, and evolution of plants. When researching ...

Protokollen presenterer ulike mikroskopiteknikker som brukes til å forstå soppkoloniseringen i mykoheterotrofe planter, fra innsamling til å forberede prøver i detalj og inkludere viktige trinn. Slike teknikker kan brukes på forskjellige mykoheterotrofe planter, og til og med til en plantes materialer annet enn mykoheterotrofi. Denne metoden er hovedsakelig relatert til strukturell botanikk og kan også gi innsikt i mykorrhiza-interaksjoner, fysiologi, reproduktiv biologi, evolusjon og økologi av mykoheterotrofe planter.For å begynne med, samle de mykoheterotrofe plantene ved å utforske jorda rundt plantebasen, pass på at du ikke skader de underjordiske organene. Unngå også å trekke plantene fra bakken for å forhindre at luftorganene kobles fra de underjordiske. Forsiktig graver du rundt luftstrukturer ved hjelp av en hagesparkel mens du utforsker de underjordiske organene som røtter, stengler, rhizomer og lagringsorganer uten å skade disse strukturene.Fjern jordpartikler for å bevare skjøre strukturer og vask disse organene forsiktig med vann fra springen for å skylle av de gjenværende jordpartiklene før du fikser prøvene. Mykoheterotrofe planter assosiert med bladkull krever ekstra oppmerksomhet. Samle derfor nøye de delikate organene som er koblet til det nedbrytende materialet gjennom hyferen uten å trekke dem fra de tilkoblede strukturene.Bevar strukturer med slike forbindelser og samle søppel for analyse. For transmisjonselektronmikroskopianalyse, seksjon de 3 til 4 millimeter tykke prøvene inne i en dråpe glutaraldehydnatriumkakodylatbuffer i mindre seksjoner med 1 til 2 millimeter tykkelse. Kast de kuttede kantene utenfor dråpen.Sørg for å gjennomføre fikseringsprosessen på innsamlingsstedet umiddelbart etter innsamling av planter. Overfør umiddelbart seksjonene til et oppsamlingsrør med et fikseringsvolum som er mer enn 10 ganger større enn volumet av prøvene, da det er et additiv fikseringsmiddel. For overflateanalyse av overfladiske hyfer i organene, spesielt i underjordiske og de som er i kontakt med bladkull.Observer friskt eller fast materiale under dissekeringsmikroskopet ved en forstørrelse på 7,5x eller høyere. Søk etter interesseområdene guidet av overfladiske hyfer og rhizomorphs. Velg prøvene som inneholder områder av overfladiske rhizomorfer, da disse kan seksjoneres for å visualisere pelotoner og hyferspoler i kortikale celler i røtter og stengler.Forbered 0,2 milligram per milliliter hvetekimagglutinininfluorokromkonjugat og 1% kalkofluorhvite løsninger i 0,1 molar fosfatbuffer som beskrevet i tekstmanuskriptet. Inkuber nå seksjonene på glassglass ved å dekke dem ordentlig med hvetekimagglutinininfluorokrom konjugatløsning i 30 minutter. Etter inkubasjonen, vask seksjonene med 0,1 molar fosfatbuffer og inkuber dem i kalkofluoroppløsningen som et monteringsmedium.Deretter plasserer du dekselsklier på lysbildene og observerer det under et konfokalt eller fluorescenslysmikroskop ved hjelp av de angitte filtrene. Etter å ha fikset prøvene, utført dehydrering og lagret den i 70% etanol, utsett ønsket overflate for skanning av elektronmikroskopianalyse ved å bruke et skarpt og nytt barberblad for å gjøre kutt med en enveisbevegelse. Bruk om nødvendig et stereomikroskop for å velge prøvene og vurdere metallstubbområdet mens du bestemmer prøvestørrelsene.Videre dehydrerer prøvene i en etanolisk serie. Oppretthold små og delikate prøver i 30 minutter i hver konsentrasjon og større og tettere prøver i 1 time. Deretter bretter du små konvolutter ved hjelp av silkepapir for å organisere prøver for de neste trinnene.Større prøver kan håndteres uten konvolutt. Merk konvoluttene med en blyant og hold en logg over prøvene. Legg prøvene forsiktig i konvoluttene ved hjelp av en pensel.Nå, hold disse prøvene i absolutt etanol. Fortsett umiddelbart med tørking av kritiske punkter ved å bruke en tørketrommel med kritiske punkter i henhold til standard driftsprosedyrer. For dette, plasser prøvene i absolutt etanol i en prøveholder og plasser den inne i trykkammerens trykkammer for kritisk punkt.Mellomvæsken oppløses i overgangsvæsken ved det kritiske karbondioksidpunktet, og tørker dermed prøvene. Siden reabsorpsjon av atmosfærisk fuktighet kan ødelegge prøvene, må du oppbevare dem i en uttørkingsbeholder umiddelbart etter tørking av kritisk punkt. Før du monterer prøvene på metallstubber, må du ta på deg hanskene for å manipulere stubbene.Fordyp dem i aceton i 5 minutter for å eliminere fett og la dem tørke. Under et stereomikroskop, fest prøvene på stubben ved hjelp av et ledende dobbeltsidig karbontape og plasser dem. Nettstedet ovenfra er det eneste mulige perspektivet ved skanning av elektronmikroskopibilder.For å manipulere prøvene, bruk fin punktpincett. Prøvedelen som berøres av pinsetten er vanligvis skadet. Så vær forsiktig og prøv å berøre deler plassert vekk fra interesseområdene.Oppretthold stubbene med prøver i en forseglet petriskål med silikagel. Fortsett deretter med sputterbelegg for å avsette et lag gull eller platina på overflaten av prøvene i en lavtrykksatmosfære av inert gass ved å følge standard driftsprosedyrer. Beleggtykkelsen avhenger av prøvens topografi og er vanligvis mellom 15 og 40 nanometer.Til slutt, vedlikehold de belagte stubbene i en forseglet petriskål med silikagel som beholder fuktighet. Prøvene kan lagres på denne måten i flere uker. Bruk et skanneelektronmikroskop for å analysere disse prøvene.En elektronstråle treffer in vacuo-prøven under skanning av elektronmikroskopi, og signalutslippet fra slik interaksjon tolkes som bilder. Sørg for at løsningene og materialene som brukes i symbiotisk spiring av frø er sterile. for å unngå forurensning.Start med å autoklavere dem i 20 minutter ved 121 grader Celsius. I en laminær luftstrømshette desinfiserer du overfladisk fruktene og frøene ved å nedsenke dem i en natriumhypoklorittløsning som inneholder 2% aktivt klor. Slanke og skjøre frø kan nedsenkes i en 1: 1 fortynnet natriumhypoklorittløsning.Etter desinfeksjon gjenoppretter frøene ved å filtrere dem ved hjelp av xerografisk stoff. Vask fruktene og frøene tre ganger i autoklavert destillert vann for å fjerne hypoklorittoppløsningen før du fortsetter med spiringstestene. Om nødvendig, oppbevar dem i filterpapirkonvolutter inne i glassflasker med silikagel ved 4 grader Celsius og hermetisk lukk kolbene og forsegle dem med klamfilm, og vurder deretter effektiviteten av vaskeprosessen ved å overføre noen dråper vann fra siste vask til potetdekstroseagar.For symbiotisk spiring av orkidéfrø, inkuberer frøene over 1 til 2 centimeter autoklalede filterpapirskiver plassert i petriskåler som inneholder havregrynagarkulturmedium. Nå, inokulere sentrum av petriskålen med fragmentet av kulturmedium som inneholder mycelium fra den valgte isolerte soppen. Forsegl petriskålene med klamfilm og inkuber dem i mørket ved rundt 25 grader Celsius eller romtemperatur, avhengig av soppveksten.Forbered noen retter med frø og uten soppinokulasjon som en negativ kontroll for spiringstesten. Analyser spiringsresultatene ukentlig ved å samle kvantitative og kvalitative data og fotografere protokormer og frøplanter. Rhizomorphs kan lett gjenkjennes vanligvis som mørke, shoestring-lignende strukturer.Frihånd eller andre metoder for å skaffe seksjoner tykkere enn 10 mikrometer kan bedre bevise pelotoner og gi mer representative bilder av soppmønstre av kolonisering. Frihåndsseksjoner kan også være egnet for hyferanalyse ved høyere forsterkning. Selv om detaljer oppnås bedre i tynnere seksjoner.De sekundære celleveggene i xylem-elementer kan lett identifiseres ved den lyse fargen toluidin oppnår. I mellomtiden identifiseres floemelementer som bare består av primære cellevegger av deres tynnere og mørkere cellevegger. Artefakter ved autofluorescens kan ses i glykolmetakrylatharpiksseksjoner.Disse artefaktene er vanligvis relatert til fluorokromkonsentrasjon og kan unngås ved å vaske prøvene et større antall ganger med bufferen. Frihåndsdelen av roten viser interne og eksterne hyfer. Det samme organet kan ses ved å skanne elektronmikroskopi med en overflod av rhizomorfer og individuelle hyfer på overflaten.De fleste orkidéarter spirer innen noen uker etter å ha blitt smittet av den inokulerte soppen eller til nesten mer enn en måned. Lys i skanning elektronmikroskopi kan brukes på blomster, frukt og frø for å undersøke reproduktiv biologi eller mykoheterotrofe planter. Symbiotisk spiring av frø kan også testes i autotrofe orkideer.

Research

JoVE Journal

Biology

Obtaining Hemocytes from the Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes and Observing their Adherence to Symbiotic and Non-Symbiotic Bacteria

Obtaining Hemocytes from the Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes and Observing their Adherence to Symbiotic and Non-Symbiotic Bacteria

Studies concerning the role of the immune system in mediating molecular signaling between beneficial bacteria and their hosts have, in recent years, made ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Tandem Høytrykks Frysing og Quick Freeze Bytte av plantemateriale for transmisjonselektronmikroskopi

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Måle romlig og tidsmessig Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signaler i Arabidopsis planter

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analyse av Autophagy i<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Ved hjelp av Sult Pads i kombinasjon med Fluorescensmikroskopi

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Skanning elektronmikroskopi (SEM) Protokoller for Problema Plant, eggsporesopper, og Fungal Samples

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

Lys Sheet Fluorescensmikroskopi av planterøttene vokser på overflaten av en Gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Karakterisering av Forkalkning Hendelser Bruke levende Optiske og elektronmikroskopi teknikker i en Marine tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

Enkel og effektiv administrasjon og visualisering av Microparticles i sirkulasjonssystemet av små fisk med nyre injeksjon

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

Micron-scale Phenotyping Techniques of Maize Vascular Bundles Based on X-ray Microcomputed Tomography

Micron skala Phenotyping teknikker av mais vaskulær pakker basert på X-ray Microcomputed tomografi

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a ...