Name: microscopy techniques for interpreting fungal colonization in mycoheterotrophic plants tissues and symbiotic germination of seeds
Uploaded: 2022-05-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds at JoVE.com

Авторы благодарят финансирование от FAEPEX и FAPESP (2015/26479-6). MPP благодарит Кейпса за стипендию магистратуры (процесс 88887.600591/2021-00), а CNPq. JLSM благодарит CNPq за гранты на производительность (303664/2020-7). Авторы также благодарят доступ к оборудованию и помощь, предоставляемые LME (Лаборатория электронной микроскопии - IB / Unicamp), INFABiC (Национальный институт науки и техники по фотонике, применяемой к клеточной биологии - Unicamp) и LaBiVasc (Лаборатория сосудистой биологии - DBEF / IB / Unicamp); LAMEB (UFSC) и Eliana de Medeiros Oliveira (UFSC) за вклад в протокол криозащиты; LME за вклад в протокол ТЕА.

1. Сбор, фиксация и обслуживание образцов
ПРИМЕЧАНИЕ: Полностью MH растения обычно можно найти в темном лесном подлеске12,13, в основном во влажных и обильных мусором районах, тогда как частично растения MH можно найти в более открытых л...

<ol>
	<li>Evert, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Esau&#8217;s Plant Anatomy: Meristems, Cells, and Tissues of the Plant Body: Their Structure, Function, and Development. , (2006).</li><li>Yeung, E. C. T., Stasolla, C., Sumner, M. J., Huang, B. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plant Microtechniques and Protocols. , (2015).</li><li>Sokoloff, D. D., Jura-Morawiec, J., Zoric, L., Fay, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+anatomy:+at+the+heart+of+modern+botany.">Plant anatomy: at the heart of modern botany.</a> Botanical Journal of the Linnean Society. 195 (3), 249-253 (2021).</li><li>Leake, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+myco-heterotrophic+(&#8216;saprophytic&#8217;)+plants.">The biology of myco-heterotrophic (&#8216;saprophytic&#8217;) plants.</a> New Phytologist. 127 (2), 171-216 (1994).</li><li>Bidartondo, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolutionary+ecology+of+myco-heterotrophy.">The evolutionary ecology of myco-heterotrophy.</a> New Phytologist. 167 (2), 335-352 (2005).</li><li>Imhof, S., Massicotte, H. B., Melville, L. H., Peterson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subterranean+morphology+and+mycorrhizal+structures.">Subterranean morphology and mycorrhizal structures.</a> Mycoheterotrophy. , 157-214 (2013).</li><li>Rasmussen, H. N., Rasmussen, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchid+mycorrhiza:+implications+of+a+mycophagous+life+style.">Orchid mycorrhiza: implications of a mycophagous life style.</a> Oikos. 118 (3), 334-345 (2009).</li><li>Rasmussen, H. N., Dixon, K. W., Jers&#225;kov&#225;, J., T&#283;&#353;itelov&#225;, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+and+seedling+establishment+in+orchids:+a+complex+of+requirements.">Germination and seedling establishment in orchids: a complex of requirements.</a> Annals of Botany. 116 (3), 391-402 (2015).</li><li>Zettler, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terrestrial+orchid+conservation+by+symbiotic+seed+germination:+techniques+and+perspectives.">Terrestrial orchid conservation by symbiotic seed germination: techniques and perspectives.</a> Selbyana. 18 (2), 188-194 (1997).</li><li>Stewart, S. L., Kane, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symbiotic+seed+germination+and+evidence+for+in+vitro+mycobiont+specificity+in+Spiranthes+brevilabris+(Orchidaceae)+and+its+implications+for+species-level+conservation.">Symbiotic seed germination and evidence for in vitro mycobiont specificity in Spiranthes brevilabris (Orchidaceae) and its implications for species-level conservation.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Plant. 43 (3), 178-186 (2007).</li><li>Zhao, D. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchid+reintroduction+based+on+seed+germination-promoting+mycorrhizal+fungi+derived+from+protocorms+or+seedlings.">Orchid reintroduction based on seed germination-promoting mycorrhizal fungi derived from protocorms or seedlings.</a> Frontiers in Plant Science. 12, 701152 (2021).</li><li>Selosse, M. A., Roy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+plants+that+feed+on+fungi:+facts+and+questions+about+mixotrophy.">Green plants that feed on fungi: facts and questions about mixotrophy.</a> Trends in Plant Science. 14 (2), 64-70 (2009).</li><li>Merckx, V. S. F. T., Mennes, C. B., Peay, K. G., Geml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+diversification.">Evolution and diversification.</a> Mycoheterotrophy: The Biology of Plants Living on Fungi. , 215-244 (2013).</li><li>Boon, M. E., Drijver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routine+Cytological+Staining+Techniques:+Theoretical+Background+and+Practice.">Routine Cytological Staining Techniques: Theoretical Background and Practice.</a> Macmillan International Higher Education. , (1986).</li><li>Karnovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+formaldehyde-glutaraldehyde+fixative+of+high+osmolality+for+use+in+electron+microscopy.">A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 27 (2), 137-138 (1964).</li><li>Hayat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fixation for Electron Microscopy. , (1981).</li><li>Roland, J. C., Vian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+preparation+and+staining+of+thin+sections.">General preparation and staining of thin sections.</a> Electron Microscopy of Plant Cells. 1, 675 (1991).</li><li>Gerrits, P. O., Horobin, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycol+methacrylate+embedding+for+light+microscopy:+basic+principles+and+trouble-shooting.">Glycol methacrylate embedding for light microscopy: basic principles and trouble-shooting.</a> Journal of Histotechnology. 19 (4), 297-311 (1996).</li><li>Zhang, Z., Niu, L., Chen, X., Xu, X., Ru, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+plant+cryosection.">Improvement of plant cryosection.</a> Frontiers in Biology. 7 (4), 374-377 (2012).</li><li>Bene&#352;, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+media+improving+freeze-sectioning+of+plant+material.">On the media improving freeze-sectioning of plant material.</a> Biologia Plantarum. 15 (1), 50-56 (1973).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+slides+and+coverslips+for+microscopy.">Preparation of slides and coverslips for microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (5), (2008).</li><li>Sakai, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+method+for+differential+staining+of+paraffin+embedded+plant+material+using+toluidine+blue+O.">Simple method for differential staining of paraffin embedded plant material using toluidine blue O.</a> Stain Technology. 48 (5), 247-249 (1973).</li><li>O&#8217;Brien, T., Feder, N., McCully, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polychromatic+staining+of+plant+cell+walls+by+toluidine+blue+O.">Polychromatic staining of plant cell walls by toluidine blue O.</a> Protoplasma. 59 (2), 368-373 (1964).</li><li>Ventrella, M. C., Almeida, A. L., Nery, L. A., Coelho, V. P. d. e. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#233;todos+Histoqu&#237;micos+Aplicados+&#224;s+Sementes.">M&#233;todos Histoqu&#237;micos Aplicados &#224;s Sementes.</a> Universidade Federal de Vi&#231;osa. , (2013).</li><li>Pearse, A. G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histochemistry, Theoretical and Applied. , (1960).</li><li>Andrade-Linares, D. R., Franken, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+endophytes+in+plant+roots:+taxonomy,+colonization+patterns,+and+functions.">Fungal endophytes in plant roots: taxonomy, colonization patterns, and functions.</a> Symbiotic Endophytes. , 311-334 (2013).</li><li>Wymer, C. L., Beven, A. F., Boudonck, K., Lloyd, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy+of+plant+cells.">Confocal microscopy of plant cells.</a> Confocal Microscopy Methods and Protocols. , 103-130 (1999).</li><li>Marques, J. P. R., Soares, M. K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+de+T&#233;cnicas+Aplicadas+&#224;+Histopatologia+Vegetal.">Manual de T&#233;cnicas Aplicadas &#224; Histopatologia Vegetal.</a> FEALQ. , (2021).</li><li>Navarro, B. L., Marques, J. P. R., Appezzato-da-Gl&#243;ria, B., Sp&#243;sito, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histopathology+of+Phakopsora+euvitis+on+Vitis+vinifera.">Histopathology of Phakopsora euvitis on Vitis vinifera.</a> European Journal of Plant Pathology. 154 (4), 1185-1193 (2019).</li><li>Marques, J. P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugarcane+cell+wall-associated+defense+responses+to+infection+by+Sporisorium+scitamineum.">Sugarcane cell wall-associated defense responses to infection by Sporisorium scitamineum.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 698 (2018).</li><li>Jeffree, C. E., Read, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ambient-and+low-temperature+scanning+electron+microscopy.">Ambient-and low-temperature scanning electron microscopy.</a> Electron Microscopy of Plant Cells. , 313-413 (1991).</li><li>Bozzola, J. J., Russell, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Electron Microscopy: Principles and Techniques for Biologists. , (1999).</li><li>Murray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+transmission+and+scanning+electron+microscopy.">Basic transmission and scanning electron microscopy.</a> Introduction to electron Microscopy for Biologists. , 3-18 (2008).</li><li>. Glossary of TEM terms Available from: <a target="_blank" href="https://www.jeol.co.jp/en/words/emterms/">https://www.jeol.co.jp/en/words/emterms/</a> (2021)</li><li>Seaton, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchid+seed+and+pollen:+a+toolkit+for+long-term+storage,+viability+assessment+and+conservation.">Orchid seed and pollen: a toolkit for long-term storage, viability assessment and conservation.</a> Orchid Propagation: From Laboratories to Greenhouses&#8212;Methods and Protocols. , 71-98 (2018).</li><li>Otero, J. T., Ackerman, J. D., Bayman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+mycorrhizal+preferences+between+two+tropical+orchids.">Differences in mycorrhizal preferences between two tropical orchids.</a> Molecular Ecology. 13 (8), 2393-2404 (2004).</li><li>Koch, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marasmioid+rhizomorphs+in+bird+nests:+Species+diversity,+functional+specificity,+and+new+species+from+the+tropics.">Marasmioid rhizomorphs in bird nests: Species diversity, functional specificity, and new species from the tropics.</a> Mycologia. 112 (6), 1086-1103 (2020).</li><li>Webster, J., Weber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Introduction to Fungi. , (2007).</li><li>Sisti, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+non-mycorrhizal+fungi+in+germination+of+the+mycoheterotrophic+orchid+Pogoniopsis+schenckii+Cogn.">The role of non-mycorrhizal fungi in germination of the mycoheterotrophic orchid Pogoniopsis schenckii Cogn.</a> Frontiers in Plant Science. 10, 1589 (2019).</li><li>Martos, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+recruitment+of+saprotrophic+fungi+as+mycorrhizal+partners+by+tropical+achlorophyllous+orchids.">Independent recruitment of saprotrophic fungi as mycorrhizal partners by tropical achlorophyllous orchids.</a> New Phytologist. 184 (3), 668-681 (2009).</li><li>Alves, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+development+and+genetic+structure+of+the+mycoheterotrophic+orchid+Pogoniopsis+schenckii+Cogn.">Reproductive development and genetic structure of the mycoheterotrophic orchid Pogoniopsis schenckii Cogn.</a> BMC Plant Biology. 21 (1), 332 (2021).</li><li>Merckx, V. S. F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycoheterotrophy:+an+introduction.">Mycoheterotrophy: an introduction.</a> Mycoheterotrophy: The Biology of Plants Living on Fungi. , 1-17 (2013).</li><li>Hall, J. L., Hawes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Electron Microscopy of Plant Cells. , (1991).</li></ol>

Анализ изображений в анатомии и морфологии растений имеет важный потенциал для достижения целей и помогает понять взаимосвязи между микогетеротрофными растениями и их незаменимыми грибковыми эндофитами, о чем свидетельствуют исследования подземных органов 6,40<sup cl...

Структурные исследования в ботанике, охватывающие морфологию и анатомию растений, являются базовыми для понимания всего организма 1,2 и обеспечивают необходимые перспективы для интеграции и внесения вклада в знания об экологии, физиологии, развитии и эволюции растений3. Методы в морфологии и анатомии растений в настоящее время включают протоколы, оборудование и знания, разработанные недавно, а также более века назад2. Непрерывное выполнение и адаптация классических методов (например, световая микроскопия) наряду с более современными методами (например, конфокальной микроскопией, рентгеновской микротомографией) имеют одну и ту же существенную основу: теоретические знания, позволяющие разрабатывать методологию.
Основным инструментом в анатомии и морфологии растений является изображение. Несмотря на ошибочное представление о том, что такие анализы являются простыми наблюдениями, давая пространство субъективным интерпретациям2, анализ и понимание изображений в этой области требует знания применяемых методов (оборудование, тип анализа, методологические процедуры), клеточных компонентов, гистохимии и растительного тела (организация и функция тканей, онтогенез, морфологические адаптации). Интерпретация изображений, полученных с помощью различных методов, может привести к корреляции формы и функции, расшифровке химического состава структуры, подтверждению в описании таксонов, пониманию инфекций фитопатогенами и другим подобным оценкам.
При исследовании микогетеротрофных (MH) растений (т.е. нефотосинтезирующих растений, получающих углерод из микоризных грибов 4,5) замечательные аспекты их структурных адаптаций, закономерности колонизации тканей грибами и морфоанатомия подземных органов могут просветить их стратегии развития и отношения с гифами, которые являются источником питательных веществ. Подземные органы растений MH обычно демонстрируют важные адаптации, связанные с их связью с почвенными грибами, поэтому необходимо выполнить эти анатомические и морфологические исследования6. Не следует игнорировать воздушные органы видов MH, так как эндофиты также могут присутствовать в этих тканях, даже если они не являются микоризными грибами (личные наблюдения, пока не опубликованы).
Помимо устоявшейся сущности ассоциации микоризных грибов с видами MH в течение всего их жизненного цикла7, каждый вид орхидеи, даже автотрофный, имеет начальную облигатную микогетеротрофную стадию в естественной среде. Это происходит потому, что эмбрион орхидеи недифференцирован и не имеет эндосперма или семядолий, таким образом, будучи неспособным развиваться и утвердиться в естественной среде без питательной поддержки грибковых партнеров 4,8. Учитывая, что протоколы симбиотического прорастания могут применяться не только к видам MH, но и к фотосинтезирующим орхидеям, с целью изучения специфичности орхидеи-гриба в прорастании и развитии протокормы, широко применяемая методология в инициативах по сохранению угрожаемых видов 9,10,11.
В этой сборке методов мы описываем важные этапы, связанные со сбором, фиксацией и хранением образцов растений MH для анатомических исследований (раздел 1), анализа поверхности и отбора образцов (раздел 2), методов секционирования (от руки: раздел 3, микротомия: секция 4, криомикротомия: секция 5), окрашивание и монтаж (раздел 6), флуоресценция и конфокальная микроскопия грибковых эндофитов (раздел 7), сканирующая электронная микроскопия (секция 8), и просвечивающая электронная микроскопия (раздел 9). Кроме того, мы описываем симбиотический метод прорастания семян орхидей (MH и автотрофный, раздел 10), поскольку ранее упомянутые методы визуализации могут быть успешно применены для анализа грибковой колонизации семян, протокорм и саженцев в процессе прорастания.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63777/63777fig01.jpg"> Рисунок 1: Схематическое обобщение методов визуализации. Схемы содержат указания на этапы протокола, в которых они подробно описаны. Сокращения: GMA = метакрилат гликоля, OCT = соединение оптимальной температуры резания, SEM = сканирующая электронная микроскопия. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63777/63777fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Методам микроскопии, подробно описанным здесь (рисунок 1), предшествуют следующие основные этапы: сбор, фиксация, обезвоживание, встраивание и секционирование образцов. Поскольку этапы являются переменными (рисунок 1) в зависимости от выбранного метода (методов), важно думать заранее, учитывая фиксаторы, которые должны быть подготовлены и транспортированы на место сбора, как образцы должны быть подготовлены перед фиксацией, процессы обезвоживания, которые будут использоваться (раздел 1), а также различные возможности встраивания и методы секционирования (разделы 4, 5, и 9). На рисунке 1 последовательно обобщены все этапы, необходимые для каждого метода микроскопии, подробно описанного ниже.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179124</td>
			<td>(for SEM stubs mounting)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar-agar (AA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1296</td>
			<td>(for seeds germination tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcofluor White Stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18909</td>
			<td>fluorescent dye (detects cellulose)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate Buffer Solution, 0.09M pH 4.8</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2488</td>
			<td>(for toluidine blue O staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive Double-Sided Carbon Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-285-81</td>
			<td>(for SEM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper Grids</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4776</td>
			<td>(for TEM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical-point dryer</td>
			<td>Balzers</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>(= stereomicroscope, any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Entellan</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>107960</td>
			<td>rapid mounting medium for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol, pure (&#8805;99.5%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>459836</td>
			<td>(= ethanol, for dehydration processes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution, 37%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252549</td>
			<td>(for NBF solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td>histological tissue fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin capsules for TEM</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-248-71</td>
			<td>(for resin polymerisation in TEM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin solution, 2% in H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1393</td>
			<td>(dilute for slides preparation - OCT adherence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution, 25%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6257</td>
			<td>(for Karnovsky&#8217;s solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoResin</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>14702231731</td>
			<td>glycol methacrylate (GMA) embedding kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>207772</td>
			<td>(for Lugol solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead(II) nitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>228621</td>
			<td>Pb(NO3)2 (for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR White acrylic resin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9774</td>
			<td>hydrophilic acrylic resin for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lugol solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>62650</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal stubs for specimen mounts</td>
			<td>Rave Scientific</td>
			<td></td>
			<td>(for SEM, different models)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>manual rotary microtome or other model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oatmeal agar (OMA)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>O3506</td>
			<td>(for seeds germination tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Compound, Tissue-Tek</td>
			<td>Sakura Finetek USA</td>
			<td>4583</td>
			<td>embedding medium for frozen tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201030</td>
			<td>OsO4 (for TEM postfixation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793</td>
			<td>sealing thermoplastic film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td>(for Karnovsky&#8217;s solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine solution, 0.1% in H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td>(for slides preparation - OCT adherence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep Slides</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0425</td>
			<td>poly-L-lysine coated glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Molding Cup Trays</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>17177A-3</td>
			<td>(6x8x5 mm, for embbeding samples in GMA resin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Molding Cup Trays</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>17177C-3</td>
			<td>(13x19x5 mm, for embbeding samples in GMA resin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221945</td>
			<td>(for Lugol solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato Dextrose Agar (PDA)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>70139</td>
			<td>(for seeds germination tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscope</td>
			<td>Jeol</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silane [(3-Aminopropyl)triethoxysilane]</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3648</td>
			<td>(for slides preparation - OCT adherence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silane-Prep Slides</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4651</td>
			<td>glass slides coated with silane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel orange, granular</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>10087</td>
			<td>(for dessicating processes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0250</td>
			<td>(for glutaraldehyde-sodium cacodylate buffer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881</td>
			<td>NaOH (for Karnovsky&#8217;s solution preparation and TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>425044</td>
			<td>NaClO (for seeds surface disinfection)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic, anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71640</td>
			<td>Na2HPO4 (for NBF solution and PB preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td>NaH2PO4&#183;H2O (for NBF and PB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sputter coater</td>
			<td>Balzers</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td>C12H22O11 (for cryoprotection and germination test)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan III</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4131</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan IV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>198102</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan Black B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>199664</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(3 mL, any brand, for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter Unit, Millex-GV 0.22 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033R</td>
			<td>PVDF, 33 mm, gamma sterilized (for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tek Bond Super Glue 793</td>
			<td>Tek Bond Saint-Gobain</td>
			<td>78072720018</td>
			<td>liquid cyanoacrylate adhesive, medium viscosity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3260</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Jeol</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triphenyltetrazolium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8877</td>
			<td>(for the tetrazolium test in seeds germination)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1804</td>
			<td>Na3(C6H5O7)&#183;2H2O (for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-607-645</td>
			<td>UO2(CH3COO)2 (for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td>TermoFisher Scientific</td>
			<td>W11261</td>
			<td>fluorescent dye-conjugated lectin (detects sialic acid and N-acetylglucosaminyl residues)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microscopy techniques for interpreting fungal colonization in mycoheterotrophic plants tissues and symbiotic germination of seeds

Структурная ботаника является незаменимой перспективой для полного понимания экологии, физиологии, развития и эволюции растений. При исследовании микогетеротрофных растений (то есть растений, которые получают углерод из грибов) замечательные аспекты их структурных адаптаций, закономерности колонизации тканей грибами и морфоанатомия подземных органов могут просветить их стратегии развития и их отношения с гифами, источником питательных веществ. Еще одна важная роль симбиотических грибов связана с прорастанием семян орхидеи; все виды Orchidaceae являются микогетеротрофными на стадии прорастания и рассады (начальная микогетеротрофия), даже те, которые фотосинтезируют на взрослых стадиях. Из-за отсутствия питательных запасов в семенах орхидей грибковые симбионты необходимы для обеспечения субстратов и обеспечения прорастания. Анализ стадий прорастания по структурным перспективам также может ответить на важные вопросы, касающиеся взаимодействия грибов с семенами. Различные методы визуализации могут быть применены для выявления эндофитов грибов в тканях растений, как предлагается в этой статье. От руки и тонкие участки органов растений можно окрашивать, а затем наблюдать с помощью световой микроскопии. Фторхром, конъюгированный с агглютинином зародышей пшеницы, может быть применен к грибам и инкубирован совместно с Calcofluor White для выделения клеточных стенок растений в конфокальной микроскопии. Кроме того, подробно описаны методологии сканирующей и просвечивающей электронной микроскопии для микогетеротрофных орхидей, а также исследуются возможности применения таких протоколов в родственных растениях. Симбиотическое прорастание семян орхидеи (т.е. в присутствии микоризных грибов) подробно описано в протоколе, наряду с возможностями подготовки структур, полученных с разных стадий прорастания, для анализов с помощью световой, конфокальной и электронной микроскопии.

После существенных этапов фиксации растительной ткани получаются клеточные структуры, максимально сходные с живым состоянием, учитывая морфологию, объем и пространственную организацию клеточных компонентов и тканей16. Наблюдать такие признаки в образцах после химическо...

Watch this Scientific Journal Video about Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds at JoVE.com

Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds

Этот протокол направлен на обеспечение подробных процедур сбора, фиксации и поддержания микогетеротрофных образцов растений, применяя различные методы микроскопии, такие как сканирующая и просвечивающая электронная микроскопия, световая, конфокальная и флуоресцентная микроскопия для изучения грибковой колонизации в тканях растений и семенах, прорастающих микоризными грибами.

Методы микроскопии для интерпретации грибковой колонизации в микогетеротрофных тканях растений и симбиотической прорастания семян

Structural botany is an indispensable perspective to fully understand the ecology, physiology, development, and evolution of plants. When researching ...

В протоколе представлены различные методы микроскопии, применяемые для понимания грибковой колонизации в микогетеротрофных растениях, от сбора до подготовки образцов в деталях и включают основные этапы. Такие методы могут быть применены к различным микогетеротрофическим растениям и даже к растительным материалам, отличным от микогетеротрофики. Этот метод в основном связан со структурной ботаникой, а также может дать представление о микоризных взаимодействиях, физиологии, репродуктивной биологии, эволюции и экологии микогетеротрофных растений.Для начала соберите микогетеротрофные растения, исследуя почву вокруг основания растения, заботясь о том, чтобы не повредить подземные органы. Кроме того, избегайте вытягивания растений из земли, чтобы предотвратить отключение воздушных органов от подземных. Осторожно копайте вокруг воздушных структур, используя садовый мастерок, исследуя подземные органы, такие как корни, стебли, корневища и органы хранения, не повреждая эти структуры.Удалите частицы почвы, чтобы сохранить хрупкие структуры и деликатно промыть эти органы водопроводной водой, чтобы смыть оставшиеся частицы почвы перед фиксацией образцов. Микогетеротрофные растения, связанные с опавшими листьями, требуют дополнительного внимания. Следовательно, тщательно собирайте тонкие органы, связанные с разлагающимся материалом через их гифы, не вытягивая их из связанных структур.Сохраняйте конструкции с такими связями и собирайте подстилку для анализа. Для анализа просвечивающей электронной микроскопии разделите образцы толщиной от 3 до 4 миллиметров внутри капли буфера какодилата натрия глутаральдегида на более мелкие участки толщиной от 1 до 2 миллиметров. Отбросьте обрезанные края за пределы капли.Обеспечьте проведение процесса фиксации на месте сбора сразу после сбора растений. Немедленно перенесите срезы в сборную трубку с объемом фиксатора более чем в 10 раз превышающим объем образцов, так как он является аддитивно-фиксирующим средством. Для поверхностного анализа поверхностных гиф в органах, особенно в подземных и контактирующих с опавшими листьями.Наблюдайте за свежим или фиксированным материалом под рассекающим микроскопом при увеличении 7,5x или выше. Поиск областей интересов руководствуется поверхностными гифами и ризоморфами. Выберите образцы, содержащие области поверхностных ризоморфов, поскольку они могут быть разделены для визуализации пелотонов и гиф в корковых клетках в корнях и стеблях.Готовят 0,2 миллиграмма на миллилитр зародышей пшеницы агглютинина фторхрома конъюгата и 1%калькофтор белого раствора в 0,1 молярном фосфатном буфере, как описано в текстовой рукописи. Теперь высиживают участки на стеклянных горках, правильно покрывая их конъюгатным раствором фторхрома зародышей пшеницы в течение 30 минут. После инкубации промыть участки 0,1 молярной фосфатной буфером и инкубировать их в растворе калькофтора в качестве монтажной среды.Далее поместите крышку на слайды и наблюдайте за ней под конфокальным или флуоресцентным световым микроскопом с помощью указанных фильтров. После фиксации образцов, выполнения обезвоживания и хранения его в 70% этаноле, обнажите любую желаемую поверхность для сканирования электронной микроскопии, используя острое и новое лезвие бритвы, чтобы сделать разрезы с односторонним движением. При необходимости используйте стереомикроскоп для отбора образцов и учета площади металлических заглушек при определении размеров выборки.Далее обезвоживают образцы в этаноловом ряду. Поддерживайте мелкие и деликатные образцы в течение 30 минут в каждой концентрации и более крупные и плотные образцы в течение 1 часа. Затем сложите небольшие конверты, используя папиросную бумагу, чтобы организовать образцы для следующих шагов.Более крупные образцы могут быть обработаны без конверта. Пометьте конверты карандашом и ведите журнал образцов. Осторожно поместите образцы внутрь конвертов с помощью кисти.Теперь храните эти образцы в абсолютном этаноле. Немедленно приступайте к сушке в критических точках, используя сушилку критической точки в соответствии со стандартными рабочими процедурами. Для этого поместите образцы в абсолютный этанол в держатель для образцов и поместите его в барокамеру сушилки критической точки.Промежуточная жидкость растворяется в переходной жидкости в критической точке углекислого газа, тем самым высушивая образцы. Поскольку реабсорбция атмосферной влажности может разрушить образцы, храните их в контейнере для высыхания сразу после высыхания в критической точке. Перед установкой образцов на металлические заглушки наденьте перчатки, чтобы манипулировать заглушками.Погрузите их в ацетон на 5 минут, чтобы удалить жир и дать им высохнуть. Под стереомикроскопом зафиксируйте образцы на заглушке с помощью проводящей двусторонней углеродной клейкой ленты и расположите их. Сайт сверху является единственно возможной перспективой при сканировании изображений электронной микроскопии.Для манипулирования образцами используйте тонкоточечный пинцет. Часть образца, затронутая пинцетом, обычно повреждается. Поэтому будьте осторожны и попробуйте коснуться частей, расположенных вдали от областей интереса.Храните заглушки с образцами в герметичной чашке Петри с силикагелем. Затем приступайте к нанесению слоя золота или платины на поверхность образцов в атмосфере низкого давления инертного газа, следуя стандартным рабочим процедурам. Толщина покрытия зависит от топографии образца и обычно составляет от 15 до 40 нанометров.Наконец, сохраните покрытые оболочкой заглушки в герметичной чашке Петри с силикагелем, удерживающим влажность. Образцы могут храниться таким образом в течение нескольких недель. Используйте сканирующий электронный микроскоп для анализа этих образцов.Электронный пучок ударяет по образцу in vacuo во время сканирующей электронной микроскопии, и излучение сигнала от такого взаимодействия интерпретируется как изображения. Убедитесь, что растворы и материалы, используемые в симбиотическом прорастании семян, стерильны. во избежание загрязнения.Начните с автоклавирования их в течение 20 минут при 121 градусе Цельсия. В ламинарной вытяжке с воздушным потоком поверхностно дезинфицируйте плоды и семена, погружая их в раствор гипохлорита натрия, содержащий 2% активный хлор. Тонкие и хрупкие семена можно погружать в разбавленный раствор гипохлорита натрия 1:1.После дезинфекции восстановите семена, отфильтровав их с помощью ксерографической ткани. Трижды вымойте плоды и семена в автоклавной дистиллированной воде, чтобы удалить раствор гипохлорита, прежде чем приступать к испытаниям на прорастание. При необходимости храните их в конвертах из фильтровальной бумаги внутри стеклянных колб с силикагелем при температуре 4 градуса Цельсия и герметично закрывайте колбы и запечатывайте их пищевой пленкой, затем оцените эффективность процесса промывки, переведя несколько капель воды с последней промывки в картофельный декстрозный агар.Для симбиотического прорастания семян орхидеи инкубируют семена на 1-2 сантиметрах автоклавных дисков из фильтровальной бумаги, помещенных в чашки Петри, содержащие овсяную овсяную акаровую культуральную среду. Теперь привить центр чашки Петри фрагментом питательной среды, содержащей мицелий из выбранного изолированного гриба. Запечатайте чашки Петри пищевой пленкой и высиживайте их в темноте при температуре около 25 градусов цельсия или комнатной температуре, в зависимости от роста грибков.Приготовьте некоторые блюда с семенами и без грибковой прививки в качестве отрицательного контроля для теста на прорастание. Еженедельно анализируйте результаты всхожести, собирая количественные и качественные данные и фотографируя протокормы и саженцы. Ризоморфы могут быть легко распознаны, как правило, как темные, похожие на шнурки структуры.От руки или другие методы получения участков толщиной более 10 микрометров могут лучше демонстрировать пелотоны и предоставлять более репрезентативные изображения грибковых паттернов колонизации. Секции от руки также могут быть пригодны для анализа гиф в более высокой амплификации. Хотя, детали лучше достигаются на более тонких участках.Вторичные клеточные стенки в элементах ксилемы могут быть легко идентифицированы по светлому цвету, который приобретает толуидин. Между тем, элементы флоэмы, состоящие только из первичных клеточных стенок, идентифицируются по их более тонким и темным клеточным стенкам. Артефакты автофлуоресценции можно увидеть в гликолевых срезах метакрилатной смолы.Эти артефакты обычно связаны с концентрацией фторхрома и их можно избежать, промывая образцы большим количеством раз буфером. Раздел корня от руки показывает внутренние и внешние гифы. Этот же орган можно увидеть при сканирующей электронной микроскопии с обилием ризоморфов и отдельных гиф на его поверхности.Большинство видов орхидей прорастают в течение нескольких недель после заражения привитым грибком или почти до более чем месяца. Свет в сканирующей электронной микроскопии может быть применен к цветам, фруктам и семенам для исследования репродуктивной биологии или микогетеротрофных растений. Симбиотическое прорастание семян также может быть проверено на автотрофных орхидеях.

Research

JoVE Journal

Biology

Obtaining Hemocytes from the Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes and Observing their Adherence to Symbiotic and Non-Symbiotic Bacteria

Obtaining Hemocytes from the Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes and Observing their Adherence to Symbiotic and Non-Symbiotic Bacteria

Получение гемоциты от Гавайских бобтейл Squid Euprymna scolopes И наблюдая за их соблюдение Симбиотические и ненасилия в симбиотических бактерий

Studies concerning the role of the immune system in mediating molecular signaling between beneficial bacteria and their hosts have, in recent years, made ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Зажим Patch и перфузии Методы изучения ионных каналов, выраженные в Xenopus Ооцитов

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Тандем Замораживание высокого давления и резких похолоданий Замена тканей растений для просвечивающей электронной микроскопии

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Измерение пространственных и временных Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Сигналы в Arabidopsis растений

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Анализ аутофагии в<em&gt; Пеницилл золотистый</em&gt; С помощью голодания колодки в сочетании с флуоресцентной микроскопии

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Сканирующей электронной микроскопии (SEM) Протоколы для Проблемной завода, оомицет и грибковые Образцы

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

Свет лист флуоресцентной микроскопией корней растений, растущих на поверхности геля

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Характеристика кальцификации событий с использованием живого оптической и электронной микроскопии методы в морской Tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

Простое и эффективное управление и визуализация микрочастиц в системе кровообращения малых рыб с помощью инъекций почек

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

Micron-scale Phenotyping Techniques of Maize Vascular Bundles Based on X-ray Microcomputed Tomography

Мкм шкала фенотипирование методы кукурузы сосудистых пучков, основанный на Microcomputed рентгеновская томография

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a ...