Name: microscopy techniques for interpreting fungal colonization in mycoheterotrophic plants tissues and symbiotic germination of seeds
Uploaded: 2022-05-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds at JoVE.com

Los autores agradecen el financiamiento de FAEPEX y FAPESP (2015/26479-6). MPP agradece a Capes por su beca de maestría (proceso 88887.600591/2021-00) y CNPq. JLSM agradece al CNPq por las becas de productividad (303664/2020-7). Los autores también agradecen el acceso a equipos y asistencia proporcionados por LME (Laboratorio de Microscopía Electrónica - IB/Unicamp), INFABiC (Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología sobre Fotónica Aplicada a la Biología Celular - Unicamp) y LaBiVasc (Laboratorio de Biología Vascular - DBEF/IB/Unicamp); LAMEB (UFSC) y Eliana de Medeiros Oliveira (UFSC) por contribuciones al protocolo de crioprotección; LME para contribuciones al protocolo TEM.

1. Recolectar, fijar y mantener muestras
NOTA: Las plantas totalmente MH generalmente se pueden encontrar en el sotobosque del bosque oscuro 12,13, principalmente en áreas húmedas y abundantes en basura, mientras que las plantas parcialmente MH se pueden encontrar en bosques más abiertos12,13. Las plantas MH generalmente tienen órganos subterráneos bien desa...

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Los análisis de imagen en anatomía y morfología vegetal tienen un potencial importante para cumplir objetivos y ayudar a comprender las relaciones entre las plantas micoheterótrofas y sus endófitos fúngicos indispensables, como lo demuestran los estudios de órganos subterráneos6,40, análisis estructurales de germinación simbiótica de semillas39 y estructuras aéreas y reproductivas 41 . La botánica estru...

La investigación estructural en botánica, que abarca la morfología y anatomía de las plantas, es básica para comprender todo el organismo1,2, y proporciona perspectivas indispensables para integrar y contribuir al conocimiento sobre la ecología, fisiología, desarrollo y evolución de las plantas3. Los métodos en morfología y anatomía vegetal actualmente comprenden protocolos, equipos y conocimientos desarrollados recientemente, así como hace más de un siglo2. La ejecución continua y la adaptación de métodos clásicos (por ejemplo, microscopía óptica) junto con técnicas más recientes (por ejemplo, microscopía confocal, microtomografía de rayos X) tienen la misma base esencial: conocimientos teóricos que permiten el desarrollo de una metodología.
La herramienta principal en anatomía y morfología vegetal es la imagen. A pesar de la idea errónea de que tales análisis son simples observaciones, dando espacio a interpretaciones subjetivas2, el análisis y la comprensión de las imágenes en esta área requieren el conocimiento de los métodos aplicados (el equipo, el tipo de análisis, los procedimientos metodológicos), los componentes celulares, la histoquímica y el cuerpo de la planta (organización y función del tejido, ontogenia, adaptaciones morfológicas). La interpretación de las imágenes obtenidas a través de una variedad de métodos puede conducir a correlacionar forma y función, descifrar la composición química de una estructura, corroborar la descripción de taxones, comprender las infecciones por fitopatógenos y otras evaluaciones similares.
Al investigar plantas micoheterótrofas (MH) (es decir, plantas no fotosintéticas que obtienen carbono de hongos micorrícicos4,5), aspectos notables de sus adaptaciones estructurales, los patrones de colonización tisular por hongos y la morfoanatomía de los órganos subterráneos pueden iluminar sus estrategias de desarrollo y relaciones con las hifas, que son la fuente de nutrientes. Los órganos subterráneos de las plantas MH suelen mostrar importantes adaptaciones relacionadas a su asociación con hongos del suelo, por lo que es esencial realizar estas investigaciones anatómicas y morfológicas6. Los órganos aéreos de las especies MH no deben ser ignorados, ya que los endófitos también pueden estar presentes en estos tejidos, incluso si no son hongos micorrícicos (observaciones personales, aún no publicadas).
Además de la esencialidad bien establecida de la asociación de hongos micorrícicos con especies MH durante todo su ciclo de vida7, todas las especies de orquídeas, incluso las autótrofas, tienen una etapa micoheterotrófica obligada inicial en ambientes naturales. Ocurre porque el embrión de las orquídeas es indiferenciado y carece de endospermo o cotiledones, siendo así incapaz de desarrollarse y establecerse en ambientes naturales sin el apoyo nutricional de socios fúngicos 4,8. Considerando eso, los protocolos de germinación simbiótica pueden ser aplicados no sólo a especies MH sino también a orquídeas fotosintéticas, con el objetivo de investigar la especificidad orquídea-hongo en germinación y desarrollo protocormo, una metodología ampliamente aplicada en iniciativas para la conservación de especies amenazadas 9,10,11.
En este ensamblaje de métodos, describimos pasos importantes involucrados en la recolección, fijación y almacenamiento de muestras de plantas MH para estudios anatómicos (sección 1), análisis de superficie y selección de muestras (sección 2), métodos de seccionamiento (a mano alzada: sección 3, microtomía: sección 4, criomicrotomía: sección 5), tinción y montaje (sección 6), fluorescencia y microscopía confocal de endófitos fúngicos (sección 7), microscopía electrónica de barrido (sección 8), y microscopía electrónica de transmisión (sección 9). Además, describimos un método de germinación simbiótica para semillas de orquídeas (MH y autótrofa, sección 10), ya que los métodos de imagen mencionados anteriormente se pueden aplicar con éxito para analizar la colonización fúngica de semillas, protocormos y plántulas en el proceso de germinación.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63777/63777fig01.jpg"> Figura 1: Resumen esquemático de los métodos de imagen. Los esquemas proporcionan indicaciones de los pasos del protocolo en los que se detallan. Abreviaturas: GMA = metacrilato de glicol, OCT = compuesto de temperatura de corte óptima, SEM = microscopía electrónica de barrido. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63777/63777fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Las técnicas de microscopía descritas aquí en detalle (Figura 1) están precedidas por los siguientes pasos esenciales: recolectar, fijar, deshidratar, incrustar y seccionar muestras. Como los pasos son variables (Figura 1) dependiendo de la(s) técnica(s) elegida(s), es importante pensar en el futuro, considerando los fijadores que se prepararán y transportarán al sitio de recolección, cómo se deben preparar las muestras antes de la fijación, los procesos de deshidratación que se utilizarán (sección 1) y las diferentes posibilidades de incrustación y métodos de seccionamiento (secciones 4, 5, y 9). La Figura 1 resume secuencialmente todos los pasos requeridos para cada técnica de microscopía que se describen a continuación.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179124</td>
			<td>(for SEM stubs mounting)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar-agar (AA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1296</td>
			<td>(for seeds germination tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcofluor White Stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18909</td>
			<td>fluorescent dye (detects cellulose)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate Buffer Solution, 0.09M pH 4.8</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2488</td>
			<td>(for toluidine blue O staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive Double-Sided Carbon Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-285-81</td>
			<td>(for SEM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper Grids</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4776</td>
			<td>(for TEM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical-point dryer</td>
			<td>Balzers</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>(= stereomicroscope, any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Entellan</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>107960</td>
			<td>rapid mounting medium for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol, pure (&#8805;99.5%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>459836</td>
			<td>(= ethanol, for dehydration processes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution, 37%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252549</td>
			<td>(for NBF solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td>histological tissue fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin capsules for TEM</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-248-71</td>
			<td>(for resin polymerisation in TEM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin solution, 2% in H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1393</td>
			<td>(dilute for slides preparation - OCT adherence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution, 25%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6257</td>
			<td>(for Karnovsky&#8217;s solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoResin</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>14702231731</td>
			<td>glycol methacrylate (GMA) embedding kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>207772</td>
			<td>(for Lugol solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead(II) nitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>228621</td>
			<td>Pb(NO3)2 (for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR White acrylic resin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9774</td>
			<td>hydrophilic acrylic resin for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lugol solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>62650</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal stubs for specimen mounts</td>
			<td>Rave Scientific</td>
			<td></td>
			<td>(for SEM, different models)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>manual rotary microtome or other model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oatmeal agar (OMA)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>O3506</td>
			<td>(for seeds germination tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Compound, Tissue-Tek</td>
			<td>Sakura Finetek USA</td>
			<td>4583</td>
			<td>embedding medium for frozen tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201030</td>
			<td>OsO4 (for TEM postfixation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793</td>
			<td>sealing thermoplastic film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td>(for Karnovsky&#8217;s solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine solution, 0.1% in H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td>(for slides preparation - OCT adherence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep Slides</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0425</td>
			<td>poly-L-lysine coated glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Molding Cup Trays</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>17177A-3</td>
			<td>(6x8x5 mm, for embbeding samples in GMA resin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Molding Cup Trays</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>17177C-3</td>
			<td>(13x19x5 mm, for embbeding samples in GMA resin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221945</td>
			<td>(for Lugol solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato Dextrose Agar (PDA)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>70139</td>
			<td>(for seeds germination tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscope</td>
			<td>Jeol</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silane [(3-Aminopropyl)triethoxysilane]</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3648</td>
			<td>(for slides preparation - OCT adherence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silane-Prep Slides</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4651</td>
			<td>glass slides coated with silane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel orange, granular</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>10087</td>
			<td>(for dessicating processes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0250</td>
			<td>(for glutaraldehyde-sodium cacodylate buffer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881</td>
			<td>NaOH (for Karnovsky&#8217;s solution preparation and TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>425044</td>
			<td>NaClO (for seeds surface disinfection)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic, anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71640</td>
			<td>Na2HPO4 (for NBF solution and PB preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td>NaH2PO4&#183;H2O (for NBF and PB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sputter coater</td>
			<td>Balzers</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td>C12H22O11 (for cryoprotection and germination test)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan III</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4131</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan IV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>198102</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan Black B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>199664</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(3 mL, any brand, for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter Unit, Millex-GV 0.22 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033R</td>
			<td>PVDF, 33 mm, gamma sterilized (for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tek Bond Super Glue 793</td>
			<td>Tek Bond Saint-Gobain</td>
			<td>78072720018</td>
			<td>liquid cyanoacrylate adhesive, medium viscosity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3260</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Jeol</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triphenyltetrazolium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8877</td>
			<td>(for the tetrazolium test in seeds germination)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1804</td>
			<td>Na3(C6H5O7)&#183;2H2O (for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-607-645</td>
			<td>UO2(CH3COO)2 (for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td>TermoFisher Scientific</td>
			<td>W11261</td>
			<td>fluorescent dye-conjugated lectin (detects sialic acid and N-acetylglucosaminyl residues)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microscopy techniques for interpreting fungal colonization in mycoheterotrophic plants tissues and symbiotic germination of seeds

La botánica estructural es una perspectiva indispensable para comprender completamente la ecología, la fisiología, el desarrollo y la evolución de las plantas. Al investigar plantas micoheterótrofas (es decir, plantas que obtienen carbono de hongos), aspectos notables de sus adaptaciones estructurales, los patrones de colonización tisular por hongos y la morfoanatomía de los órganos subterráneos pueden iluminar sus estrategias de desarrollo y sus relaciones con las hifas, la fuente de nutrientes. Otro papel importante de los hongos simbióticos está relacionado con la germinación de las semillas de orquídeas; todas las especies de Orchidaceae son micoheterótrofas durante la germinación y la etapa de plántula (micoheterotrofia inicial), incluso las que fotosintetizan en etapas adultas. Debido a la falta de reservas nutricionales en las semillas de orquídeas, los simbiontes fúngicos son esenciales para proporcionar sustratos y permitir la germinación. El análisis de las etapas de germinación desde perspectivas estructurales también puede responder preguntas importantes sobre la interacción de los hongos con las semillas. Se pueden aplicar diferentes técnicas de imagen para revelar hongos endófitos en tejidos vegetales, como se propone en este artículo. Las secciones a mano alzada y delgadas de los órganos de la planta se pueden teñir y luego observar mediante microscopía óptica. Un fluorocromo conjugado con aglutinina de germen de trigo se puede aplicar a los hongos y co-incubar con Calcofluor White para resaltar las paredes celulares de las plantas en microscopía confocal. Además, se detallan las metodologías de microscopía electrónica de barrido y transmisión para orquídeas micoheterótrofas, y se exploran las posibilidades de aplicar dichos protocolos en plantas relacionadas. La germinación simbiótica de semillas de orquídeas (es decir, en presencia de hongos micorrícicos) se describe en detalle en el protocolo, junto con las posibilidades de preparar las estructuras obtenidas de diferentes etapas de germinación para análisis con microscopía óptica, confocal y electrónica.

Siguiendo las etapas esenciales de fijación del tejido vegetal se obtienen estructuras celulares lo más similares posible al estado vivo, considerando la morfología, el volumen y la organización espacial de los componentes y tejidos celulares16. Observe tales rasgos en las muestras después de la fijación química (Figura 4). La figura 4C-F representa muestras fijadas adecuadamente bajo microscopía ...

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Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds

Este protocolo tiene como objetivo proporcionar procedimientos detallados para recolectar, fijar y mantener muestras de plantas micoheterótrofas, aplicando diferentes técnicas de microscopía como microscopía electrónica de barrido y transmisión, microscopía de luz, confocal y fluorescencia para estudiar la colonización fúngica en tejidos vegetales y semillas germinadas con hongos micorrícicos.

Técnicas de microscopía para interpretar la colonización fúngica en tejidos de plantas micoheterótrofas y germinación simbiótica de semillas

Structural botany is an indispensable perspective to fully understand the ecology, physiology, development, and evolution of plants. When researching ...

El protocolo presenta diversas técnicas de microscopía aplicadas para comprender la colonización fúngica en plantas micoheterótrofas, desde la recolección hasta la preparación de muestras en detalle e incluyen pasos esenciales. Tales técnicas se pueden aplicar a varias plantas micoheterótrofas, e incluso a materiales de una planta que no sean micoheterótrofos. Este método está relacionado principalmente con la botánica estructural y también podría proporcionar información sobre las interacciones micorrízicas, la fisiología, la biología reproductiva, la evolución y la ecología de las plantas micoheterótrofas.Para comenzar, recolecte las plantas micoheterótrofas explorando el suelo alrededor de la base de la planta, teniendo cuidado de no dañar los órganos subterráneos. Además, evita tirar de las plantas del suelo para evitar desconectar los órganos aéreos de los subterráneos. Con cuidado, cava alrededor de las estructuras aéreas usando una paleta de jardinería mientras exploras los órganos subterráneos como raíces, tallos, rizomas y órganos de almacenamiento sin dañar estas estructuras.Retire las partículas de tierra para preservar las estructuras frágiles y lave delicadamente estos órganos con agua del grifo para enjuagar las partículas restantes del suelo antes de fijar las muestras. Las plantas micoheterótrofas asociadas con la hojarasca exigen atención adicional. Por lo tanto, recoja cuidadosamente los delicados órganos conectados al material en descomposición a través de sus hifas sin tirar de ellos de las estructuras conectadas.Conserve las estructuras con tales conexiones y recoja la basura para su análisis. Para el análisis de microscopía electrónica de transmisión, divida las muestras de 3 a 4 milímetros de espesor dentro de una gota de tampón de cacodilato de sodio de glutaraldehído en secciones más pequeñas de 1 a 2 milímetros de espesor. Deseche los bordes cortados fuera de la gota.Asegúrese de llevar a cabo el proceso de fijación en el sitio de recolección inmediatamente después de la recolección de las plantas. Transfiera inmediatamente las secciones a un tubo de recolección con un volumen de fijador más de 10 veces mayor que el volumen de las muestras, ya que es un fijador aditivo. Para el análisis superficial de las hifas superficiales en los órganos, especialmente en los subterráneos y aquellos en contacto con la hojarasca.Observe material fresco o fijo bajo el microscopio de disección con un aumento de 7,5x o más. Búsqueda de las áreas de interés guiada por las hifas superficiales y los rizomorfos. Seleccione las muestras que contienen áreas de rizomorfos superficiales, ya que se pueden seccionar para visualizar pelotones y bobinas de hifas dentro de las células corticales en raíces y tallos.Prepare 0,2 miligramos por mililitro de conjugado de fluorocromo de aglutinina de germen de trigo y soluciones blancas de calcofluor al 1% en tampón fosfato molar al 0,1 como se describe en el texto manuscrito. Ahora, incube las secciones en portaobjetos de vidrio cubriéndolas adecuadamente con una solución conjugada de fluorocromo de aglutinina de germen de trigo durante 30 minutos. Después de la incubación, lavar las secciones con tampón fosfato molar 0,1 e incubarlas en la solución de calcofluor como medio de montaje.A continuación, coloque los cubreobjetos en los portaobjetos y obsérvelo bajo un microscopio de luz confocal o fluorescente utilizando los filtros indicados. Después de fijar las muestras, realizar la deshidratación y almacenarlas en etanol al 70%, exponga cualquier superficie deseada para el análisis de microscopía electrónica de barrido utilizando una cuchilla de afeitar afilada y nueva para hacer cortes con un movimiento unidireccional. Si es necesario, use un microscopio estereoscópico para seleccionar las muestras y considere el área de los talones metálicos mientras determina los tamaños de las muestras.Además, deshidratar las muestras en una serie etanólica. Mantenga muestras pequeñas y delicadas durante 30 minutos en cada concentración y muestras más grandes y densas durante 1 hora. A continuación, doble los sobres pequeños con papel de seda para organizar las muestras para los siguientes pasos.Las muestras más grandes se pueden manipular sin un sobre. Etiquete los sobres con un lápiz y mantenga un registro de las muestras. Con cuidado, coloque las muestras dentro de los sobres con un pincel.Ahora, mantenga estas muestras en etanol absoluto. Proceda inmediatamente con el secado de puntos críticos operando un secador de puntos críticos de acuerdo con los procedimientos operativos estándar. Para ello, coloque las muestras en etanol absoluto en un portamuestras y colóquelas dentro de la cámara de presión del secador de punto crítico.El fluido intermedio se disuelve en el fluido de transición en el punto crítico de dióxido de carbono, secando así las muestras. Como la reabsorción de la humedad atmosférica puede destruir las muestras, guárdelas en un recipiente de desecación inmediatamente después del secado del punto crítico. Antes de montar las muestras en talones de metal, póngase los guantes para manipular los talones.Sumérgelas en acetona durante 5 minutos para eliminar cualquier grasa y déjalas secar. Bajo un microscopio estéreo, fije las muestras en el talón con una cinta adhesiva de carbono conductora de doble cara y colóquelas. El sitio desde arriba es la única perspectiva posible en las imágenes de microscopía electrónica de barrido.Para manipular las muestras, utilice pinzas de punta fina. La parte de la muestra tocada por las pinzas generalmente está dañada. Así que tenga cuidado e intente tocar las partes colocadas lejos de las áreas de interés.Mantenga los talones con muestras en una placa de Petri sellada con gel de sílice. A continuación, proceda con el recubrimiento por pulverización catódica para depositar una capa de oro o platino en la superficie de las muestras en una atmósfera de baja presión de gas inerte siguiendo los procedimientos operativos estándar. El espesor del recubrimiento depende de la topografía de la muestra y suele estar entre 15 y 40 nanómetros.Finalmente, mantenga los talones recubiertos en una placa de Petri sellada con gel de sílice que retenga la humedad. Las muestras se pueden almacenar de esta manera durante semanas. Utilice un microscopio electrónico de barrido para analizar estas muestras.Un haz de electrones golpea la muestra en vacío durante la microscopía electrónica de barrido y la emisión de señal de dicha interacción se interpreta como imágenes. Asegúrese de que las soluciones y materiales utilizados en la germinación simbiótica de las semillas sean estériles. para evitar la contaminación.Comience por esterilizarlos en autoclave durante 20 minutos a 121 grados centígrados. En una campana de flujo de aire laminar, desinfecte superficialmente las frutas y semillas sumergiéndolas en una solución de hipoclorito de sodio que contenga 2% de cloro activo. Las semillas delgadas y frágiles se pueden sumergir en una solución diluida de hipoclorito de sodio 1:1.Después de la desinfección recuperar las semillas filtrándolas con tejido xerográfico. Lave las frutas y semillas tres veces en agua destilada esterilizada en autoclave para eliminar la solución de hipoclorito antes de proceder con las pruebas de germinación. Si es necesario, guárdelos en sobres de papel de filtro dentro de matraces de vidrio con gel de sílice a 4 grados centígrados y cierre herméticamente los matraces y séllelos con película adhesiva, luego evalúe la efectividad del proceso de lavado transfiriendo algunas gotas de agua del último lavado al agar dextrosa de papa.Para la germinación simbiótica de las semillas de orquídeas, incubar las semillas sobre discos de papel de filtro esterilizados en autoclave de 1 a 2 centímetros colocados en placas de Petri que contienen medio de cultivo de agar avena. Ahora, inocular el centro de la placa de Petri con el fragmento de medio de cultivo que contiene micelio del hongo aislado elegido. Selle las placas de Petri con película adhesiva e incubarlas en la oscuridad a unos 25 grados centígrados o temperatura ambiente, dependiendo del crecimiento de hongos.Preparar algunos platos con semillas y sin inoculación fúngica como control negativo para la prueba de germinación. Analice los resultados de germinación semanalmente mediante la recopilación de datos cuantitativos y cualitativos y la fotografía de protocormos y plántulas. Los rizomorfos se pueden reconocer fácilmente generalmente como estructuras oscuras, similares a cordones.A mano alzada u otros métodos para obtener secciones de más de 10 micrómetros de espesor pueden evidenciar mejor los pelotones y proporcionar imágenes más representativas de los patrones fúngicos de colonización. Las secciones a mano alzada también pueden ser adecuadas para el análisis de hifas en amplificación más alta. Aunque, los detalles se logran mejor en secciones más delgadas.Las paredes celulares secundarias en los elementos del xilema se pueden identificar fácilmente por el color claro que adquiere la toluidina. Mientras tanto, los elementos del floema compuestos solo de paredes celulares primarias se identifican por sus paredes celulares más delgadas y oscuras. Los artefactos por autofluorescencia se pueden ver en secciones de resina de metacrilato de glicol.Estos artefactos generalmente están relacionados con la concentración de fluorocromo y se pueden evitar lavando las muestras un mayor número de veces con el tampón. La sección a mano alzada de la raíz muestra hifas internas y externas. El mismo órgano se puede ver mediante microscopía electrónica de barrido con una gran cantidad de rizomorfos e hifas individuales en su superficie.La mayoría de las especies de orquídeas germinan dentro de algunas semanas después de haber sido infectadas por el hongo inoculado o hasta casi más de un mes. La luz en la microscopía electrónica de barrido se puede aplicar a flores, frutas y semillas para investigar la biología reproductiva o las plantas micoheterótrofas. La germinación simbiótica de las semillas también se puede probar en orquídeas autótrofas.

Research

JoVE Journal

Biology

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La obtención de hemocitos de la hawaiana Squid Bobtail Euprymna scolopes Y la observación de su adhesión a las bacterias simbióticas y no simbióticas-

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Investigación

Biología

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Patch clamp y técnicas de perfusión para el estudio de los canales iónicos expresados ​​en Xenopus Ovocitos

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Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

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Medición Espacial y Temporal Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Las señales en plantas de Arabidopsis

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