Name: microscopy techniques for interpreting fungal colonization in mycoheterotrophic plants tissues and symbiotic germination of seeds
Uploaded: 2022-05-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds at JoVE.com

Yazarlar FAEPEX ve FAPESP'in (2015/26479-6) finansmanına teşekkür ediyor. MPP, yüksek lisans bursu için Capes'e teşekkür eder (süreç 88887.600591/2021-00) ve CNPq. JLSM, verimlilik hibeleri için CNPq'ya teşekkür eder (303664/2020-7). Yazarlar ayrıca LME (Elektron Mikroskobu Laboratuvarı - IB / Unicamp), INFABiC (Hücre Biyolojisine Uygulanan Fotonik Ulusal Bilim ve Teknoloji Enstitüsü - Unicamp) ve LaBiVasc (Vasküler Biyoloji Laboratuvarı - DBEF / IB / Unicamp) tarafından sağlanan ekipman ve yardıma erişime teşekkür eder; LAMEB (UFSC) ve Eliana de Medeiros Oliveira (UFSC) kriyoproteksiyon protokolüne katkılarından dolayı; TEM protokolüne katkılarından dolayı LME.

1. Numunelerin toplanması, sabitlenmesi ve bakımı
NOT: Tamamen MH bitkileri genellikle 12,13 numaralı karanlık ormanda, çoğunlukla nemli ve çöp içeren alanlarda bulunabilirken, kısmen MH bitkileri daha açık ormanlardabulunabilir 12,13. MH bitkileri genellikle çeşitli şekil ve boyutlarda iyi gelişmiş yeraltı organlarına sahiptir.
<ol><li>MH...

<ol>
	<li>Evert, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Esau&#8217;s Plant Anatomy: Meristems, Cells, and Tissues of the Plant Body: Their Structure, Function, and Development. , (2006).</li><li>Yeung, E. C. T., Stasolla, C., Sumner, M. J., Huang, B. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plant Microtechniques and Protocols. , (2015).</li><li>Sokoloff, D. D., Jura-Morawiec, J., Zoric, L., Fay, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+anatomy:+at+the+heart+of+modern+botany.">Plant anatomy: at the heart of modern botany.</a> Botanical Journal of the Linnean Society. 195 (3), 249-253 (2021).</li><li>Leake, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+myco-heterotrophic+(&#8216;saprophytic&#8217;)+plants.">The biology of myco-heterotrophic (&#8216;saprophytic&#8217;) plants.</a> New Phytologist. 127 (2), 171-216 (1994).</li><li>Bidartondo, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolutionary+ecology+of+myco-heterotrophy.">The evolutionary ecology of myco-heterotrophy.</a> New Phytologist. 167 (2), 335-352 (2005).</li><li>Imhof, S., Massicotte, H. B., Melville, L. H., Peterson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subterranean+morphology+and+mycorrhizal+structures.">Subterranean morphology and mycorrhizal structures.</a> Mycoheterotrophy. , 157-214 (2013).</li><li>Rasmussen, H. N., Rasmussen, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchid+mycorrhiza:+implications+of+a+mycophagous+life+style.">Orchid mycorrhiza: implications of a mycophagous life style.</a> Oikos. 118 (3), 334-345 (2009).</li><li>Rasmussen, H. N., Dixon, K. W., Jers&#225;kov&#225;, J., T&#283;&#353;itelov&#225;, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+and+seedling+establishment+in+orchids:+a+complex+of+requirements.">Germination and seedling establishment in orchids: a complex of requirements.</a> Annals of Botany. 116 (3), 391-402 (2015).</li><li>Zettler, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terrestrial+orchid+conservation+by+symbiotic+seed+germination:+techniques+and+perspectives.">Terrestrial orchid conservation by symbiotic seed germination: techniques and perspectives.</a> Selbyana. 18 (2), 188-194 (1997).</li><li>Stewart, S. L., Kane, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symbiotic+seed+germination+and+evidence+for+in+vitro+mycobiont+specificity+in+Spiranthes+brevilabris+(Orchidaceae)+and+its+implications+for+species-level+conservation.">Symbiotic seed germination and evidence for in vitro mycobiont specificity in Spiranthes brevilabris (Orchidaceae) and its implications for species-level conservation.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Plant. 43 (3), 178-186 (2007).</li><li>Zhao, D. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchid+reintroduction+based+on+seed+germination-promoting+mycorrhizal+fungi+derived+from+protocorms+or+seedlings.">Orchid reintroduction based on seed germination-promoting mycorrhizal fungi derived from protocorms or seedlings.</a> Frontiers in Plant Science. 12, 701152 (2021).</li><li>Selosse, M. A., Roy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+plants+that+feed+on+fungi:+facts+and+questions+about+mixotrophy.">Green plants that feed on fungi: facts and questions about mixotrophy.</a> Trends in Plant Science. 14 (2), 64-70 (2009).</li><li>Merckx, V. S. F. T., Mennes, C. B., Peay, K. G., Geml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+diversification.">Evolution and diversification.</a> Mycoheterotrophy: The Biology of Plants Living on Fungi. , 215-244 (2013).</li><li>Boon, M. E., Drijver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routine+Cytological+Staining+Techniques:+Theoretical+Background+and+Practice.">Routine Cytological Staining Techniques: Theoretical Background and Practice.</a> Macmillan International Higher Education. , (1986).</li><li>Karnovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+formaldehyde-glutaraldehyde+fixative+of+high+osmolality+for+use+in+electron+microscopy.">A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 27 (2), 137-138 (1964).</li><li>Hayat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fixation for Electron Microscopy. , (1981).</li><li>Roland, J. C., Vian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+preparation+and+staining+of+thin+sections.">General preparation and staining of thin sections.</a> Electron Microscopy of Plant Cells. 1, 675 (1991).</li><li>Gerrits, P. O., Horobin, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycol+methacrylate+embedding+for+light+microscopy:+basic+principles+and+trouble-shooting.">Glycol methacrylate embedding for light microscopy: basic principles and trouble-shooting.</a> Journal of Histotechnology. 19 (4), 297-311 (1996).</li><li>Zhang, Z., Niu, L., Chen, X., Xu, X., Ru, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+plant+cryosection.">Improvement of plant cryosection.</a> Frontiers in Biology. 7 (4), 374-377 (2012).</li><li>Bene&#352;, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+media+improving+freeze-sectioning+of+plant+material.">On the media improving freeze-sectioning of plant material.</a> Biologia Plantarum. 15 (1), 50-56 (1973).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+slides+and+coverslips+for+microscopy.">Preparation of slides and coverslips for microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (5), (2008).</li><li>Sakai, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+method+for+differential+staining+of+paraffin+embedded+plant+material+using+toluidine+blue+O.">Simple method for differential staining of paraffin embedded plant material using toluidine blue O.</a> Stain Technology. 48 (5), 247-249 (1973).</li><li>O&#8217;Brien, T., Feder, N., McCully, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polychromatic+staining+of+plant+cell+walls+by+toluidine+blue+O.">Polychromatic staining of plant cell walls by toluidine blue O.</a> Protoplasma. 59 (2), 368-373 (1964).</li><li>Ventrella, M. C., Almeida, A. L., Nery, L. A., Coelho, V. P. d. e. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#233;todos+Histoqu&#237;micos+Aplicados+&#224;s+Sementes.">M&#233;todos Histoqu&#237;micos Aplicados &#224;s Sementes.</a> Universidade Federal de Vi&#231;osa. , (2013).</li><li>Pearse, A. G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histochemistry, Theoretical and Applied. , (1960).</li><li>Andrade-Linares, D. R., Franken, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+endophytes+in+plant+roots:+taxonomy,+colonization+patterns,+and+functions.">Fungal endophytes in plant roots: taxonomy, colonization patterns, and functions.</a> Symbiotic Endophytes. , 311-334 (2013).</li><li>Wymer, C. L., Beven, A. F., Boudonck, K., Lloyd, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy+of+plant+cells.">Confocal microscopy of plant cells.</a> Confocal Microscopy Methods and Protocols. , 103-130 (1999).</li><li>Marques, J. P. R., Soares, M. K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+de+T&#233;cnicas+Aplicadas+&#224;+Histopatologia+Vegetal.">Manual de T&#233;cnicas Aplicadas &#224; Histopatologia Vegetal.</a> FEALQ. , (2021).</li><li>Navarro, B. L., Marques, J. P. R., Appezzato-da-Gl&#243;ria, B., Sp&#243;sito, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histopathology+of+Phakopsora+euvitis+on+Vitis+vinifera.">Histopathology of Phakopsora euvitis on Vitis vinifera.</a> European Journal of Plant Pathology. 154 (4), 1185-1193 (2019).</li><li>Marques, J. P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugarcane+cell+wall-associated+defense+responses+to+infection+by+Sporisorium+scitamineum.">Sugarcane cell wall-associated defense responses to infection by Sporisorium scitamineum.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 698 (2018).</li><li>Jeffree, C. E., Read, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ambient-and+low-temperature+scanning+electron+microscopy.">Ambient-and low-temperature scanning electron microscopy.</a> Electron Microscopy of Plant Cells. , 313-413 (1991).</li><li>Bozzola, J. J., Russell, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Electron Microscopy: Principles and Techniques for Biologists. , (1999).</li><li>Murray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+transmission+and+scanning+electron+microscopy.">Basic transmission and scanning electron microscopy.</a> Introduction to electron Microscopy for Biologists. , 3-18 (2008).</li><li>. Glossary of TEM terms Available from: <a target="_blank" href="https://www.jeol.co.jp/en/words/emterms/">https://www.jeol.co.jp/en/words/emterms/</a> (2021)</li><li>Seaton, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchid+seed+and+pollen:+a+toolkit+for+long-term+storage,+viability+assessment+and+conservation.">Orchid seed and pollen: a toolkit for long-term storage, viability assessment and conservation.</a> Orchid Propagation: From Laboratories to Greenhouses&#8212;Methods and Protocols. , 71-98 (2018).</li><li>Otero, J. T., Ackerman, J. D., Bayman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+mycorrhizal+preferences+between+two+tropical+orchids.">Differences in mycorrhizal preferences between two tropical orchids.</a> Molecular Ecology. 13 (8), 2393-2404 (2004).</li><li>Koch, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marasmioid+rhizomorphs+in+bird+nests:+Species+diversity,+functional+specificity,+and+new+species+from+the+tropics.">Marasmioid rhizomorphs in bird nests: Species diversity, functional specificity, and new species from the tropics.</a> Mycologia. 112 (6), 1086-1103 (2020).</li><li>Webster, J., Weber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Introduction to Fungi. , (2007).</li><li>Sisti, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+non-mycorrhizal+fungi+in+germination+of+the+mycoheterotrophic+orchid+Pogoniopsis+schenckii+Cogn.">The role of non-mycorrhizal fungi in germination of the mycoheterotrophic orchid Pogoniopsis schenckii Cogn.</a> Frontiers in Plant Science. 10, 1589 (2019).</li><li>Martos, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+recruitment+of+saprotrophic+fungi+as+mycorrhizal+partners+by+tropical+achlorophyllous+orchids.">Independent recruitment of saprotrophic fungi as mycorrhizal partners by tropical achlorophyllous orchids.</a> New Phytologist. 184 (3), 668-681 (2009).</li><li>Alves, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+development+and+genetic+structure+of+the+mycoheterotrophic+orchid+Pogoniopsis+schenckii+Cogn.">Reproductive development and genetic structure of the mycoheterotrophic orchid Pogoniopsis schenckii Cogn.</a> BMC Plant Biology. 21 (1), 332 (2021).</li><li>Merckx, V. S. F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycoheterotrophy:+an+introduction.">Mycoheterotrophy: an introduction.</a> Mycoheterotrophy: The Biology of Plants Living on Fungi. , 1-17 (2013).</li><li>Hall, J. L., Hawes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Electron Microscopy of Plant Cells. , (1991).</li></ol>

Bitki anatomisi ve morfolojisindeki görüntü analizleri, yeraltı organları6,40, tohumların simbiyotik çimlenmesinin yapısal analizleri39 ve hava ve üreme yapıları 41 ile gösterildiği gibi, amaçları yerine getirmek ve mikoheterotrofik bitkiler ile vazgeçilmez mantar endofitleri arasındaki ilişkileri anlamaya yardımcı olmak için önemli bir potansiyele sahiptir. . Yapısal botanik, son on yılda bi...

Bitki morfolojisi ve anatomisini kapsayan botanik alanındaki yapısal araştırmalar, tüm organizmayı anlamada temeldir1,2 ve bitkilerin ekolojisi, fizyolojisi, gelişimi ve evrimi ile ilgili bilgileri bütünleştirmek ve katkıda bulunmak için vazgeçilmez perspektifler sağlar3. Bitki morfolojisi ve anatomisindeki yöntemler şu anda yakın zamanda ve bir asırdan fazla bir süre önce geliştirilen protokolleri, ekipmanları ve bilgileri içermektedir2. Klasik yöntemlerin (örneğin, ışık mikroskobu) ve daha yeni tekniklerin (örneğin, konfokal mikroskopi, X-ışını mikrotomografisi) sürekli olarak uygulanması ve uyarlanması aynı temel temele sahiptir: bir metodolojinin geliştirilmesini sağlayan teorik bilgi.
Bitki anatomisi ve morfolojisinde ana araç görüntüdür. Bu tür analizlerin basit gözlemler olduğu yanılgısına rağmen, öznel yorumlara yer vermek2, bu alandaki görüntüleri analiz etmek ve anlamak, uygulanan yöntemler (ekipman, analiz türü, metodolojik prosedürler), hücre bileşenleri, histokimya ve bitki gövdesi (doku organizasyonu ve fonksiyonu, ontojeni, morfolojik adaptasyonlar) hakkında bilgi gerektirir. Çeşitli yöntemlerle elde edilen görüntülerin yorumlanması, form ve fonksiyonun ilişkilendirilmesine, bir yapının kimyasal bileşiminin deşifre edilmesine, taksonların tanımlanmasında doğrulanmasına, fitopatojenlerin enfeksiyonlarının anlaşılmasına ve diğer bu tür değerlendirmelere yol açabilir.
Mikoheterotrofik (MH) bitkileri (yani, mikorizal mantarlardan karbon elde eden fotosentetik olmayan bitkiler4,5) araştırırken, yapısal adaptasyonlarının dikkat çekici yönleri, mantarlar tarafından doku kolonizasyonu kalıpları ve yeraltı organlarının morfoanatomisi, gelişim stratejilerini ve besin kaynağı olan hiflerle ilişkilerini aydınlatabilir. MH bitkilerinin yeraltı organları genellikle toprak mantarları ile olan ilişkileriyle ilgili önemli adaptasyonlar gösterir, bu nedenle bu anatomik ve morfolojik araştırmaların yapılması esastır6. MH türlerinin hava organları göz ardı edilmemelidir, çünkü endofitler mikorizal mantar olmasalar bile bu dokularda da bulunabilir (kişisel gözlemler, henüz yayınlanmamıştır).
Mikorizal mantarların MH türleri ile tüm yaşam döngüleriboyunca 7 olan ilişkisinin köklü özünün yanı sıra, her orkide türü, ototrofik olanlar bile, doğal ortamlarda başlangıçta zorunlu bir mikoheterotrofik aşamaya sahiptir. Orkidelerin embriyosunun farklılaşmamış olması ve endosperm veya kotiledonlardan yoksun olması, dolayısıyla mantar ortaklarının beslenme desteği olmadan doğal ortamlarda kendini geliştirememesi ve kuramamasıdır 4,8. Simbiyotik çimlenme protokollerinin sadece MH türlerine değil, aynı zamanda fotosentez yapan orkidelere de uygulanabileceği göz önüne alındığında, çimlenme ve protocorm gelişiminde orkide-mantar özgüllüğünü araştırmayı amaçlayan, tehdit altındaki türlerin korunmasına yönelik girişimlerde çok uygulanan bir metodoloji 9,10,11.
Bu yöntem derlemesinde, anatomik çalışmalar için MH bitki örneklerinin toplanması, sabitlenmesi ve depolanması (bölüm 1), yüzey analizi ve numune seçimi (bölüm 2), bölümleme yöntemleri (serbest: bölüm 3, mikrotomi: bölüm 4, kriyomikrotomi: bölüm 5), boyama ve montaj (bölüm 6), mantar endofitlerinin floresan ve konfokal mikroskopisi (bölüm 7), taramalı elektron mikroskobu (bölüm 8), ve transmisyon elektron mikroskobu (bölüm 9). Ek olarak, orkide tohumları için simbiyotik çimlenme yöntemini (MH ve ototrofik, bölüm 10) tanımlamaktayız, çünkü daha önce bahsedilen görüntüleme yöntemleri, çimlenme sürecinde tohumların, protokormların ve fidelerin mantar kolonizasyonunu analiz etmek için başarıyla uygulanabilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63777/63777fig01.jpg"> Şekil 1: Görüntüleme yöntemlerinin şematik özeti. Şemalar, ayrıntılı olarak açıklandığı protokol adımlarının göstergelerini sağlar. Kısaltmalar: GMA = glikol metakrilat, OCT = optimal kesme sıcaklığı bileşiği, SEM = taramalı elektron mikroskobu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63777/63777fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Burada ayrıntılı olarak açıklanan mikroskopi teknikleri (Şekil 1) aşağıdaki temel adımlardan önce gelir: numunelerin toplanması, sabitlenmesi, dehidrasyonu, gömülmesi ve bölümlenmesi. Seçilen teknik(ler)e bağlı olarak adımlar değişken olduğundan (Şekil 1), hazırlanacak ve toplama alanına taşınacak fiksatörleri, numunelerin sabitlemeden önce nasıl hazırlanması gerektiğini, kullanılacak dehidrasyon işlemlerini (bölüm 1) ve farklı gömme olanakları ve kesitleme yöntemlerini (bölüm 4, 5, ve 9). Şekil 1 , aşağıda ayrıntılı olarak açıklanan her mikroskopi tekniği için gerekli tüm adımları sırayla özetlemektedir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179124</td>
			<td>(for SEM stubs mounting)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar-agar (AA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1296</td>
			<td>(for seeds germination tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcofluor White Stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18909</td>
			<td>fluorescent dye (detects cellulose)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate Buffer Solution, 0.09M pH 4.8</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2488</td>
			<td>(for toluidine blue O staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive Double-Sided Carbon Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-285-81</td>
			<td>(for SEM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper Grids</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4776</td>
			<td>(for TEM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical-point dryer</td>
			<td>Balzers</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>(= stereomicroscope, any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Entellan</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>107960</td>
			<td>rapid mounting medium for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol, pure (&#8805;99.5%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>459836</td>
			<td>(= ethanol, for dehydration processes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution, 37%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252549</td>
			<td>(for NBF solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td>histological tissue fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin capsules for TEM</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-248-71</td>
			<td>(for resin polymerisation in TEM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin solution, 2% in H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1393</td>
			<td>(dilute for slides preparation - OCT adherence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution, 25%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6257</td>
			<td>(for Karnovsky&#8217;s solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoResin</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>14702231731</td>
			<td>glycol methacrylate (GMA) embedding kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>207772</td>
			<td>(for Lugol solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead(II) nitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>228621</td>
			<td>Pb(NO3)2 (for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR White acrylic resin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9774</td>
			<td>hydrophilic acrylic resin for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lugol solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>62650</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal stubs for specimen mounts</td>
			<td>Rave Scientific</td>
			<td></td>
			<td>(for SEM, different models)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>manual rotary microtome or other model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oatmeal agar (OMA)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>O3506</td>
			<td>(for seeds germination tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Compound, Tissue-Tek</td>
			<td>Sakura Finetek USA</td>
			<td>4583</td>
			<td>embedding medium for frozen tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201030</td>
			<td>OsO4 (for TEM postfixation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793</td>
			<td>sealing thermoplastic film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td>(for Karnovsky&#8217;s solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine solution, 0.1% in H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td>(for slides preparation - OCT adherence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep Slides</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0425</td>
			<td>poly-L-lysine coated glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Molding Cup Trays</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>17177A-3</td>
			<td>(6x8x5 mm, for embbeding samples in GMA resin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Molding Cup Trays</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>17177C-3</td>
			<td>(13x19x5 mm, for embbeding samples in GMA resin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221945</td>
			<td>(for Lugol solution preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato Dextrose Agar (PDA)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>70139</td>
			<td>(for seeds germination tests)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscope</td>
			<td>Jeol</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silane [(3-Aminopropyl)triethoxysilane]</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3648</td>
			<td>(for slides preparation - OCT adherence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silane-Prep Slides</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4651</td>
			<td>glass slides coated with silane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel orange, granular</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>10087</td>
			<td>(for dessicating processes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0250</td>
			<td>(for glutaraldehyde-sodium cacodylate buffer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881</td>
			<td>NaOH (for Karnovsky&#8217;s solution preparation and TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>425044</td>
			<td>NaClO (for seeds surface disinfection)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic, anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71640</td>
			<td>Na2HPO4 (for NBF solution and PB preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td>NaH2PO4&#183;H2O (for NBF and PB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sputter coater</td>
			<td>Balzers</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td>C12H22O11 (for cryoprotection and germination test)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan III</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4131</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan IV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>198102</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan Black B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>199664</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(3 mL, any brand, for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter Unit, Millex-GV 0.22 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033R</td>
			<td>PVDF, 33 mm, gamma sterilized (for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tek Bond Super Glue 793</td>
			<td>Tek Bond Saint-Gobain</td>
			<td>78072720018</td>
			<td>liquid cyanoacrylate adhesive, medium viscosity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3260</td>
			<td>(for staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Jeol</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triphenyltetrazolium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8877</td>
			<td>(for the tetrazolium test in seeds germination)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1804</td>
			<td>Na3(C6H5O7)&#183;2H2O (for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-607-645</td>
			<td>UO2(CH3COO)2 (for TEM contrast staining)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(any model)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td>TermoFisher Scientific</td>
			<td>W11261</td>
			<td>fluorescent dye-conjugated lectin (detects sialic acid and N-acetylglucosaminyl residues)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microscopy techniques for interpreting fungal colonization in mycoheterotrophic plants tissues and symbiotic germination of seeds

Yapısal botanik, bitkilerin ekolojisini, fizyolojisini, gelişimini ve evrimini tam olarak anlamak için vazgeçilmez bir bakış açısıdır. Mikoheterotrofik bitkileri (yani, mantarlardan karbon elde eden bitkileri) araştırırken, yapısal adaptasyonlarının dikkat çekici yönleri, mantarlar tarafından doku kolonizasyonu kalıpları ve yeraltı organlarının morfoanatomisi, gelişim stratejilerini ve besin kaynağı olan hiflerle ilişkilerini aydınlatabilir. Simbiyotik mantarların bir diğer önemli rolü orkide tohumlarının çimlenmesi ile ilgilidir; Tüm Orchidaceae türleri, çimlenme ve fide aşamasında (ilk mikoheterotrofi), hatta yetişkin aşamalarında fotosentez yapanlar bile mikoheterotrofiktir. Orkide tohumlarında besin rezervlerinin bulunmaması nedeniyle, mantar simbiyontları substratlar sağlamak ve çimlenmeyi sağlamak için gereklidir. Çimlenme aşamalarını yapısal perspektiflerle analiz etmek, mantarların tohumlarla etkileşimi ile ilgili önemli soruları da cevaplayabilir. Bu makalede önerildiği gibi, bitki dokularındaki mantar endofitlerini ortaya çıkarmak için farklı görüntüleme teknikleri uygulanabilir. Bitki organlarının serbest ve ince bölümleri boyanabilir ve daha sonra ışık mikroskobu kullanılarak gözlemlenebilir. Buğday tohumu aglutininine konjuge edilmiş bir florokrom, mantarlara uygulanabilir ve konfokal mikroskopide bitki hücre duvarlarını vurgulamak için Calcofluor White ile birlikte inkübe edilebilir. Ek olarak, tarama ve iletim elektron mikroskobu metodolojileri mikoheterotrofik orkideler için detaylandırılmıştır ve bu protokollerin ilgili bitkilerde uygulanması olanakları araştırılmaktadır. Orkide tohumlarının simbiyotik çimlenmesi (yani, mikorizal mantarların varlığında), protokolde, çimlenmenin farklı aşamalarından elde edilen yapıların ışık, konfokal ve elektron mikroskobu ile analizler için hazırlanması olanakları ile birlikte ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

Bitki dokusunun sabitlenmesinin temel aşamalarını takiben, hücresel bileşenlerin ve dokuların morfolojisi, hacmi ve mekansal organizasyonu göz önüne alındığında, canlı duruma mümkün olduğunca benzer hücresel yapılar verir16. Kimyasal fiksasyondan sonra numunelerde bu özellikleri gözlemleyin (Şekil 4). Şekil 4C-F, ışık mikroskobu altında yeterince sabitlenmiş örnekleri temsil e...

Watch this Scientific Journal Video about Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds at JoVE.com

Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds

Bu protokol, mikoheterotrofik bitki örneklerinin toplanması, sabitlenmesi ve sürdürülmesi için ayrıntılı prosedürler sağlamayı, mikorizal mantarlarla çimlenmiş bitki dokularında ve tohumlarda mantar kolonizasyonunu incelemek için tarama ve iletim elektron mikroskobu, ışık, konfokal ve floresan mikroskobu gibi farklı mikroskopi tekniklerini uygulamayı amaçlamaktadır.

Mikoheterotrofik Bitki Dokularında Mantar Kolonizasyonunu Yorumlamak ve Tohumların Simbiyotik Çimlenmesi için Mikroskopi Teknikleri

Structural botany is an indispensable perspective to fully understand the ecology, physiology, development, and evolution of plants. When researching ...

Protokol, mikoheterotrofik bitkilerde mantar kolonizasyonunu anlamak için uygulanan çeşitli mikroskopi tekniklerini, numune toplamaktan ayrıntılı olarak hazırlamaya ve gerekli adımları içerir. Bu tür teknikler çeşitli mikoheterotrofik bitkilere ve hatta bir bitkinin mikoheterotrofik dışındaki materyallerine uygulanabilir. Bu yöntem esas olarak yapısal botanik ile ilgilidir ve aynı zamanda mikorizal etkileşimler, fizyoloji, üreme biyolojisi, evrimi ve mikoheterotrofik bitkilerin ekolojisi hakkında fikir verebilir.Başlamak için, bitki tabanının etrafındaki toprağı keşfederek, yeraltı organlarına zarar vermemeye özen göstererek mikoheterotrofik bitkileri toplayın. Ayrıca, hava organlarının yeraltı organlarından bağlantısını kesmeyi önlemek için bitkileri yerden çekmekten kaçının. Kökler, gövdeler, rizomlar ve depolama organları gibi yeraltı organlarını bu yapılara zarar vermeden keşfederken bir bahçe malası kullanarak hava yapılarını dikkatlice kazın.Kırılgan yapıları korumak için toprak parçacıklarını çıkarın ve numuneleri sabitlemeden önce kalan toprak parçacıklarını durulamak için bu organları musluk suyuyla hassas bir şekilde yıkayın. Yaprak çöpü ile ilişkili mikoheterotrofik bitkiler ekstra dikkat gerektirir. Bu nedenle, ayrışan malzemeye bağlı hassas organları, bağlı yapılardan çekmeden hifleri aracılığıyla dikkatlice toplayın.Bu tür bağlantılara sahip yapıları koruyun ve analiz için çöpleri toplayın. İletim elektron mikroskobu analizi için, bir damla glutaraldehit sodyum kakodilat tamponu içindeki 3 ila 4 milimetre kalınlığındaki numuneleri 1 ila 2 milimetre kalınlığında daha küçük bölümlere ayırın. Kesilen kenarları damlanın dışına atın.Bitkilerin toplanmasından hemen sonra toplama sahasında sabitleme işleminin yapıldığından emin olun. Bölümleri, katkı maddesi fiksatif olduğu için numunelerin hacminden 10 kat daha fazla fiksatif hacme sahip bir toplama tüpüne derhal aktarın. Organlardaki yüzeysel hifaların yüzey analizi için, özellikle yeraltı organlarında ve yaprak çöpü ile temas edenlerde.Diseksiyon mikroskobu altında taze veya sabit malzemeyi 7.5x veya daha yüksek bir büyütmede gözlemleyin. Yüzeysel hifalar ve rizomorflar tarafından yönlendirilen ilgi alanlarını araştırın. Yüzeysel rizomorf alanlarını içeren örnekleri seçin, çünkü bunlar köklerde ve gövdelerde kortikal hücreler içindeki pelotonları ve hifa bobinlerini görselleştirmek için bölümlere ayrılabilir.Metin makalesinde açıklandığı gibi 0.1 molar fosfat tamponunda mililitre buğday tohumu aglütinin florokrom konjugatı ve% 1 kalkoflor beyaz çözeltileri başına 0.2 miligram hazırlayın. Şimdi, cam slaytlar üzerindeki bölümleri, 30 dakika boyunca buğday tohumu aglutinin florokrom konjugat çözeltisi ile düzgün bir şekilde kaplayarak inkübe edin. Kuluçkadan sonra, bölümleri 0.1 molar fosfat tamponu ile yıkayın ve bunları bir montaj ortamı olarak kalkoflor çözeltisinde inkübe edin.Daha sonra, kapak fişlerini slaytların üzerine yerleştirin ve belirtilen filtreleri kullanarak bir konfokal veya floresan ışık mikroskobu altında gözlemleyin. Numuneleri sabitledikten sonra, dehidrasyon gerçekleştirdikten ve% 70 etanol içinde sakladıktan sonra, tek yönlü bir hareketle kesimler yapmak için keskin ve yeni bir tıraş bıçağı kullanarak elektron mikroskobu analizini taramak için istenen herhangi bir yüzeyi açığa çıkarın. Gerekirse, numuneleri seçmek için bir stereo mikroskop kullanın ve numune boyutlarını belirlerken metal saplamalar alanını göz önünde bulundurun.Ayrıca, numuneleri etanolik bir seride dehidrate edin. Her konsantrasyonda 30 dakika boyunca küçük ve hassas numuneleri ve 1 saat boyunca daha büyük ve daha yoğun numuneleri saklayın. Ardından, sonraki adımlar için numuneleri düzenlemek üzere kağıt mendil kullanarak küçük zarfları katlayın.Daha büyük numuneler zarf olmadan işlenebilir. Zarfları bir kalem kullanarak etiketleyin ve örneklerin bir günlüğünü tutun. Numuneleri dikkatlice bir boya fırçası kullanarak zarfların içine yerleştirin.Şimdi, bu örnekleri mutlak etanolde tutun. Standart çalışma prosedürlerine göre kritik noktalı kurutucuyu çalıştırarak kritik nokta kurutmaya hemen devam edin. Bunun için, numuneleri mutlak etanol içine bir numune tutucuya yerleştirin ve kritik nokta kurutucunun basınç odasına yerleştirin.Ara sıvı, kritik karbondioksit noktasında geçiş sıvısına çözünür ve böylece numuneleri kurutur. Atmosferik nemin yeniden emilimi numuneleri tahrip edebileceğinden, kritik nokta kuruduktan hemen sonra bir kurutma kabında saklayın. Numuneleri metal saplamalara monte etmeden önce, saplamaları manipüle etmek için eldivenleri takın.Herhangi bir yağı ortadan kaldırmak ve kurumasını sağlamak için 5 dakika boyunca asetona batırın. Bir stereo mikroskop altında, numuneleri iletken çift taraflı karbon yapışkan bant kullanarak saplama üzerine sabitleyin ve konumlandırın. Yukarıdan gelen site, elektron mikroskobu görüntülerinin taranmasında mümkün olan tek perspektiftir.Örnekleri manipüle etmek için ince noktalı cımbız kullanın. Cımbızın dokunduğu numune kısmı genellikle hasar görür. Bu yüzden dikkatli olun ve ilgi alanlarından uzakta konumlandırılmış parçalara dokunmayı deneyin.Saplamaları, silika jel ile kapalı bir Petri kabında numunelerle koruyun. Daha sonra, standart çalışma prosedürlerini izleyerek düşük basınçlı bir inert gaz atmosferinde numunelerin yüzeyinde bir altın veya platin tabakası biriktirmek için püskürtme kaplamasına devam edin. Kaplama kalınlığı numunenin topografyasına bağlıdır ve genellikle 15 ila 40 nanometre arasındadır.Son olarak, kaplanmış saplamaları, nemi koruyan silika jel ile kapalı bir Petri kabında saklayın. Numuneler bu şekilde haftalarca saklanabilir. Bu örnekleri analiz etmek için taramalı elektron mikroskobu kullanın.Bir elektron ışını, tarama elektron mikroskobu sırasında vakuo örneğine çarpar ve bu etkileşimden kaynaklanan sinyal emisyonu görüntü olarak yorumlanır. Tohumların simbiyotik çimlenmesinde kullanılan çözeltilerin ve malzemelerin steril olduğundan emin olun. kontaminasyonu önlemek için.Onları 121 santigrat derecede 20 dakika otoklavlayarak başlayın. Laminer bir hava akımı başlığında, meyveleri ve tohumları% 2 aktif klor içeren bir sodyum hipoklorit çözeltisine batırarak yüzeysel olarak dezenfekte edin. İnce ve kırılgan tohumlar 1: 1 seyreltilmiş sodyum hipoklorit çözeltisine daldırılabilir.Dezenfeksiyondan sonra tohumları kserografik kumaş kullanarak filtreleyerek geri kazanın. Çimlenme testlerine devam etmeden önce hipoklorit çözeltisini çıkarmak için meyveleri ve tohumları otoklavlanmış damıtılmış suda üç kez yıkayın. Gerekirse, bunları 4 santigrat derecede silika jel içeren cam şişelerin içinde filtre kağıdı zarflarında saklayın ve şişeleri hermetik olarak kapatın ve sarılma filmi ile kapatın, ardından son yıkamadan patates dekstroz agarına birkaç damla su aktararak yıkama işleminin etkinliğini değerlendirin.Orkide tohumlarının simbiyotik çimlenmesi için, yulaf ezmesi agar kültürü ortamı içeren Petri kaplarına yerleştirilen 1 ila 2 santimetrelik otoklavlanmış filtre kağıdı disklerinin üzerindeki tohumları kuluçkaya yatırın. Şimdi, Petri kabının merkezini, seçilen izole mantardan miselyum içeren kültür ortamı parçasıyla aşılayın. Petri kaplarını sarılma filmi ile kapatın ve mantar büyümesine bağlı olarak karanlıkta yaklaşık 25 santigrat derece veya oda sıcaklığında inkübe edin.Çimlenme testi için negatif kontrol olarak tohumlu ve mantar aşılaması olmayan bazı yemekler hazırlayın. Nicel ve nitel verileri toplayarak ve protokormları ve fideleri fotoğraflayarak çimlenme sonuçlarını haftalık olarak analiz edin. Rizomorflar genellikle koyu, ayakkabı ipi benzeri yapılar olarak kolayca tanınabilir.Freehand veya 10 mikrometreden daha kalın kesitler elde etmenin diğer yöntemleri, pelotonları daha iyi ortaya çıkarabilir ve kolonizasyonun mantar modellerinin daha temsili görüntülerini sağlayabilir. Serbest bölümler, daha yüksek amplifikasyonda hifa analizi için de uygun olabilir. Bununla birlikte, detaylar daha ince bölümlerde daha iyi elde edilir.Ksilem elementlerindeki sekonder hücre duvarları, toluidin elde ettiği açık renk ile kolayca tanımlanabilir. Bu arada, sadece birincil hücre duvarlarından oluşan floem elementleri, daha ince ve daha koyu hücre duvarları ile tanımlanır. Otofloresan ile yapılan eserler glikol metakrilat reçine kesitlerinde görülebilir.Bu eserler genellikle florokrom konsantrasyonu ile ilgilidir ve numunelerin tamponla daha fazla sayıda yıkanmasıyla önlenebilir. Kökün serbest bölümü iç ve dış hifaları gösterir. Aynı organ, yüzeyinde bol miktarda rizomorf ve bireysel hifa bulunan elektron mikroskobu taranarak görülebilir.Çoğu orkide türü, aşılanmış mantar tarafından enfekte edildikten birkaç hafta sonra veya yaklaşık bir aydan fazla bir süreye kadar çimlenir. Taramalı elektron mikroskobundaki ışık, üreme biyolojisini veya mikoheterotrofik bitkileri araştırmak için çiçeklere, meyvelere ve tohumlara uygulanabilir. Tohumların simbiyotik çimlenmesi ototrofik orkidelerde de test edilebilir.

Research

JoVE Journal

Biology

Obtaining Hemocytes from the Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes and Observing their Adherence to Symbiotic and Non-Symbiotic Bacteria

Obtaining Hemocytes from the Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes and Observing their Adherence to Symbiotic and Non-Symbiotic Bacteria

Hawaii Bobteylleri Squid Hemocytes Alınması Euprymna scolopes Ve Simbiyotik ve Non-Simbiyotik Bakteriler bağlılık Gözlem

Studies concerning the role of the immune system in mediating molecular signaling between beneficial bacteria and their hosts have, in recent years, made ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

İyon Kanalları incelenmesi için yama Kelepçe ve Perfüzyon Teknikleri cinsinden ifade edilir Xenopus Oosit

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Tandem Yüksek basınçlı Donma ve Transmisyon Elektron Mikroskobu için Bitki Doku Hızlı Dondurma Değişiklik

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Ölçme Mekansal ve zamansal Ca<sup&gt; 2+</supArabidopsis Bitkilerde&gt; Sinyalleri

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Otofaji Analiz<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Floresan Mikroskopi ile Kombinasyon Açlık Pedleri kullanarak

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Sorunlu Tesisi, Oomiçet ve fungal Örnekleri için Elektron Mikroskobu (SEM) Protokoller tarayarak

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

Bir Gel Yüzeyinde Büyüyen Bitki kökleri Işık Sac Flüoresan Mikroskopi

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Bir Deniz Tubeworm Canlı Optik ve Elektron Mikroskobu Teknikleri Kullanılarak kalsifikasyon Olaylar Karakterizasyonu

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

Basit ve etkili yönetim ve küçük balıklar böbrek enjeksiyon kullanarak dolaşım sistemi içinde Microparticles görselleştirme

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

Micron-scale Phenotyping Techniques of Maize Vascular Bundles Based on X-ray Microcomputed Tomography

X-ışını Microcomputed tomografi üzerinde dayalı Mısır Vaskular demetleri mikron çaplı fenotipleme teknikleri

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a ...