Name: confocal and super-resolution imaging of polarized intracellular trafficking and secretion of basement membrane proteins during drosophila oogenesis
Uploaded: 2022-05-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis at JoVE.c

المؤلفون ممتنون لجولي ميركل على تعليقاتها المفيدة على المخطوطة. تم دعم هذا العمل من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة R15GM137236 إلى O.D. تم الحصول على الصور البؤرية وفائقة الدقة باستخدام Zeiss LSM 900 مع Airyscan 2 ، والتي تم شراؤها باستخدام منحة التصوير بالرنين المغناطيسي NSF 2018748.

1. يطير التحضير لتسلخ المبيض
<ol><li>ضع 10-15 ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر ذبابة الفاكهة (1-2 أيام من العمر 1-2 أيام) من النمط الوراثي المطلوب في قارورة ضيقة تحتوي على ~ 8 مل من ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة المتوسطة مع رشها بكمية صغيرة من خميرة الخباز المحببة قبل 2-3 أيام من تشريحها ع...

BM أمر بالغ الأهمية للتكوين الجنيني والأعضاء ، والوظائف الفسيولوجية للبالغين. علاوة على ذلك ، يعمل BM كمنصة إشارات لإنشاء وصيانة القطبية الظهارية ويوفر الأنسجة مع الدعم2. ومع ذلك ، فإن الآليات التي تنظم الموضع السليم لبروتينات BM غير مفهومة بشكل جيد. يتطلب الفهم الأفضل للمسارات ...

الغشاء السفلي (BM) هو ورقة رقيقة من مصفوفة خارج الخلية ملتصقة بالخلايا (ECM) ذات طبقات ضرورية للبنية الظهارية والتشكل1. وهو يتألف من ~ 50 بروتينا ويوجد في كل مكان وراء الخلايا الظهارية والبطانية ، ويغلف خلايا العضلات الهيكلية والملساء والقلبية والخلايا الشحمية1،2،3. المكونات الرئيسية الثلاثة ل BM في الجانب القاعدي من الخلايا الظهارية هي الكولاجين الرابع والبيرليكان واللامينين. BM يكمن وراء الخلايا الظهارية وهو مسؤول عن العديد من الوظائف ، بما في ذلك فصل الأنسجة وحاجزها ، والنمو والدعم ، واستقطاب الخلايا2،3،4،5،6،7،8،9،10،11،12 . دورها كمنصة إشارات ينظم مورفولوجيا وتمايز الخلايا والأنسجة الظهارية أثناء التطور3،13،14. علاوة على ذلك ، فإن سوء تنظيم BM و / أو خرق سلامته هما السببان الرئيسيان للعديد من الحالات المرضية ، بما في ذلك ورم خبيثورم 2،15،16. على الرغم من الوظائف الأساسية التي يؤديها BM أثناء تكوين الأنسجة والأعضاء ، فإن مكونات المسار (المسارات) البيولوجية المخصصة للاتجار المستقطب داخل الخلايا وإفراز بروتينات BM معروفة بشكل غامض.
لدراسة الاتجار داخل الخلايا للحويصلات المحتوية على BM وإفراز بروتينات BM بواسطة الخلايا الظهارية ، فإن الظهارة الجريبية (FE) لمبيض ذبابة الفاكهة هي نظام نموذجي قوي (الشكل 1). يتكون مبيض ذبابة الفاكهة من 16-20 بنية طويلة تشبه الأنبوب ، تسمى المبيضات (الشكل 1A ، B) 17،18،19. يمكن اعتبار كل مبيض خط تجميع البيض ، مع التقدم العمري لغرف البيض (التي تؤدي كل منها إلى بويضة) التي تبدأ في الطرف الأمامي وتتحرك خلفيا ، حتى تخرج البويضة الناضجة عبر قناة البيض. يتم تغليف كل غرفة بويضة بواسطة FE ، وهي طبقة أحادية من خلايا الجريب الجسدية (FCs) ، التي تحيط بخلايا الخط الجرثومي المركزي (GCs). FE مستقطب للغاية مع قطبية قطبية قطبية قاعية مميزة حيث يواجه المجال القمي الخط الجرثومي ، ويتم إفراز بروتينات BM بشكل أساسي18,19. تفرز FCs بنشاط جميع المكونات الرئيسية ل BM ، بما في ذلك الكولاجين الرابع والبيرليكان و Laminins20,21. في الخلايا الظهارية مثل FCs ، يتم إنتاج مكونات BM وتتطلب مسار إفراز مستقطب متخصص لترسيبها خارج الخلايا. على سبيل المثال ، في حالة المكون الأكثر وفرة في BM ، الكولاجين IV (Coll IV) ، فإن التفاصيل المحيطة بالاتجار والإفراز المستقطبين داخل الخلايا غامضة على الرغم من أن إنتاجه وترسيبه هما محور العديد من الدراسات. يتم ترجمة Coll IV في الشبكة الإندوبلازمية (ER) ، والتي يتم فيها أيضا تجميع كل ليف - يتكون من ثلاثة ببتيدات متعددة (سلسلتان α1 وسلسلة α2 واحدة) - في حلزون ثلاثي22. يتطلب الطي السليم ل Coll IV ووظيفته مرافقات وإنزيمات ER ، بما في ذلك lysyl و prolyl-hydroxylases مثل Plod و PH4αEFB 20,22,23,24,25,26. تنظم هذه الإنزيمات ما بعد الانتقالية فرز ER ل Coll IV ، حيث يؤدي فقدان كل منها إلى محاصرة Coll IV في ER القاعدي20,23,24,25,26. بعد ذلك ، يخرج Coll IV المركب حديثا من ER ل Golgi في الحويصلات المغلفة ب COPII. يساعد مستقبل الشحن Tango1 في تعبئة الكولاجين في حويصلات كبيرة مرتبطة ب Golgi يمكنها استيعاب بروتينات كبيرة متعددة الوسائط20,27. بمجرد تعبئة Coll IV في حويصلات خارجية داخل الخلايا ، يتم إفرازه بشكل أساسي من الخلايا الظهارية. لتوجيه ترسب BM إلى الجانب القاعدي ، تتطلب الخلايا الظهارية مجموعة أخرى من العوامل المخصصة خصيصا لإفراز BM المستقطب. باستخدام FE من مبيض ذبابة الفاكهة ، تم توصيف بعض مكونات هذه العملية الخلوية الجديدة ، بما في ذلك عوامل تبادل النيوكليوتيدات (GEFs) Crag و Stratum ، و GTPases Rab8 و Rab10 ، بالإضافة إلى مستويات phosphoinositide PI (4,5) P2 ، و Kinesin 1 و 3 البروتينات الحركية 20,28,29,30,31 . هذه المكونات حاسمة في ضمان التوزيع المستقطب لبروتينات BM.
لمراقبة التوطين داخل الخلايا لبروتينات BM في FE ، يمكن استخدام بروتينات الغشاء السفلي الموسومة داخليا (مصائد البروتين) ، مثل Viking-GFP (Vkg-GFP أو α2 Coll IV-GFP) و Perlecan-GFP (Pcan-GFP)32,33. وقد ثبت أن خطوط فخ البروتين هذه تعكس بدقة التوزيع الداخلي لبروتينات BM وتسمح باكتشاف أكثر حساسية للاتجار الحويصلي28,30. تم تمييز المكونات المشاركة في الترسيب المستقطب ل BM في FE لأول مرة باستخدام خطوط مصيدة البروتين ل Vkg-GFP و Pcan-GFP 20,28,29,30. يمكن استخدام مصائد البروتين في خلفيات جينية مختلفة ، بما في ذلك الطفرات وخطوط Gal4 34. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام مصائد البروتين مع أصباغ الفلورسنت و / أو تلطيخ المناعة الفلورية ، مما يسمح بتوصيف دقيق لتوطين بروتينات BM عند مقارنة النوع البري والظروف الطافرة35.
لتقييم توزيع وتوطين الحويصلات المحتوية على بروتين BM بدقة وكفاءة، يقدم الفحص المجهري للمسح بالليزر البؤري (CLSM) وتقنيات التصوير فائقة الدقة ميزة كبيرة لأساليب التصوير الأخرى. تجمع هذه الأساليب بين التصوير عالي الدقة وسهولة الاستخدام النسبية. CLSM هي تقنية الفحص المجهري التي تسمح بتحسين الدقة البصرية عن طريق مسح العينة بالليزر بطريقة المسح النقطي باستخدام الجلفانومترات. فتحة الثقب هي مكون أساسي في المجهر البؤري. من خلال حجب الإشارات خارج التركيز البؤري القادمة من أعلى أو أسفل المستوى البؤري، ينتج عن فتحة الثقب دقة فائقة للغاية في المحور z36. هذا يجعل من الممكن أيضا الحصول على سلسلة من الصور في المستوى z ، تسمى z-stack ، المقابلة لسلسلة من الأقسام البصرية. تقوم مكدسات z لاحقا بإنشاء صورة ثلاثية الأبعاد للعينة ، عبر إعادة الإعمار ثلاثية الأبعاد ، بمساعدة برنامج التصوير. تسمح المجاهر التقليدية الفائقة التألق (واسعة المجال) ، على عكس المجاهر البؤرية ، للضوء خارج التركيز البؤري بالمساهمة في جودة الصورة ، مما يقلل من دقة الصورة والتباين36,37. وهذا يجعل المجهر الفائق التألق مرشحا أقل جاذبية عند دراسة توطين البروتين أو التوطين المشترك.
على الرغم من أن CLSM هو نهج مناسب لمختلف التطبيقات ، بما في ذلك التصوير وتوصيف الاتجار داخل الخلايا من بروتينات BM ، إلا أنه لا يزال يمثل مشكلة عند تصوير عينات أقل من حد حيود آبي للضوء (200-250 نانومتر). عند تصوير مثل هذه العينات ، يمكن أن يؤدي الفحص المجهري البؤري ، خاصة عند استخدام هدف نفطي ، إلى دقة عالية. ومع ذلك ، فإن تقنيات الدقة الفائقة تتجاوز حد الفحص المجهري البؤري. هناك العديد من الأساليب لتحقيق الفحص المجهري فائق الدقة ، لكل منها حدود دقة محددة ، وكل منها مناسب للتحليلات المختلفة. وتشمل هذه النهج مجهر التوطين المنشط ضوئيا (PALM) أو المجهر البصري العشوائي لإعادة البناء (STORM) ، والفحص المجهري لاستنفاد الانبعاثات المحفزة (STED) ، ومجهر الإضاءة الهيكلية (SIM) ، ومجهر Airyscan (فائق الدقة)38،39،40،41،42،43،44،45،46 . على الرغم من أن Airyscan لديه دقة أكثر خشونة من PALM / STORM ، STED ، و SIM ، إلا أنه لا يزال بإمكانه تحقيق دقة تصل إلى ~ 120 نانومتر (حوالي ضعف دقة CLSM). علاوة على ذلك ، فقد ثبت أن نهج الفحص المجهري فائق الدقة هذا يتمتع بميزة على بطاقة SIM وغيرها من التقنيات فائقة الدقة عند تصوير عينات سميكة وعينات ذات نسبة إشارة إلى ضوضاء منخفضة47,48.
Airyscan هي تقنية مجهرية بؤرية فائقة الدقة جديدة نسبيا46. على عكس CLSMs التقليدية ، التي تستخدم كاشفات الثقب والنقطة الواحدة لرفض الضوء خارج التركيز البؤري ، يستخدم هذا النهج فائق الدقة كاشف منطقة أنبوب المضاعف الضوئي لأنبوب الزرنيخيد الغاليوم (GaAsP) المكون من 32 قناة والذي يجمع كل الضوء في كل موضع مسحضوئي 45. يعمل كل جهاز من أجهزة الكشف ال 32 كثقب صغير ، مما يقلل من حجم الثقب من وحدة 1.0 Airy Unit التقليدية (A.U.) إلى 0.2 A.U. المحسنة ، مما يتيح دقة أعلى ونسبة إشارة إلى ضوضاء ، مع الحفاظ على كفاءة قطر 1.25 A.U.45. علاوة على ذلك ، فإن فك الالتفاف الخطي المستخدم من قبل Airyscan يؤدي إلى زيادة تصل إلى 2x في الدقة45. مع أخذ ذلك في الاعتبار ، فإن CLSM ، وتحديدا الفحص المجهري فائق الدقة ، مناسب تماما لدراسة بروتينات BM والبروتينات التي تنظم الترسيب القاعدي لبروتينات BM ، حيث يمكنها إنتاج صور عالية الدقة للغاية لدراسات التوطين والتوطين المشترك ، وبالتالي توفير رؤى جديدة في الأحداث المكانية والزمانية والجزيئية التي تتحكم في هذه العمليات.
هناك نهج بديل للفحص المجهري البؤري الذي يمكن استخدامه لإجراء تجارب التوطين وهو إزالة التفاف الصورة. نظرا لأن الفحص المجهري واسع المجال يسمح للضوء خارج نطاق التركيز البؤري بالوصول إلى أجهزة الكشف ، يمكن تطبيق خوارزميات إزالة الالتفاف الرياضية والحسابية لإزالة أو إعادة تعيين الضوء خارج التركيز البؤري من الصور التي تم الحصول عليها بواسطة الفحص المجهري واسع المجال ، وبالتالي تحسين دقة وتباين الصورة49. يمكن أيضا تطبيق خوارزميات فك الالتفاف على الصور متحدة البؤرة لزيادة الدقة والتباين ، مما ينتج صورا نهائية مماثلة تقريبا لتلك الموجودة في المجهر فائق الدقة50. تستفيد Airyscan من إزالة الالتفاف القائمة على مرشح Weiner إلى جانب إعادة تعيين بكسل Sheppard ، مما يؤدي إلى دقة مكانية محسنة للغاية ونسبة إشارة إلى ضوضاء. بالمقارنة مع المجهر البؤري ، لوحظت زيادة قدرها 2x في الدقة في جميع الأبعاد المكانية الثلاثة (120 نانومتر في x و y ، و 350 نانومتر في z) عند استخدام تقنية الفحص المجهري فائقة الدقة45,51.
توفر هذه المخطوطة بروتوكولات مفصلة ومحسنة لتلطيخ واكتساب وتصور الاتجار داخل الخلايا وترسب بروتينات BM باستخدام FE لمبيض ذبابة الفاكهة كنظام نموذجي إلى جانب الفحص المجهري البؤري وفائق الدقة. خطوط ذبابة الفاكهة التي تعبر عن بروتينات الغشاء السفلي الموسومة داخليا ، على سبيل المثال ، Vkg-GFP و Pcan-GFP ، هي أدوات فعالة ودقيقة لتصور الاتجار ببروتين BM وإفرازه. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدامها بسهولة في خلفيات جينية مختلفة ، بما في ذلك الخطوط المتحورة و Gal4 / UAS 34. على الرغم من التوصية باستخدام بروتينات الغشاء السفلي الموسومة داخليا ، إلا أن استخدام الأجسام المضادة ضد بروتينات BM محددة متوافق أيضا مع البروتوكولات الموصوفة. هذه البروتوكولات مفيدة بشكل خاص للعلماء المهتمين بدراسة الاتجار داخل الخلايا وإفراز بروتينات BM في الأنسجة الظهارية السليمة باستخدام التصوير البؤري وفائق الدقة. علاوة على ذلك ، فإن القدرة على الجمع بين تحليل الأنسجة الظهارية والأدوات الواسعة لعلم الوراثة ذبابة الفاكهة تجعل هذا النهج قويا بشكل خاص. وأخيرا، يمكن تكييف هذه البروتوكولات بسهولة لدراسة الاتجار بالحويصلات وفرز البروتينات الأخرى ذات الأهمية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A22283</td>
			<td>F-Actin Stain (1/500 of 66&#181;M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A22287</td>
			<td>F-Actin Stain (1/100 of 66&#181;M))</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GM130 Antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab30637</td>
			<td>For Golgi Stain (colocalization); use as concentration of 7&#181;g/uL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua-Polymount</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>1860620</td>
			<td>Mounting Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bakers Yeast (Active Dry Yeast)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>62-103</td>
			<td>To fatten the overies for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (30% solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7284</td>
			<td>For blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depression wells</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>7156101</td>
			<td>For dissection (glass concavity slide can be used instead)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting needle</td>
			<td>Fisher scientifc</td>
			<td>13-820-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Incubator</td>
			<td>Genesee Scientific/Invictus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stock: Perlecan-GFP Drosophila line (ZCL1700)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Morin et al., 2001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stock: UAS-Crag RNAi line (TRIP line HMS00241)</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>33594</td>
			<td>RNAi against Crag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stock: Viking-GFP Drosophila line (CC00791)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Buszczak et al., 2007</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stock: Vkg-GFP, tj-Gal4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Devergne et al., 2017. Drive the expression of Crag RNAi in the FE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (Dumont 5)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td>For dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Concavity Slide</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>7187804</td>
			<td>For dissection (depression wells can be used instead)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11036</td>
			<td>Secondary antibody (GM130 antibody) (5 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst (Hoechst 33342)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>DNA Stain (1 ug/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>Fisher Scientific: 06-666</td>
			<td>Delicate task wipers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Fluorescent Stereo Microscope&#160; M165 FC</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>For ovary imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Corning</td>
			<td>294875X25</td>
			<td>Microscope Slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutating platform rocker</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>6720</td>
			<td>For ovary fixation and staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutri-Fly BF</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>66-121</td>
			<td>Fly Food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 20% Solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Fisher Scientific: 15713</td>
			<td>For PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline Tablets</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP2944100</td>
			<td>For PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Glass Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36980</td>
			<td>Mounting Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Cover Glass</td>
			<td>Corning</td>
			<td>285022</td>
			<td>Cover glass for microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton x-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9036-19-5</td>
			<td>For PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 900 with Airyscan 2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Confocal and super-resolution Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Stemi 305 Stereo Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Dissecting microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Zen Software version 3.3 (Blue Edition)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Image acquisition and processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

confocal and super-resolution imaging of polarized intracellular trafficking and secretion of basement membrane proteins during drosophila oogenesis

الغشاء السفلي (BM) - وهو ورقة متخصصة من المصفوفة خارج الخلية الموجودة في الجانب القاعدي من الخلايا الظهارية - أمر بالغ الأهمية لإنشاء وصيانة مورفولوجيا الأنسجة الظهارية ومورفوجينيا الأعضاء. علاوة على ذلك ، فإن BM ضروري لنمذجة الأنسجة ، حيث يعمل كمنصة إشارات ، ويوفر قوى خارجية لتشكيل الأنسجة والأعضاء. على الرغم من العديد من الأدوار الهامة التي يلعبها BM أثناء التطور الطبيعي والظروف المرضية ، فإن المسارات البيولوجية التي تتحكم في الاتجار داخل الخلايا للحويصلات المحتوية على BM وكيف يؤدي الإفراز القاعدي إلى الترسيب المستقطب لبروتينات BM غير مفهومة بشكل جيد. الظهارة الجريبية لمبيض ذبابة الفاكهة هي نظام نموذجي ممتاز لدراسة الترسيب القاعدي لبروتينات غشاء BM ، لأنها تنتج وتفرز جميع المكونات الرئيسية ل BM. يسمح التصوير البؤري والفائق الدقة جنبا إلى جنب مع معالجة الصور في الأنسجة الثابتة بتحديد وتوصيف العوامل الخلوية المشاركة على وجه التحديد في الاتجار داخل الخلايا وترسب بروتينات BM. تقدم هذه المقالة بروتوكولا مفصلا لتلطيخ وتصوير الحويصلات المحتوية على BM و BM المودعة باستخدام بروتينات موسومة داخليا في الظهارة الجريبية لمبيض ذبابة الفاكهة . يمكن تطبيق هذا البروتوكول لمعالجة كل من الأسئلة النوعية والكمية وتم تطويره لاستيعاب الفحص عالي الإنتاجية ، مما يسمح بالتحديد السريع والفعال للعوامل المشاركة في الاتجار المستقطب داخل الخلايا وإفراز الحويصلات أثناء تطور الأنسجة الظهارية.

يمكن استخدام الطرق الموضحة هنا لتصوير وتوصيف الاتجار داخل الخلايا وإفراز بروتينات BM داخل الخلايا في الخلايا الظهارية المستقطبة ، مثل FE من مبيض ذبابة الفاكهة . بعد ذلك ، نقدم النتائج المتوقعة التي تم الحصول عليها باستخدام الطرق الموصوفة ، بالإضافة إلى المشورة المفيدة والمزالق المحتم...

Watch this Scientific Journal Video about Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis at JoVE.c

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

الغشاء السفلي ضروري لتشكل الأنسجة والأعضاء أثناء التطوير. لفهم أفضل للآليات التي تؤدي إلى وضع هذا الهيكل بشكل صحيح ، يصف البروتوكول المقدم طرقا لتصور وتوصيف الاتجار داخل الخلايا وإفراز بروتينات الغشاء السفلي في الخلايا الظهارية باستخدام المجهر البؤري وفائق الدقة.

التصوير البؤري وفائق الدقة للاتجار المستقطب داخل الخلايا وإفراز بروتينات الغشاء السفلي أثناء تكوين بويضات ذبابة الفاكهة

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment ...

يسمح هذا البروتوكول بتوصيف الاتجار داخل الخلايا وإفراز بروتينات الغشاء السفلي باستخدام مصفوفة ذبابة الفاكهة كنظام نموذجي. الميزة الرئيسية لتقنيتنا هي أنها تسمح بتصوير عالي الدقة للاتجار داخل الخلايا ببروتينات الغشاء السفلي باستخدام البروتينات الموسومة داخليا والمجهر فائق الدقة Airysscan. على الرغم من أن هذا البروتوكول تم تطويره لتصوير الاتجار داخل الخلايا ببروتينات الغشاء السفلي ، إلا أنه يمكن توسيعه لدراسة الاتجار بالبروتينات الأخرى ذات الأهمية والأنظمة البيولوجية الأخرى ، بما في ذلك زراعة الخلايا والمواد العضوية.للبدء ، بعد تشريح مبيض ذبابة الفاكهة في PBS تحت نطاق تشريح ، أضف ملليلتر واحد من محلول التثبيت وقم بإصلاح المبيضين على منصة الجوز لمدة 15 دقيقة. قم بإزالة محلول التثبيت وقم بإجراء غسلتين سريعتين ، كل منهما يحتوي على ملليلتر واحد من PBST. عن طريق عكس أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة بلطف من خمس إلى ست مرات ، ثم إجراء أربع غسلات طويلة لمدة 10 دقائق لكل منها مع ملليلتر واحد من PBST على هزاز منصة التغذية.بعد إجراء التثبيت والغسيل ، قم بإزالة PBST ، ثم أضف ملليلتر واحد من محلول الحجب وقم بحظر المبيضين على هزاز منصة الجوز لمدة ساعة واحدة على الأقل. بعد ذلك ، قم بإزالة محلول الحجب وإضافة 300 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية ، التي تحتوي على أجسام مضادة أولية مخففة بتركيزاتها المناسبة في محلول الحظر. احتضان بين عشية وضحاها على منصة الروك الجوز في 4 درجات مئوية.بعد إزالة محلول الأجسام المضادة الأولي ، قم بإجراء غسلتين سريعتين وأربع غسلات طويلة ، كما هو موضح سابقا ، ثم قم بإزالة PBST وإضافة 500 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوي الذي يحتوي على أجسام مضادة ثانوية فلورسنت من شأنها الكشف عن الأجسام المضادة الأولية المستخدمة. احتضني المبيضين في محلول الأجسام المضادة الثانوي على هزاز منصة الجوز لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة ، ثم قم بإجراء غسلتين سريعتين وأربع غسلات طويلة في PBST كما هو موضح سابقا على هزاز منصة التجويف. بعد الغسيل الأخير ، استخدم ماصة P-1000 لماصة المبيضين بلطف لأعلى ولأسفل في الأنبوب لفصل غرف البيض.اسمح لغرف البيض بالغرق في القاع عن طريق إبقاء الأنبوب في وضع مستقيم لمدة خمس إلى 10 دقائق. بعد ذلك ، قم بإزالة PBST باستخدام ماصة باستور ، تاركا ما يقرب من 50 ميكرولتر. بعد ذلك ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من PBST المتبقي باستخدام ماصة P-200 وأضف قطرتين من وسط التركيب ، وهو ما يكفي للانتشار بالتساوي على زلة الغطاء.للسماح بسهولة نقل وسط التركيب اللزج إلى الشريحة من أنبوب الطرد المركزي الدقيق، اقطع طرف ماصة P-200. بعد ذلك ، انقل ببطء جميع غرف البيض في وسط التركيب إلى الشريحة الزجاجية ، مما يضمن عدم إنشاء فقاعات. تحت مجهر تشريح ، انشر بلطف وسائط التركيب وفصل غرف البيض باستخدام طرف ماصة P-200 جديد أو ملقط لتغطية منطقة بحجم زلة الغطاء تقريبا.باستخدام الملقط ، ضع الغطاء بعناية على غرف البيض بزاوية لتجنب الفقاعات وتخزين الشريحة في درجة حرارة الغرفة على سطح مستو في الظلام لمدة يومين للبلمرة. بمجرد معالجة وسائط التركيب ، يمكن تخزين الشريحة عند 4 درجات مئوية في الظلام لبضعة أسابيع للتصوير. لتصور التوطين داخل الخلايا لبروتينات الغشاء السفلي ، اضبط الهدف على 63x وضع قطرة من زيت الغمر بلطف على عدستها ، ثم ضع الشريحة على الهدف مع انزلاق الغطاء الذي يواجه الهدف لتحديد موقع العينة.حدد المنطقة ذات الأهمية باستخدام عدسة المجهر الفائق الفلورسنت، ثم حدد تكوينا مع الإعدادات المناسبة للفلوروفورات لتصويرها كما هو موضح في المخطوطة. بمجرد تعيين التكوين، قم بتصوير العينة عن طريق تحديد Live ضمن وضع الاكتساب واضبط التكبير/التصغير بين 2 و 4x لتحسين منطقة المسح الضوئي للعينة. لكل قناة على حدة، حدد مسارا ضمن القناة وانقر على بث مباشر.اضبط الكسب الرئيسي وطاقة الليزر أثناء استخدام أداة مؤشر المدى واتبع جميع الإرشادات لتجنب وحدات البكسل المشبعة كما هو موضح في المخطوطة، مع تكرار نفس الشيء لكل قناة. في نافذة تبديل وضع الاكتساب ، ضمن حجم الصورة ، انقر فوق SR لزيادة قدرات الكاشف إلى أقصى حد وضبط حجم الإطار تلقائيا. احتفظ بالمتوسط إلى لا شيء في وضع Airyscan لأنه عادة ما يكون غير ضروري وسيقلل من وقت الفحص.ومع ذلك ، في بعض الحالات ، قد يؤدي متوسط 2x إلى تحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء ، ثم انقر فوق Snap للحصول على صورة. للحصول على مكدس Z ، انقر فوق خانة الاختيار Z-Stack ضمن علامة التبويب الاستحواذ. بعد ذلك ، حدد القناة المطلوبة لمراقبة العينة.على سبيل المثال ، قناة DAPI وانقر فوق Live لبدء فحص مباشر ، ثم قم بتعيين نطاق ل Z-stack باستخدام مقبض الضبط الدقيق على المجهر. بعد ذلك، قم بتعيين نقاط النهاية لمكدس Z بالنقر فوق تعيين أولا وتعيين أخيرا. لإعادة البناء 3D الأمثل ، قم بتعيين الفاصل الزمني ل Z-stack أقل من 0.5 ميكرومتر لتعيين حجم الخطوة وانقر فوق بدء التجربة لبدء اكتساب Z-stack.بمجرد الحصول على الصور أو مكدس Z ، انقر فوق خيار المعالجة ، ثم الطريقة وحدد معالجة Airysscan. قم بإجراء التصفية التلقائية للبدء وإذا لزم الأمر، قم بإجراء مزيد من المعالجة اليدوية عن طريق تغيير قيمة الدقة الفائقة للحصول على أفضل النتائج للعينة. بعد تحديد قيمة ريال سعودي المثلى، انقر فوق تطبيق لإنشاء صورة تمت معالجتها.في حالة صور Z-stack ، قم بالمعالجة إما كشريحة Z واحدة أو كمكدس Z بالكامل بالنقر فوق مربع معالجة 3D. لتصور الاتجار بالبروتين في 3D بعد الحصول على مكدس Z ، قم بإنشاء صورة ثلاثية الأبعاد بالنقر فوق رمز 3D في نافذة المعاينة ، والتي ستظهر في قسم التحكم في العرض في الصورة المعالجة Airyscan . من خيارات عرض 3D المختلفة، استخدم طرق العرض Surface أو Mixed عند عرض بنية الحويصلات.للحصول على صورة عالية الجودة ، حدد الإعداد الدقيق لأن الإعداد الأسرع سيكون أقل دقة ويؤدي إلى عرض 3D ضعيف. بمجرد إنشاء الصورة ، قم بمعالجة صورة 3D عن طريق التكبير والتدوير للتركيز على الموقع المفضل. بعد الحصول على العرض ، ضمن علامة التبويب 3D ، حدد الدقة المعروضة ، ثم انقر فوق إنشاء صورة ، والتي ستنشئ لقطة للصورة في نفس الاتجاه الذي تم عرضه ويمكن حفظه وتصديره بتنسيقات ملفات مختلفة.يمكن استخدام المجهر البؤري لتصور التوطين داخل الخلايا وترسب بروتينات الغشاء السفلي مثل Viking-GFP عند تحسين معلمات الاستحواذ. عندما يتم إجراء عملية الاقتناء ومعالجة الصور بشكل صحيح ، يزيد الفحص المجهري فائق الدقة من دقة الصورة مقارنة بالمجهر البؤري. كما يتضح من الصور المحددة بشكل أفضل في الاتجار داخل الخلايا ببروتينات الغشاء السفلي ، مثل الفايكنج.يسمح الإسقاط المتعامد بتصور التوزيع الكلي للحويصلات والمقصورات التي تحتوي على بروتينات الغشاء السفلي في صورة واحدة باستخدام التصوير متحد البؤرة أو فائق الدقة. تم استخدام إعادة بناء 3D عن طريق تجميع كومة من مقاطع Z البصرية التي تم التقاطها بواسطة التصوير البؤري أو فائق الدقة لتقييم توطين وتوزيع بروتينات الغشاء السفلي داخل الخلايا. يمكن استخدام التصوير فائق الدقة لتحديد التوطين الدقيق لبروتينات الغشاء السفلي في ظروف الطفرات.على سبيل المثال ، في الخلايا الظهارية القاضية Crag ، تتراكم بروتينات الغشاء السفلي بشكل قمي وأساسي ، مما يشير إلى أنها تتحكم في الإفراز المستقطب لبروتينات الغشاء السفلي. يمكن أيضا استخدام المجهر البؤري وفائق الدقة في تجارب التوطين المشترك. على سبيل المثال ، يوضح هذا الشكل التوطين المشترك الجزئي ل Viking-GFP وعلامة Golgi ، GM-130 ، مما يؤكد أن الفايكنج يتم فرزهم إلى Golgi قبل الإفراز.لتصوير الاتجار ببروتينات الغشاء السفلي بكفاءة باستخدام الفحص المجهري فائق الدقة ، نوصي بتركيب المبيضين بعناية وإيلاء اهتمام خاص عند تعيين معلمات الاكتساب والالتفاف. تم تحسين هذا البروتوكول لتصور الاتجار داخل الخلايا وإفراز بروتينات الغشاء السفلي. ومع ذلك ، يمكن تعديله بسهولة لتصوير الاتجار بالبروتينات الأخرى ذات الأهمية بكفاءة.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

يعيش متحد البؤر التصوير من تطوير نبات الأرابيدوبسيس الزهور

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

قناة Excretory C. ايليجانس كنموذج ل Morphogenesis التجويف داخل الخلايا و في فيفو الاستقطاب نشوء غشاء حيوي في "خلية واحدة": وضع العلامات بالتجارة والنقل-الأنشطار والشاشة التفاعل [رني] والتصوير

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

القرار فائقة الارتباطية والميكروسكوب الإلكتروني لحل التعريب البروتين في الشبكية الزرد

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

أساليب للأس الهيدروجيني "التصوير داخل الخلايا" من "سلالة الخلايا الجذعية جريب" في "أنسجة المبيض" المورفولوجية لايف

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

تصوير الخلايا الحية لفصل الكروموسومات أثناء الانقسام

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Analysis of Epididymal Protein Synthesis and Secretion

تحليلاً تخليق البروتين البربخيه وإفراز

The mammalian epididymis generates one of the most complex intraluminal fluids of any endocrine gland in order to support the post-testicular maturation ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

ذوبان الجليد واستزراع كريوبريسيرفينج خطوط الخلايا المورفولوجية

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

التصوير والتحليل لاتجاهات الأنسجة وديناميات النمو في الظهارة الهوائية النامية Drosophila خلال مراحل البوبال

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

تصور الاتجار المعتمد على الهيكل الخلوي للعضيات المحتوية على الدهون في أجنة ذبابة الفاكهة

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of ...

Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging

Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging

استخدام الفحص المجهري التوسعي لتكبير أجنة ذبابة الفاكهة المثبتة بالكامل جسديا للحصول على تصوير فائق الدقة

The workhorse of developmental biology is the confocal microscope, which allows researchers to determine the three-dimensional localization of tagged ...