Name: microscopy techniques for interpreting fungal colonization in mycoheterotrophic plants tissues and symbiotic germination of seeds
Uploaded: 2022-05-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds at JoVE.com

Författarna tackar finansiering från FAEPEX och FAPESP (2015/26479-6). MPP tackar Capes för hans magisterexamen stipendium (process 88887.600591/2021-00) och CNPq. JLSM tackar CNPq för produktivitetsbidrag (303664/2020-7). Författarna tackar också tillgången till utrustning och hjälp från LME (Laboratory of Electron Microscopy - IB / Unicamp), INFABiC (National Institute of Science and Technology on Photonics Applied to Cell Biology - Unicamp) och LaBiVasc (Laboratory of Vascular Biology - DBEF / IB / Unicamp); LAMEB (UFSC) och Eliana de Medeiros Oliveira (UFSC) för bidrag till kryoskyddsprotokollet; LME för bidrag till TEM-protokollet.

1. Insamling, fixering och underhåll av prover
OBS: Helt MH-växter kan vanligtvis hittas i den mörka skogen understory 12,13, främst i fuktiga och kullrika områden, medan delvis MH-växter finns i mer öppna skogar12,13. MH-växter har vanligtvis välutvecklade underjordiska organ i olika former och storlekar.
<ol><li>När du samlar MH-arter, utforska jo...

<ol>
	<li>Evert, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Esau&#8217;s Plant Anatomy: Meristems, Cells, and Tissues of the Plant Body: Their Structure, Function, and Development. , (2006).</li><li>Yeung, E. C. T., Stasolla, C., Sumner, M. J., Huang, B. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plant Microtechniques and Protocols. , (2015).</li><li>Sokoloff, D. D., Jura-Morawiec, J., Zoric, L., Fay, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+anatomy:+at+the+heart+of+modern+botany.">Plant anatomy: at the heart of modern botany.</a> Botanical Journal of the Linnean Society. 195 (3), 249-253 (2021).</li><li>Leake, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+myco-heterotrophic+(&#8216;saprophytic&#8217;)+plants.">The biology of myco-heterotrophic (&#8216;saprophytic&#8217;) plants.</a> New Phytologist. 127 (2), 171-216 (1994).</li><li>Bidartondo, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolutionary+ecology+of+myco-heterotrophy.">The evolutionary ecology of myco-heterotrophy.</a> New Phytologist. 167 (2), 335-352 (2005).</li><li>Imhof, S., Massicotte, H. B., Melville, L. H., Peterson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subterranean+morphology+and+mycorrhizal+structures.">Subterranean morphology and mycorrhizal structures.</a> Mycoheterotrophy. , 157-214 (2013).</li><li>Rasmussen, H. N., Rasmussen, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchid+mycorrhiza:+implications+of+a+mycophagous+life+style.">Orchid mycorrhiza: implications of a mycophagous life style.</a> Oikos. 118 (3), 334-345 (2009).</li><li>Rasmussen, H. N., Dixon, K. W., Jers&#225;kov&#225;, J., T&#283;&#353;itelov&#225;, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+and+seedling+establishment+in+orchids:+a+complex+of+requirements.">Germination and seedling establishment in orchids: a complex of requirements.</a> Annals of Botany. 116 (3), 391-402 (2015).</li><li>Zettler, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terrestrial+orchid+conservation+by+symbiotic+seed+germination:+techniques+and+perspectives.">Terrestrial orchid conservation by symbiotic seed germination: techniques and perspectives.</a> Selbyana. 18 (2), 188-194 (1997).</li><li>Stewart, S. L., Kane, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symbiotic+seed+germination+and+evidence+for+in+vitro+mycobiont+specificity+in+Spiranthes+brevilabris+(Orchidaceae)+and+its+implications+for+species-level+conservation.">Symbiotic seed germination and evidence for in vitro mycobiont specificity in Spiranthes brevilabris (Orchidaceae) and its implications for species-level conservation.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Plant. 43 (3), 178-186 (2007).</li><li>Zhao, D. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchid+reintroduction+based+on+seed+germination-promoting+mycorrhizal+fungi+derived+from+protocorms+or+seedlings.">Orchid reintroduction based on seed germination-promoting mycorrhizal fungi derived from protocorms or seedlings.</a> Frontiers in Plant Science. 12, 701152 (2021).</li><li>Selosse, M. A., Roy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+plants+that+feed+on+fungi:+facts+and+questions+about+mixotrophy.">Green plants that feed on fungi: facts and questions about mixotrophy.</a> Trends in Plant Science. 14 (2), 64-70 (2009).</li><li>Merckx, V. S. F. T., Mennes, C. B., Peay, K. G., Geml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+diversification.">Evolution and diversification.</a> Mycoheterotrophy: The Biology of Plants Living on Fungi. , 215-244 (2013).</li><li>Boon, M. E., Drijver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routine+Cytological+Staining+Techniques:+Theoretical+Background+and+Practice.">Routine Cytological Staining Techniques: Theoretical Background and Practice.</a> Macmillan International Higher Education. , (1986).</li><li>Karnovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+formaldehyde-glutaraldehyde+fixative+of+high+osmolality+for+use+in+electron+microscopy.">A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 27 (2), 137-138 (1964).</li><li>Hayat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fixation for Electron Microscopy. , (1981).</li><li>Roland, J. C., Vian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+preparation+and+staining+of+thin+sections.">General preparation and staining of thin sections.</a> Electron Microscopy of Plant Cells. 1, 675 (1991).</li><li>Gerrits, P. O., Horobin, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycol+methacrylate+embedding+for+light+microscopy:+basic+principles+and+trouble-shooting.">Glycol methacrylate embedding for light microscopy: basic principles and trouble-shooting.</a> Journal of Histotechnology. 19 (4), 297-311 (1996).</li><li>Zhang, Z., Niu, L., Chen, X., Xu, X., Ru, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+plant+cryosection.">Improvement of plant cryosection.</a> Frontiers in Biology. 7 (4), 374-377 (2012).</li><li>Bene&#352;, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+media+improving+freeze-sectioning+of+plant+material.">On the media improving freeze-sectioning of plant material.</a> Biologia Plantarum. 15 (1), 50-56 (1973).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+slides+and+coverslips+for+microscopy.">Preparation of slides and coverslips for microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (5), (2008).</li><li>Sakai, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+method+for+differential+staining+of+paraffin+embedded+plant+material+using+toluidine+blue+O.">Simple method for differential staining of paraffin embedded plant material using toluidine blue O.</a> Stain Technology. 48 (5), 247-249 (1973).</li><li>O&#8217;Brien, T., Feder, N., McCully, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polychromatic+staining+of+plant+cell+walls+by+toluidine+blue+O.">Polychromatic staining of plant cell walls by toluidine blue O.</a> Protoplasma. 59 (2), 368-373 (1964).</li><li>Ventrella, M. C., Almeida, A. L., Nery, L. A., Coelho, V. P. d. e. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#233;todos+Histoqu&#237;micos+Aplicados+&#224;s+Sementes.">M&#233;todos Histoqu&#237;micos Aplicados &#224;s Sementes.</a> Universidade Federal de Vi&#231;osa. , (2013).</li><li>Pearse, A. G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histochemistry, Theoretical and Applied. , (1960).</li><li>Andrade-Linares, D. R., Franken, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+endophytes+in+plant+roots:+taxonomy,+colonization+patterns,+and+functions.">Fungal endophytes in plant roots: taxonomy, colonization patterns, and functions.</a> Symbiotic Endophytes. , 311-334 (2013).</li><li>Wymer, C. L., Beven, A. F., Boudonck, K., Lloyd, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy+of+plant+cells.">Confocal microscopy of plant cells.</a> Confocal Microscopy Methods and Protocols. , 103-130 (1999).</li><li>Marques, J. P. R., Soares, M. K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+de+T&#233;cnicas+Aplicadas+&#224;+Histopatologia+Vegetal.">Manual de T&#233;cnicas Aplicadas &#224; Histopatologia Vegetal.</a> FEALQ. , (2021).</li><li>Navarro, B. L., Marques, J. P. R., Appezzato-da-Gl&#243;ria, B., Sp&#243;sito, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histopathology+of+Phakopsora+euvitis+on+Vitis+vinifera.">Histopathology of Phakopsora euvitis on Vitis vinifera.</a> European Journal of Plant Pathology. 154 (4), 1185-1193 (2019).</li><li>Marques, J. P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugarcane+cell+wall-associated+defense+responses+to+infection+by+Sporisorium+scitamineum.">Sugarcane cell wall-associated defense responses to infection by Sporisorium scitamineum.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 698 (2018).</li><li>Jeffree, C. E., Read, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ambient-and+low-temperature+scanning+electron+microscopy.">Ambient-and low-temperature scanning electron microscopy.</a> Electron Microscopy of Plant Cells. , 313-413 (1991).</li><li>Bozzola, J. J., Russell, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Electron Microscopy: Principles and Techniques for Biologists. , (1999).</li><li>Murray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+transmission+and+scanning+electron+microscopy.">Basic transmission and scanning electron microscopy.</a> Introduction to electron Microscopy for Biologists. , 3-18 (2008).</li><li>. Glossary of TEM terms Available from: <a target="_blank" href="https://www.jeol.co.jp/en/words/emterms/">https://www.jeol.co.jp/en/words/emterms/</a> (2021)</li><li>Seaton, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchid+seed+and+pollen:+a+toolkit+for+long-term+storage,+viability+assessment+and+conservation.">Orchid seed and pollen: a toolkit for long-term storage, viability assessment and conservation.</a> Orchid Propagation: From Laboratories to Greenhouses&#8212;Methods and Protocols. , 71-98 (2018).</li><li>Otero, J. T., Ackerman, J. D., Bayman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+mycorrhizal+preferences+between+two+tropical+orchids.">Differences in mycorrhizal preferences between two tropical orchids.</a> Molecular Ecology. 13 (8), 2393-2404 (2004).</li><li>Koch, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marasmioid+rhizomorphs+in+bird+nests:+Species+diversity,+functional+specificity,+and+new+species+from+the+tropics.">Marasmioid rhizomorphs in bird nests: Species diversity, functional specificity, and new species from the tropics.</a> Mycologia. 112 (6), 1086-1103 (2020).</li><li>Webster, J., Weber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Introduction to Fungi. , (2007).</li><li>Sisti, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+non-mycorrhizal+fungi+in+germination+of+the+mycoheterotrophic+orchid+Pogoniopsis+schenckii+Cogn.">The role of non-mycorrhizal fungi in germination of the mycoheterotrophic orchid Pogoniopsis schenckii Cogn.</a> Frontiers in Plant Science. 10, 1589 (2019).</li><li>Martos, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+recruitment+of+saprotrophic+fungi+as+mycorrhizal+partners+by+tropical+achlorophyllous+orchids.">Independent recruitment of saprotrophic fungi as mycorrhizal partners by tropical achlorophyllous orchids.</a> New Phytologist. 184 (3), 668-681 (2009).</li><li>Alves, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+development+and+genetic+structure+of+the+mycoheterotrophic+orchid+Pogoniopsis+schenckii+Cogn.">Reproductive development and genetic structure of the mycoheterotrophic orchid Pogoniopsis schenckii Cogn.</a> BMC Plant Biology. 21 (1), 332 (2021).</li><li>Merckx, V. S. F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycoheterotrophy:+an+introduction.">Mycoheterotrophy: an introduction.</a> Mycoheterotrophy: The Biology of Plants Living on Fungi. , 1-17 (2013).</li><li>Hall, J. L., Hawes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Electron Microscopy of Plant Cells. , (1991).</li></ol>

Bildanalyser inom växtanatomi och morfologi har en viktig potential att uppfylla mål och hjälpa till att förstå sambanden mellan mykoheterotrofa växter och deras oumbärliga svampendofyter, vilket framgår av studier av underjordiska organ6,40, strukturella analyser av symbiotisk spiring av frön39 och luft- och reproduktionsstrukturer 41 . Strukturell botanik, trots att den har förlorat sin prestige och sitt...

Strukturforskning inom botanik, som omfattar växtmorfologi och anatomi, är grundläggande för att förstå hela organismen1,2 och ger oumbärliga perspektiv för att integrera och bidra till kunskap om växters ekologi, fysiologi, utveckling och utveckling3. Metoder inom växtmorfologi och anatomi omfattar för närvarande protokoll, utrustning och kunskap som utvecklats nyligen såväl som för mer än ett sekel sedan2. Det kontinuerliga utförandet och anpassningen av klassiska metoder (t.ex. ljusmikroskopi) tillsammans med nyare tekniker (t.ex. konfokalmikroskopi, röntgenmikrotomografi) har samma väsentliga grund: teoretisk kunskap som möjliggör utveckling av en metod.
Huvudverktyget i växtanatomi och morfologi är bilden. Trots missuppfattningen att sådana analyser är enkla observationer, vilket ger utrymme för subjektiva tolkningar2, kräver analys och förståelse av bilder inom detta område kunskap om de metoder som tillämpas (utrustning, typ av analys, metodologiska förfaranden), cellkomponenter, histokemi och växtkroppen (vävnadsorganisation och funktion, ontogeni, morfologiska anpassningar). Tolkning av de bilder som erhållits via en mängd olika metoder kan leda till korrelerande form och funktion, dechiffrera den kemiska sammansättningen av en struktur, bekräfta i beskrivningen av taxa, förstå infektioner av fytopatogener och andra sådana bedömningar.
När man undersöker mykoheterotrofa (MH) växter (dvs. icke-fotosyntetiska växter som erhåller kol från mykorrhizasvampar4,5), kan anmärkningsvärda aspekter av deras strukturella anpassningar, mönstren för vävnadskolonisering av svampar och morfoanatomin hos underjordiska organ upplysa deras utvecklingsstrategier och relationer med hyfer, som är källan till näringsämnen. De underjordiska organen hos MH-växter visar vanligtvis viktiga anpassningar relaterade till deras förening med marksvampar, därför är det viktigt att utföra dessa anatomiska och morfologiska undersökningar6. MH-arters luftorgan bör inte ignoreras, eftersom endofyter också kan finnas i dessa vävnader, även om de inte är mykorrhizasvampar (personliga observationer, inte publicerade ännu).
Förutom den väletablerade väsentligheten hos mykorrhizasvampar som associeras med MH-arter under hela deras livscykel7, har varje orkidéart, även de autotrofa, ett initialt obligatoriskt mykoheterotrofiskt stadium i naturliga miljöer. Det uppstår eftersom orkidéernas embryo är odifferentierat och saknar endosperm eller kotyledoner, vilket är oförmöget att utveckla och etablera sig i naturliga miljöer utan näringsstöd från svamppartners 4,8. Med tanke på detta kan symbiotiska grobarhetsprotokoll tillämpas inte bara på MH-arter utan också på fotosyntetiserande orkidéer, som syftar till att undersöka orkidé-svampspecificitet vid grobarhet och protocormutveckling, en mycket tillämpad metod i initiativ för bevarande av hotade arter 9,10,11.
I denna metodsammansättning beskriver vi viktiga steg som är involverade i insamling, fixering och lagring av MH-växtprover för anatomiska studier (avsnitt 1), ytanalys och provval (avsnitt 2), sektionsmetoder (frihand: avsnitt 3, mikrotomi: avsnitt 4, kryomikrotomi: avsnitt 5), färgning och montering (avsnitt 6), fluorescens och konfokalmikroskopi av svampendofyter (avsnitt 7), svepelektronmikroskopi (avsnitt 8), och transmissionselektronmikroskopi (avsnitt 9). Dessutom beskriver vi en symbiotisk grobarhetsmetod för orkidéfrön (MH och autotrofisk, avsnitt 10), eftersom de tidigare nämnda avbildningsmetoderna framgångsrikt kan tillämpas för att analysera svampkolonisering av frön, protokormer och plantor i groningsprocessen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63777/63777fig01.jpg"> Figur 1: Schematisk sammanfattning av avbildningsmetoder. Scheman ger indikationer på protokollsteg där de är detaljerade. Förkortningar: GMA = glykolmetakrylat, OCT = optimal skärtemperaturförening, SEM = svepelektronmikroskopi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63777/63777fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
De mikroskopitekniker som beskrivs här i detalj (figur 1) föregås av följande viktiga steg: insamling, fixering, uttorkning, inbäddning och sektionering av prover. Eftersom stegen är variabla (figur 1) beroende på den eller de valda teknikerna är det viktigt att tänka framåt, med tanke på de fixeringsmedel som ska beredas och transporteras till uppsamlingsplatsen, hur proverna måste beredas innan de fixeras, de uttorkningsprocesser som ska användas (avsnitt 1) och olika inbäddningsmöjligheter och sektioneringsmetoder (avsnitt 4, 5). och 9). Figur 1 sammanfattar sekventiellt alla steg som krävs för varje mikroskopiteknik som beskrivs noggrant nedan.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179124</td>
			<td>(for SEM stubs mounting)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar-agar (AA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1296</td>
			<td>(for seeds germination tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcofluor White Stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18909</td>
			<td>fluorescent dye (detects cellulose)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate Buffer Solution, 0.09M pH 4.8</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2488</td>
			<td>(for toluidine blue O staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive Double-Sided Carbon Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-285-81</td>
			<td>(for SEM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper Grids</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4776</td>
			<td>(for TEM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical-point dryer</td>
			<td>Balzers</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>(= stereomicroscope, any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Entellan</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>107960</td>
			<td>rapid mounting medium for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol, pure (&#8805;99.5%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>459836</td>
			<td>(= ethanol, for dehydration processes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution, 37%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252549</td>
			<td>(for NBF solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td>histological tissue fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin capsules for TEM</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-248-71</td>
			<td>(for resin polymerisation in TEM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin solution, 2% in H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1393</td>
			<td>(dilute for slides preparation - OCT adherence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution, 25%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6257</td>
			<td>(for Karnovsky&#8217;s solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoResin</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>14702231731</td>
			<td>glycol methacrylate (GMA) embedding kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>207772</td>
			<td>(for Lugol solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead(II) nitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>228621</td>
			<td>Pb(NO3)2 (for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR White acrylic resin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9774</td>
			<td>hydrophilic acrylic resin for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lugol solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>62650</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal stubs for specimen mounts</td>
			<td>Rave Scientific</td>
			<td></td>
			<td>(for SEM, different models)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>manual rotary microtome or other model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oatmeal agar (OMA)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>O3506</td>
			<td>(for seeds germination tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Compound, Tissue-Tek</td>
			<td>Sakura Finetek USA</td>
			<td>4583</td>
			<td>embedding medium for frozen tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201030</td>
			<td>OsO4 (for TEM postfixation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793</td>
			<td>sealing thermoplastic film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td>(for Karnovsky&#8217;s solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine solution, 0.1% in H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td>(for slides preparation - OCT adherence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep Slides</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0425</td>
			<td>poly-L-lysine coated glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Molding Cup Trays</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>17177A-3</td>
			<td>(6x8x5 mm, for embbeding samples in GMA resin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Molding Cup Trays</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>17177C-3</td>
			<td>(13x19x5 mm, for embbeding samples in GMA resin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221945</td>
			<td>(for Lugol solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato Dextrose Agar (PDA)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>70139</td>
			<td>(for seeds germination tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscope</td>
			<td>Jeol</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silane [(3-Aminopropyl)triethoxysilane]</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3648</td>
			<td>(for slides preparation - OCT adherence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silane-Prep Slides</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4651</td>
			<td>glass slides coated with silane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel orange, granular</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>10087</td>
			<td>(for dessicating processes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0250</td>
			<td>(for glutaraldehyde-sodium cacodylate buffer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881</td>
			<td>NaOH (for Karnovsky&#8217;s solution preparation and TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>425044</td>
			<td>NaClO (for seeds surface disinfection)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic, anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71640</td>
			<td>Na2HPO4 (for NBF solution and PB preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td>NaH2PO4&#183;H2O (for NBF and PB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sputter coater</td>
			<td>Balzers</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td>C12H22O11 (for cryoprotection and germination test)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan III</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4131</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan IV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>198102</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan Black B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>199664</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(3 mL, any brand, for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter Unit, Millex-GV 0.22 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033R</td>
			<td>PVDF, 33 mm, gamma sterilized (for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tek Bond Super Glue 793</td>
			<td>Tek Bond Saint-Gobain</td>
			<td>78072720018</td>
			<td>liquid cyanoacrylate adhesive, medium viscosity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3260</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Jeol</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triphenyltetrazolium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8877</td>
			<td>(for the tetrazolium test in seeds germination)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1804</td>
			<td>Na3(C6H5O7)&#183;2H2O (for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-607-645</td>
			<td>UO2(CH3COO)2 (for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td>TermoFisher Scientific</td>
			<td>W11261</td>
			<td>fluorescent dye-conjugated lectin (detects sialic acid and N-acetylglucosaminyl residues)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microscopy techniques for interpreting fungal colonization in mycoheterotrophic plants tissues and symbiotic germination of seeds

Strukturell botanik är ett oumbärligt perspektiv för att fullt ut förstå växternas ekologi, fysiologi, utveckling och utveckling. När man undersöker mykoheterotrofa växter (dvs växter som får kol från svampar) kan anmärkningsvärda aspekter av deras strukturella anpassningar, mönstren för vävnadskolonisering av svampar och morfoanatomin hos underjordiska organ upplysa deras utvecklingsstrategier och deras relationer med hyfer, källan till näringsämnen. En annan viktig roll av symbiotiska svampar är relaterad till spiring av orkidéfrön; alla Orchidaceae-arter är mykoheterotrofa under groning och plantor (initial mykoheterotrofi), även de som fotosyntetiserar i vuxna stadier. På grund av bristen på näringsreserver i orkidéfrön är svampsymbionter viktiga för att ge substrat och möjliggöra spiring. Att analysera grobarhetsstadier med strukturella perspektiv kan också svara på viktiga frågor om svamparnas interaktion med fröna. Olika avbildningstekniker kan tillämpas för att avslöja svampendofyter i växtvävnader, som föreslås i denna artikel. Frihand och tunna delar av växtorgan kan färgas och sedan observeras med hjälp av ljusmikroskopi. En fluorokrom konjugerad till vetegroddar agglutinin kan appliceras på svamparna och inkuberas tillsammans med Calcofluor White för att markera växtcellväggar i konfokalmikroskopi. Dessutom beskrivs metoderna för skanning och överföringselektronmikroskopi för mykoheterotrofa orkidéer, och möjligheterna att tillämpa sådana protokoll i besläktade växter undersöks. Symbiotisk spiring av orkidéfrön (dvs i närvaro av mykorrhizasvampar) beskrivs i protokollet i detalj, tillsammans med möjligheter att förbereda strukturerna erhållna från olika stadier av spiring för analyser med ljus-, konfokal- och elektronmikroskopi.

Efter de väsentliga stadierna för fixering av växtvävnad ger cellulära strukturer så lika som möjligt till levande tillstånd, med tanke på morfologi, volym och rumslig organisation av cellulära komponenter och vävnader16. Observera sådana egenskaper i proverna efter kemisk fixering (figur 4). Figur 4C-F representerar tillräckligt fixerade prover under ljusmikroskopi. Att följa de beskrivna f...

Watch this Scientific Journal Video about Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds at JoVE.com

Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds

Detta protokoll syftar till att tillhandahålla detaljerade procedurer för insamling, fixering och underhåll av mykoheterotrofa växtprover, med tillämpning av olika mikroskopitekniker som skannings- och överföringselektronmikroskopi, ljus-, konfokal- och fluorescensmikroskopi för att studera svampkolonisering i växtvävnader och frön groddar med mykorrhizasvampar.

Mikroskopitekniker för tolkning av svampkolonisering i mykoheterotrofa växtvävnader och symbiotisk spiring av frön

Structural botany is an indispensable perspective to fully understand the ecology, physiology, development, and evolution of plants. When researching ...

Protokollet presenterar olika mikroskopitekniker som tillämpas för att förstå svampkoloniseringen i mykoheterotrofa växter, från insamling till beredning av prover i detalj och inkluderar viktiga steg. Sådana tekniker kan tillämpas på olika mykoheterotrofa växter, och till och med på en växts andra material än mykoheterotrofer. Denna metod är huvudsakligen relaterad till strukturell botanik och kan också ge insikter i mykorrhizainteraktioner, fysiologi, reproduktionsbiologi, evolution och ekologi hos mykoheterotrofa växter.Börja med att samla de mykoheterotrofa växterna genom att utforska jorden runt växtbasen, var försiktig så att du inte skadar de underjordiska organen. Undvik också att dra växterna från marken för att förhindra att luftorganen kopplas bort från de underjordiska. Gräv försiktigt runt antennstrukturer med hjälp av en trädgårdsslev medan du utforskar de underjordiska organen som rötter, stjälkar, rhizomer och lagringsorgan utan att skada dessa strukturer.Ta bort jordpartiklar för att bevara bräckliga strukturer och tvätta dessa organ försiktigt med kranvatten för att skölja bort de återstående jordpartiklarna innan proverna fixeras. Mykoheterotrofa växter i samband med bladskräp kräver extra uppmärksamhet. Samla därför försiktigt de känsliga organen som är anslutna till det sönderdelande materialet genom sina hyfer utan att dra dem från de anslutna strukturerna.Bevara strukturer med sådana anslutningar och samla kullen för analys. För transmissionselektronmikroskopianalys, dela de 3 till 4 millimeter tjocka proverna inuti en droppe glutaraldehydnatriumkakodylatbuffert i mindre sektioner med 1 till 2 millimeter tjocklek. Kassera de skurna kanterna utanför droppen.Se till att fixeringsprocessen genomförs på uppsamlingsplatsen omedelbart efter insamlingen av växter. Överför omedelbart sektionerna till ett uppsamlingsrör med en volym fixativ som är mer än 10 gånger större än provvolymen eftersom det är ett tillsatsfixativ. För ytanalys av de ytliga hyferna i organen, särskilt i underjordiska och de som är i kontakt med bladskräp.Observera färskt eller fixerat material under dissekeringsmikroskopet vid en förstoring på 7,5x eller högre. Sök efter de intresseområden som styrs av de ytliga hyferna och rhizomorferna. Välj de prover som innehåller områden med ytliga rhizomorfer eftersom dessa kan sektioneras för att visualisera pelotoner och hyfaspolar i kortikala celler i rötter och stjälkar.Bered 0,2 milligram per milliliter vetegroddaragglutininfluorokromkonjugat och 1%kalcofluorvita lösningar i 0,1 molar fosfatbuffert enligt beskrivningen i textmanuskriptet. Inkubera nu sektionerna på glasskivor genom att täcka dem ordentligt med vetegroddar agglutinin fluorokromkonjugatlösning i 30 minuter. Tvätta sektionerna med 0,1 molär fosfatbuffert efter inkubationen och inkubera dem i kalcofluorlösningen som monteringsmedium.Placera sedan täckglidningar på bilderna och observera det under ett konfokalt eller fluorescensljusmikroskop med hjälp av de angivna filtren. Efter fixering av proverna, utförande av uttorkning och lagring i 70% etanol, exponera önskad yta för svepelektronmikroskopianalys genom att använda ett skarpt och nytt rakblad för att göra snitt med en enkelriktad rörelse. Använd vid behov ett stereomikroskop för att välja proverna och överväga metallstubbområdet medan du bestämmer provstorlekarna.Dehydrera vidare proverna i en etanolserie. Håll små och känsliga prover i 30 minuter i varje koncentration och större och tätare prover i 1 timme. Vik sedan små kuvert med silkespapper för att organisera prover för nästa steg.Större prover kan hanteras utan kuvert. Märk kuverten med en penna och för en logg över proverna. Placera försiktigt proverna inuti kuverten med en pensel.Förvara nu dessa prover i absolut etanol. Fortsätt omedelbart med torkning av kritiska punkter genom att använda en kritisk punkttork enligt standardrutiner. För detta, placera proverna i absolut etanol i en provhållare och placera den inuti den kritiska punkttorkens tryckkammare.Den mellanliggande vätskan löses upp i övergångsvätskan vid den kritiska koldioxidpunkten och torkar därmed proverna. Eftersom reabsorption av luftfuktighet kan förstöra proverna, förvara dem i en uttorkningsbehållare omedelbart efter torkning av kritiska punkter. Innan du monterar proverna på metallstubbar, sätt på handskarna för att manipulera stubbarna.Sänk ner dem i aceton i 5 minuter för att eliminera fett och låt dem torka. Under ett stereomikroskop fixerar du proverna på stubben med hjälp av en ledande dubbelsidig koltejp och placerar dem. Webbplatsen ovanifrån är det enda möjliga perspektivet i svepelektronmikroskopibilder.För att manipulera proverna, använd finpunktpincett. Provdelen som berörs av pincetten är vanligtvis skadad. Så var försiktig och försök att röra vid delar som är placerade bort från intresseområdena.Behåll stubbarna med prover i en förseglad petriskål med kiselgel. Fortsätt sedan med sputterbeläggning för att deponera ett lager guld eller platina på ytan av proverna i en lågtrycksatmosfär av inert gas genom att följa standardoperationsprocedurerna. Beläggningstjockleken beror på provets topografi och är vanligtvis mellan 15 och 40 nanometer.Slutligen behåll de belagda stubbarna i en förseglad petriskål med kiselgel som behåller fuktigheten. Proverna kan lagras på detta sätt i veckor. Använd ett svepelektronmikroskop för att analysera dessa prover.En elektronstråle träffar in vakuo-provet under svepelektronmikroskopi och signalemissionen från sådan interaktion tolkas som bilder. Se till att de lösningar och material som används vid symbiotisk spiring av frön är sterila. för att undvika kontaminering.Börja med att autoklavera dem i 20 minuter vid 121 grader Celsius. I en laminär luftflödeshuv desinficerar du ytligt frukterna och fröna genom att nedsänka dem i en natriumhypokloritlösning innehållande 2% aktivt klor. Smala och bräckliga frön kan nedsänkas i en 1:1 utspädd natriumhypokloritlösning.Efter desinfektion återhämtar fröna genom att filtrera dem med xerografiskt tyg. Tvätta frukterna och fröna tre gånger i autoklaverat destillerat vatten för att avlägsna hypokloritlösningen innan du fortsätter med groningstesterna. Förvara dem vid behov i filterpappershöljen inuti glasflaskor med kiselgel vid 4 grader Celsius och hermetiskt stäng kolvarna och försegla dem med fastfilm, utvärdera sedan tvättprocessens effektivitet genom att överföra några droppar vatten från den sista tvätten till potatisdextrosagar.För symbiotisk spiring av orkidéfrön, inkubera fröna över 1 till 2 centimeter autoklaverade filterpappersskivor placerade i petriskålar som innehåller havregrynagarodlingsmedium. Inokulera nu mitten av petriskålen med fragmentet av odlingsmedium som innehåller mycelium från den valda isolerade svampen. Försegla petriskålarna med plastfolie och inkubera dem i mörkret vid cirka 25 grader Celsius eller rumstemperatur, beroende på svamptillväxten.Förbered några rätter med frön och utan svampinokulering som en negativ kontroll för grobarhetstestet. Analysera grobarhetsresultaten varje vecka genom att samla in kvantitativa och kvalitativa data och fotografera protokormer och plantor. Rhizomerna kan lätt kännas igen vanligtvis som mörka, skosträngliknande strukturer.Frihand eller andra metoder för att erhålla sektioner tjockare än 10 mikrometer kan bättre evince pelotons och ge mer representativa bilder av svampmönster för kolonisering. Frihandssektioner kan också vara lämpliga för hyphae-analys vid högre förstärkning. Även om detaljer uppnås bättre i tunnare sektioner.De sekundära cellväggarna i xylemelement kan lätt identifieras med den ljusa färgen toluidin förvärvar. Under tiden identifieras floemelement som endast består av primära cellväggar av deras tunnare och mörkare cellväggar. Artefakter genom autofluorescens kan ses i glykolmetakrylathartssektioner.Dessa artefakter är vanligtvis relaterade till fluorokromkoncentration och kan undvikas genom att tvätta proverna ett större antal gånger med bufferten. Frihandsdelen av roten visar interna och externa hyfer. Samma organ kan ses genom att skanna elektronmikroskopi med ett överflöd av rhizomorfer och individuella hyfer på dess yta.De flesta orkidéarter gror inom några veckor efter att ha smittats av den inokulerade svampen eller tills nästan mer än en månad. Ljus i svepelektronmikroskopi kan appliceras på blommor, frukter och frön för att undersöka reproduktionsbiologin eller mykoheterotrofa växter. Symbiotisk spiring av frön kan också testas i autotrofa orkidéer.

Research

JoVE Journal

Biology

Obtaining Hemocytes from the Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes and Observing their Adherence to Symbiotic and Non-Symbiotic Bacteria

Obtaining Hemocytes from the Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes and Observing their Adherence to Symbiotic and Non-Symbiotic Bacteria

Skaffa hemocyter från Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes Och observera att de följer Symbiotiska och icke-symbiotiska bakterier

Studies concerning the role of the immune system in mediating molecular signaling between beneficial bacteria and their hosts have, in recent years, made ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp och tekniker perfusion för att studera jonkanaler Uttryckt i Xenopus Oocyter

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Tandem Högtrycks Frysning och Quick Freeze Substitution av växtvävnad för transmissionselektronmikroskopi

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Mätning rumsliga och tids Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Signaler i Arabidopsis växter

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analys av Autophagy i<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Med hjälp Svält Pads i kombination med fluorescensmikroskopi

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Svepelektronmikroskopi (SEM) Protokoll för Problematiskt Plant, Algsvampar, och Svamp Prover

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

Ljus Sheet fluorescensmikroskopi av växtrötter som växer på ytan av en gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Karakterisering av förkalkning händelser Använda Live Optiska och elektronmikroskopi tekniker i en marin Tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

Enkel och effektiv Administration och visualisering av mikropartiklar i cirkulationssystemet av små fiskar använder njure injektion

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

Micron-scale Phenotyping Techniques of Maize Vascular Bundles Based on X-ray Microcomputed Tomography

Micron-skala fenotypning tekniker för majs kärlknippena baserat på röntgen Microcomputed tomografi

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a ...