Name: microscopy techniques for interpreting fungal colonization in mycoheterotrophic plants tissues and symbiotic germination of seeds
Uploaded: 2022-05-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds at JoVE.com

Os autores agradecem financiamento da FAEPEX e fapesp (2015/26479-6). MPP agradece à Capes pela bolsa de mestrado (processo 88887.600591/2021-00) e CNPq. JLSM agradece ao CNPq por bolsas de produtividade (303664/2020-7). Os autores também agradecem o acesso aos equipamentos e assistência prestados pelo LME (Laboratório de Microscopia Eletrônica - IB/Unicamp), INFABiC (Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Fotônica Aplicada à Biologia Celular - Unicamp) e LaBiVasc (Laboratório de Biologia Vascular - DBEF/IB/Unicamp); LAMEB (UFSC) e Eliana de Medeiros Oliveira (UFSC) por contribuições ao protocolo de crioproteção; LME para contribuições ao protocolo TEM.

1. Coleta, fixação e manutenção de amostras
NOTA: Plantas totalmente MS geralmente podem ser encontradas na floresta escura abaixo da história12,13, principalmente em áreas úmidas e abundantes em lixo, enquanto parcialmente plantas DE MS podem ser encontradas em florestas mais abertas12,13. As plantas de MS geralmente têm órgãos subterrâneos bem desenv...

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As análises de imagem na anatomia e morfologia das plantas têm um importante potencial para cumprir objetivos e ajudar a entender as relações entre as plantas micoheterotróficas e seus endofofados fúngicos indispensáveis, como demonstrado por estudos de órgãos subterrâneos 6,40, análises estruturais da germinação simbiótica das sementes39, e estruturas aéreas e reprodutivas41 . A botânica estrutural,...

A pesquisa estrutural em botânica, abrangendo morfologia vegetal e anatomia, é fundamental na compreensão de todo o organismo 1,2, e fornece perspectivas indispensáveis para integrar e contribuir para o conhecimento sobre a ecologia, fisiologia, desenvolvimento e evolução das plantas3. Os métodos de morfologia e anatomia vegetal atualmente compreendem protocolos, equipamentos e conhecimentos desenvolvidos recentemente, bem como há mais de um séculoatrás, 2. A execução contínua e adaptação dos métodos clássicos (por exemplo, microscopia leve) juntamente com técnicas mais recentes (por exemplo, microscopia confocal, microtomografia de raios-X) têm a mesma base essencial: conhecimento teórico que permite o desenvolvimento de uma metodologia.
A principal ferramenta na anatomia e morfologia das plantas é a imagem. Apesar do equívoco de que tais análises são observações simples, dando espaço a interpretações subjetivas2, analisar e compreender imagens nessa área requer conhecimento dos métodos aplicados (o equipamento, tipo de análise, procedimentos metodológicos), componentes celulares, histoquímica e o corpo vegetal (organização e função tecidual, ontogenia, adaptações morfológicas). Interpretar as imagens obtidas através de uma variedade de métodos pode levar à correlação entre forma e função, decifrando a composição química de uma estrutura, corroborando na descrição da taxa, na compreensão de infecções por fitopatógenos e outras avaliações desse tipo.
Ao pesquisar plantas micoheterotróficas (MH) (ou seja, plantas não fotossintéticas que obtêm carbono de fungos micorrizais 4,5), aspectos notáveis de suas adaptações estruturais, os padrões de colonização tecidual por fungos e a morfomia de órgãos subterrâneos podem iluminar suas estratégias de desenvolvimento e relações com a hifa, que são a fonte de nutrientes. Os órgãos subterrâneos das plantas de MS geralmente apresentam importantes adaptações relacionadas à sua associação com fungos do solo, por isso é essencial realizar essas investigações anatômicas e morfológicas6. Os órgãos aéreos da espécie MH não devem ser ignorados, pois os endófitos também podem estar presentes nesses tecidos, mesmo que não sejam fungos micorrizais (observações pessoais, ainda não publicadas).
Além da essencialidade bem estabelecida da associação de fungos micorrizais com espécies de MS durante todo o seu ciclode vida 7, todas as espécies de orquídeas, mesmo as autotróficas, têm um estágio micoheterotrófico obrigatório inicial em ambientes naturais. Ocorre porque o embrião das orquídeas é indiferenciado e carece de endosperm ou cotilledons, sendo assim incapaz de se desenvolver e se estabelecer em ambientes naturais sem o apoio nutricional dos parceiros fúngicos 4,8. Considerando isso, os protocolos simbióticos de germinação podem ser aplicados não apenas às espécies de MS, mas também às orquídeas fotossintestares, com o objetivo de investigar a especificidade orquídea-fungo no desenvolvimento de germinação e protocorma, metodologia muito aplicada em iniciativas de conservação de espécies ameaçadas 9,10,11.
Nesta montagem de métodos, descrevemos passos importantes envolvidos na coleta, fixação e armazenamento de amostras de plantas de MS para estudos anatômicos (seção 1), análise de superfície e seleção de amostras (seção 2), métodos de secção (à mão livre: seção 3, microtomia: seção 4, criomicrotomia: seção 5), coloração e montagem (seção 6), fluorescência e microscopia confocal de endofitos fúngicos (seção 7), microscopia eletrônica de varredura (seção 8), e microscopia eletrônica de transmissão (seção 9). Além disso, descrevemos um método de germinação simbiótica para sementes de orquídeas (MH e autotrófico, seção 10), pois os métodos de imagem mencionados anteriormente podem ser aplicados com sucesso para analisar a colonização fúngica de sementes, protocormas e mudas no processo de germinação.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63777/63777fig01.jpg"> Figura 1: Resumição esquemática dos métodos de imagem. Os esquemas fornecem indicações de etapas de protocolo nas quais são detalhadas. Abreviaturas: GMA = methacrilato glicol, OCT = composto de temperatura de corte ideal, SEM = microscopia eletrônica de varredura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63777/63777fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
As técnicas de microscopia descritas aqui em detalhes (Figura 1) são precedidas pelas seguintes etapas essenciais: coleta, fixação, desidratação, incorporação e secção de amostras. Como as etapas são variáveis (Figura 1) dependendo da técnica escolhida( s), é importante pensar com antecedência, considerando os fixativos a serem preparados e transportados para o local de coleta, como as amostras devem ser preparadas antes da fixação, os processos de desidratação a serem utilizados (seção 1) e diferentes possibilidades de incorporação e métodos de secção (seções 4, 5, e 9). A Figura 1 resume sequencialmente todas as etapas necessárias para cada técnica de microscopia completamente descrita abaixo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179124</td>
			<td>(for SEM stubs mounting)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar-agar (AA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1296</td>
			<td>(for seeds germination tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcofluor White Stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18909</td>
			<td>fluorescent dye (detects cellulose)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate Buffer Solution, 0.09M pH 4.8</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2488</td>
			<td>(for toluidine blue O staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive Double-Sided Carbon Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-285-81</td>
			<td>(for SEM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper Grids</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4776</td>
			<td>(for TEM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical-point dryer</td>
			<td>Balzers</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>(= stereomicroscope, any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Entellan</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>107960</td>
			<td>rapid mounting medium for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol, pure (&#8805;99.5%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>459836</td>
			<td>(= ethanol, for dehydration processes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution, 37%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252549</td>
			<td>(for NBF solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td>histological tissue fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin capsules for TEM</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-248-71</td>
			<td>(for resin polymerisation in TEM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin solution, 2% in H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1393</td>
			<td>(dilute for slides preparation - OCT adherence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution, 25%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6257</td>
			<td>(for Karnovsky&#8217;s solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoResin</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>14702231731</td>
			<td>glycol methacrylate (GMA) embedding kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>207772</td>
			<td>(for Lugol solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead(II) nitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>228621</td>
			<td>Pb(NO3)2 (for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR White acrylic resin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9774</td>
			<td>hydrophilic acrylic resin for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lugol solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>62650</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal stubs for specimen mounts</td>
			<td>Rave Scientific</td>
			<td></td>
			<td>(for SEM, different models)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>manual rotary microtome or other model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oatmeal agar (OMA)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>O3506</td>
			<td>(for seeds germination tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Compound, Tissue-Tek</td>
			<td>Sakura Finetek USA</td>
			<td>4583</td>
			<td>embedding medium for frozen tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201030</td>
			<td>OsO4 (for TEM postfixation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793</td>
			<td>sealing thermoplastic film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td>(for Karnovsky&#8217;s solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine solution, 0.1% in H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td>(for slides preparation - OCT adherence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep Slides</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0425</td>
			<td>poly-L-lysine coated glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Molding Cup Trays</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>17177A-3</td>
			<td>(6x8x5 mm, for embbeding samples in GMA resin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Molding Cup Trays</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>17177C-3</td>
			<td>(13x19x5 mm, for embbeding samples in GMA resin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221945</td>
			<td>(for Lugol solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato Dextrose Agar (PDA)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>70139</td>
			<td>(for seeds germination tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscope</td>
			<td>Jeol</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silane [(3-Aminopropyl)triethoxysilane]</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3648</td>
			<td>(for slides preparation - OCT adherence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silane-Prep Slides</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4651</td>
			<td>glass slides coated with silane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel orange, granular</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>10087</td>
			<td>(for dessicating processes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0250</td>
			<td>(for glutaraldehyde-sodium cacodylate buffer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881</td>
			<td>NaOH (for Karnovsky&#8217;s solution preparation and TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>425044</td>
			<td>NaClO (for seeds surface disinfection)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic, anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71640</td>
			<td>Na2HPO4 (for NBF solution and PB preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td>NaH2PO4&#183;H2O (for NBF and PB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sputter coater</td>
			<td>Balzers</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td>C12H22O11 (for cryoprotection and germination test)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan III</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4131</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan IV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>198102</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan Black B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>199664</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(3 mL, any brand, for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter Unit, Millex-GV 0.22 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033R</td>
			<td>PVDF, 33 mm, gamma sterilized (for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tek Bond Super Glue 793</td>
			<td>Tek Bond Saint-Gobain</td>
			<td>78072720018</td>
			<td>liquid cyanoacrylate adhesive, medium viscosity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3260</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Jeol</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triphenyltetrazolium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8877</td>
			<td>(for the tetrazolium test in seeds germination)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1804</td>
			<td>Na3(C6H5O7)&#183;2H2O (for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-607-645</td>
			<td>UO2(CH3COO)2 (for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td>TermoFisher Scientific</td>
			<td>W11261</td>
			<td>fluorescent dye-conjugated lectin (detects sialic acid and N-acetylglucosaminyl residues)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microscopy techniques for interpreting fungal colonization in mycoheterotrophic plants tissues and symbiotic germination of seeds

A botânica estrutural é uma perspectiva indispensável para compreender plenamente a ecologia, a fisiologia, o desenvolvimento e a evolução das plantas. Ao pesquisar plantas micoheterotróficas (ou seja, plantas que obtêm carbono de fungos), aspectos notáveis de suas adaptações estruturais, os padrões de colonização tecidual por fungos e a morfomia de órgãos subterrâneos podem iluminar suas estratégias de desenvolvimento e suas relações com a hifa, fonte de nutrientes. Outro papel importante dos fungos simbióticos está relacionado à germinação de sementes de orquídeas; todas as espécies de Orquídeas são micoterróticas durante a germinação e fase de mudas (micoheterotrofia inicial), mesmo as que fotossintetizam em estágios adultos. Devido à falta de reservas nutricionais em sementes de orquídeas, os simmbiontos fúngicos são essenciais para fornecer substratos e possibilitar a germinação. Analisar etapas de germinação por perspectivas estruturais também pode responder a questões importantes sobre a interação dos fungos com as sementes. Diferentes técnicas de imagem podem ser aplicadas para desvendar endofitos de fungos em tecidos vegetais, como são propostos neste artigo. Seções à mão livre e finas de órgãos vegetais podem ser manchadas e depois observadas usando microscopia leve. Um fluorocromo conjugado à aglutina germina de trigo pode ser aplicado aos fungos e co-incubado com Calcofluor White para destacar paredes de células vegetais em microscopia confocal. Além disso, as metodologias de digitalização e microscopia eletrônica de transmissão são detalhadas para orquídeas micterotróficas, e as possibilidades de aplicação desses protocolos em plantas relacionadas são exploradas. A germinação simbiótica das sementes de orquídeas (ou seja, na presença de fungos micorrizais) é descrita no protocolo em detalhes, juntamente com possibilidades de preparação das estruturas obtidas a partir de diferentes estágios de germinação para análises com microscopia de luz, confocal e elétron.

Seguindo os estágios essenciais de fixação do tecido vegetal produz estruturas celulares o mais semelhantes possível ao estado vivo, considerando a morfologia, o volume e a organização espacial dos componentes celulares e tecidos16. Observe tais características nas amostras após a fixação química (Figura 4). A Figura 4C-F representa amostras adequadamente fixas sob microscopia leve. Seguir os p...

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Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds

Este protocolo visa fornecer procedimentos detalhados para coleta, fixação e manutenção de amostras de plantas micoheterotróficas, aplicando diferentes técnicas de microscopia, como microscopia eletrônica de varredura e transmissão, microscopia de luz, confocal e fluorescência para estudar a colonização fúngica em tecidos e sementes geridas com fungos micorrizais.

Técnicas de Microscopia para Interpretação da Colonização Fúngica em Tecidos de Plantas Micoheterotróficas e Germinação Simbiótica de Sementes

Structural botany is an indispensable perspective to fully understand the ecology, physiology, development, and evolution of plants. When researching ...

O protocolo apresenta diversas técnicas de microscopia aplicadas para compreender a colonização fúngica em plantas micterotróficas, desde a coleta até o preparo de amostras em detalhes e inclua etapas essenciais. Tais técnicas podem ser aplicadas a várias plantas micoheterotróficas, e até mesmo a materiais de uma planta que não sejam micoheterotróficos. Este método está principalmente relacionado à botânica estrutural e também poderia fornecer insights sobre interações micorrizais, fisiologia, biologia reprodutiva, evolução e ecologia de plantas micoheterotróficas.Para começar, colete as plantas micoheterotróficas explorando o solo ao redor da base vegetal, tomando cuidado para não danificar os órgãos subterrâneos. Além disso, evite retirar as plantas do solo para evitar desconectar os órgãos aéreos dos subterrâneos. Cuidadosamente, cavem em torno de estruturas aéreas usando uma espátula de jardinagem enquanto exploram os órgãos subterrâneos como raízes, caules, rizomas e órgãos de armazenamento sem danificar essas estruturas.Remova as partículas do solo para preservar estruturas frágeis e lave delicadamente esses órgãos com água da torneira para enxaguar as partículas restantes do solo antes de fixar as amostras. Plantas micoheterotróficas associadas ao lixo de folhas exigem atenção extra. Assim, colecione cuidadosamente os órgãos delicados ligados ao material em decomposição através de sua hifa sem retirá-los das estruturas conectadas.Preservar estruturas com essas conexões e coletar o lixo para análise. Para análise de microscopia eletrônica de transmissão, se sectionia as amostras de 3 a 4 milímetros de espessura dentro de uma gota de tampão de cacodilato de sódio glutaraldeído em seções menores de 1 a 2 milímetros de espessura. Descarte as bordas de corte fora da gota.Certifique-se de realizar o processo de fixação no local de coleta imediatamente após a coleta das plantas. Transfira imediatamente as seções para um tubo de coleta com um volume de fixação mais de 10 vezes maior do que o volume das amostras, pois é um fixador aditivo. Para análise superficial da hifa superficial nos órgãos, especialmente nas subterrâneas e em contato com o lixo da folha.Observe material fresco ou fixo sob o microscópio de dissecção a uma ampliação de 7,5x ou superior. Procure as áreas de interesse guiadas pela hifa superficial e pelos rizomorfos. Selecione as amostras contendo áreas de rizomorfos superficiais, pois estas podem ser seccionadas para visualizar pelotões e bobinas de higiênico dentro de células corticais em raízes e caules.Prepare 0,2 miligramas por mililitro de germe de trigo aglutinina conjugado fluorocromo e 1%calcofluor de soluções brancas em 0,1 tampão de fosfato molar, conforme descrito no manuscrito do texto. Agora, incubar as seções em lâminas de vidro cobrindo-as adequadamente com germinação de trigo agglutinina fluorocromo solução conjugada por 30 minutos. Após a incubação, lave as seções com tampão de fosfato molar 0,1 e incuba-as na solução de calcofluor como meio de montagem.Em seguida, coloque os deslizamentos de cobertura nos slides e observe-os sob um microscópio de luz confocal ou fluorescência usando os filtros indicados. Depois de corrigir as amostras, realizar a desidratação e armazená-la em 70% de etanol, exponha qualquer superfície desejada para a análise de microscopia eletrônica de varredura usando uma lâmina afiada e nova para fazer cortes com um movimento unidirecial. Se necessário, use um microscópio estéreo para selecionar as amostras e considerar a área de stubs metálicos, determinando os tamanhos da amostra.Além disso, desidratar as amostras em uma série etanolica. Mantenha amostras pequenas e delicadas por 30 minutos em cada concentração e amostras maiores e mais densas por 1 hora. Em seguida, dobre pequenos envelopes usando papel de tecido para organizar amostras para os próximos passos.Amostras maiores podem ser manuseadas sem um envelope. Rotule os envelopes usando um lápis e mantenha um registro das amostras. Com cuidado, coloque as amostras dentro dos envelopes usando um pincel.Agora, mantenha essas amostras em etanol absoluto. Imediatamente proceda com secagem de pontos críticos operando uma secadora de ponto crítico de acordo com os procedimentos operacionais padrão. Para isso, coloque as amostras em etanol absoluto em um suporte de amostra e coloque-a dentro da câmara de pressão do ponto crítico.O fluido intermediário dissolve-se no fluido de transição no ponto crítico de dióxido de carbono, secando assim as amostras. Como a reabsorção da umidade atmosférica pode destruir as amostras, armazene-as em um recipiente de dessecação imediatamente após a secagem de pontos críticos. Antes de montar as amostras em estações metálicas, coloque as luvas para manipular os stubs.Mergulhe-os em acetona por 5 minutos para eliminar qualquer gordura e deixá-los secar. Sob um microscópio estéreo, fixar as amostras no stub usando uma fita adesiva de carbono de dois lados condutor e posicioná-las. O local de cima é a única perspectiva possível na varredura de imagens de microscopia eletrônica.Para manipular as amostras, use pinças de ponta fina. A parte da amostra tocada pelas pinças é geralmente danificada. Por isso, tenha cuidado e tente tocar peças posicionadas longe das áreas de interesse.Mantenha os stubs com amostras em uma placa de Petri selada com gel de sílica. Em seguida, prossiga com o revestimento de sputter para depositar uma camada de ouro ou platina na superfície das amostras em uma atmosfera de baixa pressão de gás inerte seguindo os procedimentos operacionais padrão. A espessura do revestimento depende da topografia da amostra e geralmente está entre 15 a 40 nanômetros.Por fim, mantenha os stubs revestidos em uma placa de Petri selada com gel de sílica mantendo a umidade. As amostras podem ser armazenadas desta forma por semanas. Use um microscópio eletrônico de varredura para analisar essas amostras.Um feixe de elétrons atinge a amostra de vacuo durante a microscopia eletrônica de varredura e a emissão de sinal de tal interação é interpretada como imagens. Certifique-se de que as soluções e materiais utilizados na germinação simbiótica das sementes sejam estéreis. para evitar contaminação.Comece autoclavando-os por 20 minutos a 121 graus Celsius. Em uma capa de fluxo de ar laminar, desinfete superficialmente as frutas e sementes imergindo-as em uma solução de hipoclorito de sódio contendo cloro 2% ativo. Sementes finas e frágeis podem ser imersas em uma solução de hipoclorito de sódio diluído 1:1.Após a desinfecção, recupere as sementes filtrando-as usando tecido xerográfico. Lave os frutos e sementes três vezes em água destilada autoclavada para remover a solução de hipoclorito antes de prosseguir com os testes de germinação. Se necessário, armazene-os em envelopes de papel filtro dentro de frascos de vidro com gel de sílica a 4 graus Celsius e feche hermeticamente os frascos e sele-os com filme agarrado, em seguida, avalie a eficácia do processo de lavagem transferindo algumas gotas de água da última lavagem para o ágar de dextrose de batata.Para germinação simbiótica de sementes de orquídeas, incubar as sementes com mais de 1 a 2 centímetros de papel de papel filtro autoclavado colocados em pratos de Petri contendo meio de cultura de ágar de aveia. Agora, inocular o centro da placa de Petri com o fragmento do meio de cultura contendo micélio do fungo isolado escolhido. Sele as placas de Petri com filme agarrado e incuba-as no escuro a cerca de 25 graus Celsius ou temperatura ambiente, dependendo do crescimento fúngico.Prepare alguns pratos com sementes e sem inoculação fúngica como um controle negativo para o teste de germinação. Analisar os resultados da germinação semanalmente coletando dados quantitativos e qualitativos e fotografando protocorms e mudas. Os rizomófos podem ser facilmente reconhecidos geralmente como estruturas escuras, semelhantes a sapatos.À mão livre ou outros métodos de obtenção de seções mais grossas que 10 micrômetros podem evidenciar melhor pelotões e fornecer imagens mais representativas de padrões fúngicos de colonização. Seções à mão livre também podem ser adequadas para análise de hifa em maior amplificação. Embora, os detalhes sejam melhor alcançados em seções mais finas.As paredes de células secundárias em elementos xilema podem ser facilmente identificadas pela cor clara que toluidina adquire. Enquanto isso, elementos de phloem compostos apenas de paredes celulares primárias são identificados por suas paredes celulares mais finas e escuras. Artefatos por autofluorescência podem ser vistos em seções de resina de metacrilato glicol.Estes artefatos geralmente estão relacionados à concentração fluorocromática e podem ser evitados lavando as amostras um número maior de vezes com o tampão. A seção à mão livre da raiz mostra hifas internas e externas. O mesmo órgão pode ser visto através da microscopia eletrônica com uma abundância de rizomorfos e hifas individuais em sua superfície.A maioria das espécies de orquídeas germinam dentro de algumas semanas depois de serem infectadas pelo fungo inoculado ou até quase mais de um mês. A luz na microscopia eletrônica de varredura pode ser aplicada em flores, frutas e sementes para investigar a biologia reprodutiva ou plantas micoheterotróficas. A germinação simbiótica das sementes também pode ser testada em orquídeas autotróficas.

Research

JoVE Journal

Biology

Obtaining Hemocytes from the Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes and Observing their Adherence to Symbiotic and Non-Symbiotic Bacteria

Obtaining Hemocytes from the Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes and Observing their Adherence to Symbiotic and Non-Symbiotic Bacteria

Obtenção Hemócitos do Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes Observando e sua adesão a bactérias simbióticas e não-simbióticas

Studies concerning the role of the immune system in mediating molecular signaling between beneficial bacteria and their hosts have, in recent years, made ...

Biologia

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Grampo patch e Técnicas de Perfusão para estudar canais iônicos Expresso em Xenopus Oócitos

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Tandem congelamento de pressão alta e rápida substituição em congelamento dos tecidos vegetais por Microscopia Eletrônica de Transmissão

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

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Medindo espacial e temporal Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Sinais em Arabidopsis Plantas

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Análise de Autophagy em<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Por a inanição Pads em combinação com microscopia de fluorescência

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) Protocolos para a Problemática da planta, oomiceto e amostras fúngicas

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

Microscopia de Luz Folha de fluorescência das raízes das plantas que crescem na superfície de um gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Caracterização de calcificação eventos usando o Live Óptica e Microscopia Eletrônica de técnicas em um tubeworm Marinha

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

Administração simples e eficaz e visualização de micropartículas no sistema circulatório de peixes pequenos usando injeção de rim

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

Micron-scale Phenotyping Techniques of Maize Vascular Bundles Based on X-ray Microcomputed Tomography

Técnicas de fenotipagem mícron-escala de milho feixes vasculares, com base na tomografia computadorizada de Microcomputed de raio-x

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a ...