Name: confocal and super-resolution imaging of polarized intracellular trafficking and secretion of basement membrane proteins during drosophila oogenesis
Uploaded: 2022-05-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis at JoVE.c

作者感谢朱莉·默克尔对手稿的有益评论。这项工作得到了NIH授予O.D.R15GM137236的支持。共聚焦和超分辨率图像是使用蔡司LSM 900和艾瑞斯扫描2拍摄的，由NSF MRI授权2018748购买。

1. 卵巢解剖的苍蝇准备
<ol><li>将10-15只所需基因型的 黑腹果蝇雌性苍蝇（1-2天大）放入含有〜8mL 果蝇 培养基的狭窄小瓶中，撒上少量颗粒状面包酵母，然后在25°C解剖前2-3天。 在小瓶中添加一些雄性可以提高卵室产量。但是，请确保苍蝇总数不超过20只，因为这会对卵巢发育产生负面影响。 注：关于 果蝇 雄性和雌性的描述，以及对于没有 果蝇 经验的...

BM对于胚胎和器官形态发生以及成人生理功能至关重要。此外，BM作为建立和维持上皮极性的信号平台，并为组织提供支持2。然而，调节BM蛋白正确放置的机制知之甚少。要更好地了解专门用于BM蛋白细胞内运输和极化分泌的生物途径，需要仔细分析这些途径的成分及其在BM加工中的作用。实现这一目标的一种方法是使用共聚焦和超分辨率成像。在这里，我们描述了用于制备和染?...

基底膜（BM）是一层层状细胞贴壁细胞外基质（ECM）的薄片，对上皮结构和形态发生1至关重要。它包含约50种蛋白质，并且无处不在地存在于上皮细胞和内皮细胞的下方，以及鞘状的骨骼，光滑，心肌细胞和脂肪细胞1，2，3。上皮细胞基底侧BM的三个主要成分是胶原IV，珀列坎和层粘连蛋白。BM位于上皮细胞之下，负责许多功能，包括组织分离和屏障，生长和支持，以及细胞极化2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12.它作为信号平台的作用调节发育过程中上皮细胞和组织的形态和分化3，13，14。此外，BM的错误调节和/或其完整性的破坏是许多病理状况的主要原因，包括肿瘤转移2，15，16。尽管BM在组织和器官形态发生期间具有基本功能，但专用于极化细胞内运输和BM蛋白分泌的生物途径的组分尚不清楚。
为了研究含BM囊泡的细胞内运输和上皮细胞分泌BM蛋白，果蝇卵巢的滤泡上皮（FE）是一个强大的模型系统（图1）。果蝇卵巢由16-20个长的管状结构组成，称为卵形（图1A，B）17，18，19。每个卵巢都可以被认为是一条卵子装配线，随着卵室（每个卵室产生卵子）的年龄进展，从前端开始向后移动，直到成熟的卵子通过输卵管排出。每个卵室都由FE（体细胞卵泡细胞（FC）的单层）封装，该FE围绕中央生殖细胞（GC）。FE高度极化，具有明显的顶基极性，其中顶端结构域面向种系，BM蛋白在基底层分泌18，19。FC积极分泌BM的所有主要成分，包括胶原IV，珀列康和层粘连蛋白20，21。在上皮细胞（如FC）中，产生BM组分并且需要专门的极化分泌途径才能在细胞外沉积。例如，在BM最丰富的成分胶原IV（Coll IV）的情况下，尽管其产生和沉积是许多研究的重点，但围绕其极化细胞内运输和分泌的细节是模糊的。Coll IV在内质网（ER）中翻译，这也是每个原纤维 - 由三个多肽（两个α1链和一个α2链）组成 - 组装成三螺旋22的地方。适当的 Coll IV 折叠和功能需要 ER 伴侣和酶，包括赖氨酰基和脯氨酰羟基酶，如 Plod 和 PH4αEFB20、22、23、24、25、26。这些翻译后酶调节Col IV的ER分选，因为每个酶的丢失导致Coll IV被困在基础ER20，23，24，25，26中。然后，新合成的Colli IV在COPII涂层囊泡中退出高尔基体的ER。货物受体Tango1有助于将胶原蛋白包装成可观的高尔基体结合囊泡，该囊泡可以容纳大型多聚体蛋白质20，27。一旦将Coliv包装成细胞内胞囊泡，它就会从上皮细胞特异性地分泌基底。为了将BM沉积引导到基底侧，上皮细胞需要另一组专门用于极化BM分泌的因子。使用果蝇卵巢的FE，已经表征了这种新型细胞过程的一些组分，包括核苷酸交换因子（GEFs）岩壁和地层，GTPases Rab8和Rab10，以及磷酸肌醇PI（4，5）P2和激肽1和3运动蛋白20，28，29，30，31的水平.这些成分对于确保BM蛋白的极化分布至关重要。
为了监测FE中BM蛋白的细胞内定位，可以使用内源性标记的基底膜蛋白（蛋白质陷阱），例如维京-GFP（Vkg-GFP或α2 Coll IV-GFP）和珍珠-GFP（Pcan-GFP）32，33。这些蛋白质陷阱谱系已被证明可以准确反映BM蛋白的内源性分布，并允许更灵敏地检测水泡运输28，30。首先使用Vkg-GFP和Pcan-GFP 20，28，29，30的蛋白质陷阱线表征了FE中BM极化沉积所涉及的组分。蛋白质陷阱可用于不同的遗传背景，包括突变体和Gal4系34。此外，蛋白质捕集器可以与荧光染料和/或荧光免疫染色结合使用，从而在比较野生型和突变条件35时精确表征BM蛋白的定位。
为了准确有效地评估含BM蛋白囊泡的分布和定位，共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）和超分辨率成像技术对其他成像方法具有显着优势。这些方法将高分辨率成像与相对易用性相结合。CLSM是一种显微镜技术，通过使用振镜以光栅扫描方式用激光扫描样品来提高光学分辨率。针孔孔径是共聚焦显微镜的核心部件。通过阻挡来自焦平面上方或下方的失焦信号，针孔孔径可在z轴36中产生非常优越的分辨率。这也使得在z平面中获得一系列图像成为可能，称为z-stack，对应于一系列光学截面。z-stack随后在成像软件的帮助下， 通过 3D重建创建标本的3D图像。与共聚焦显微镜不同，传统的落射荧光（宽视场）显微镜允许失焦光有助于提高图像质量，从而降低图像分辨率和对比度36，37。这使得落射荧光显微镜在研究蛋白质定位或共定位时不太有吸引力。
虽然CLSM是各种应用的合适方法，包括BM蛋白细胞内运输的成像和表征，但当对低于阿贝的光衍射极限（200-250nm）的样品进行成像时，它仍然存在问题。当对此类样品进行成像时，共聚焦显微镜，特别是在使用油物镜时，可以产生高分辨率。然而，超分辨率技术超越了共聚焦显微镜的极限。有多种方法可以实现超分辨率显微镜，每种方法都有特定的分辨率限制，并且每种方法都适用于不同的分析。这些方法包括光活化定位显微镜（PALM）或随机光学重建显微镜（STORM），受激发射耗尽显微镜（STED），结构化照明显微镜（SIM）和Airyscan（超分辨率）显微镜38，39，40，41，42，43，44，45，46.虽然艾瑞斯堪的分辨率比PALM/风暴、STED和SIM更粗糙，但它仍然可以达到高达~120纳米的分辨率（大约是CLSM分辨率的两倍）。此外，这种超分辨率显微镜方法已被证明在对厚样品和信噪比为47，48的低样品进行成像时比SIM和其他超分辨率技术具有优势。
艾利斯扫描是一种相对较新的超分辨率共聚焦显微镜技术46。与传统的CLSM不同，传统CLSM使用针孔和单点检测器来抑制失焦光，这种超分辨率方法使用32通道砷化镓磷化物（GaAsP）光电倍增管区域检测器，收集每个扫描位置45的所有光。32 个探测器中的每一个都作为一个小针孔工作，将针孔尺寸从传统的 1.0 Airy 单元 （A.U.） 减小到增强的 0.2 A.U.，从而实现更高的分辨率和信噪比，同时保持 1.25 A.U. 直径45 的效率。此外，Airyscan 使用的线性反卷积可使分辨率45 提高多达 2 倍。考虑到这一点，CLSM，特别是超分辨率显微镜，非常适合研究BM蛋白和调节BM蛋白基础沉积的蛋白质，因为它们可以产生非常高分辨率的图像用于定位和共定位研究，从而为控制这些过程的空间，时间和分子事件提供新的见解。
可用于执行定位实验的共聚焦显微镜的另一种方法是图像反卷积。由于宽视场显微镜允许失焦光到达探测器，因此可以应用数学和计算反卷积算法从宽视场显微镜获得的图像中去除或重新分配失焦光，从而提高图像49的分辨率和对比度。反卷积算法还可以应用于共聚焦图像，以进一步提高分辨率和对比度，从而产生几乎与超分辨率显微镜50相当的最终图像。Airyscan利用基于韦纳滤波器的反卷积以及谢泼德的像素重新分配，从而大大提高了空间分辨率和信噪比。与共聚焦显微镜相比，当使用这种超分辨率显微镜技术45，51时，在所有三个空间维度（x和y中为120nm，z中为350nm）的分辨率提高了2倍。
该手稿提供了详细和优化的方案，以染色，获取和可视化BM蛋白的细胞内运输和沉积，使用 果蝇 卵巢的FE作为模型系统，结合共聚焦和超分辨率显微镜。表达内源性标记基底膜蛋白（例如 Vkg-GFP 和 Pcan-GFP）的 果蝇 谱系是可视化 BM 蛋白运输和分泌的有效且准确的工具。此外，它们可以很容易地用于不同的遗传背景，包括突变体和 Gal4 / UAS 系34。虽然推荐使用内源性标记的基底膜蛋白，但针对特定BM蛋白的抗体的使用也与所述方案相容。这些方案对于有兴趣使用共聚焦和超分辨率成像研究细胞内运输和完整上皮组织中BM蛋白分泌的科学家特别有用。此外，将上皮组织分析与 果蝇 遗传学的扩展工具相结合的能力使这种方法特别强大。最后，这些方案可以很容易地适应研究水泡运输和其他感兴趣蛋白质的分选。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A22283</td>
			<td>F-Actin Stain (1/500 of 66&#181;M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A22287</td>
			<td>F-Actin Stain (1/100 of 66&#181;M))</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GM130 Antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab30637</td>
			<td>For Golgi Stain (colocalization); use as concentration of 7&#181;g/uL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua-Polymount</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>1860620</td>
			<td>Mounting Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bakers Yeast (Active Dry Yeast)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>62-103</td>
			<td>To fatten the overies for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (30% solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7284</td>
			<td>For blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depression wells</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>7156101</td>
			<td>For dissection (glass concavity slide can be used instead)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting needle</td>
			<td>Fisher scientifc</td>
			<td>13-820-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Incubator</td>
			<td>Genesee Scientific/Invictus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stock: Perlecan-GFP Drosophila line (ZCL1700)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Morin et al., 2001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stock: UAS-Crag RNAi line (TRIP line HMS00241)</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>33594</td>
			<td>RNAi against Crag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stock: Viking-GFP Drosophila line (CC00791)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Buszczak et al., 2007</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stock: Vkg-GFP, tj-Gal4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Devergne et al., 2017. Drive the expression of Crag RNAi in the FE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (Dumont 5)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td>For dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Concavity Slide</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>7187804</td>
			<td>For dissection (depression wells can be used instead)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11036</td>
			<td>Secondary antibody (GM130 antibody) (5 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst (Hoechst 33342)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>DNA Stain (1 ug/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>Fisher Scientific: 06-666</td>
			<td>Delicate task wipers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Fluorescent Stereo Microscope&#160; M165 FC</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>For ovary imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Corning</td>
			<td>294875X25</td>
			<td>Microscope Slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutating platform rocker</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>6720</td>
			<td>For ovary fixation and staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutri-Fly BF</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>66-121</td>
			<td>Fly Food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 20% Solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Fisher Scientific: 15713</td>
			<td>For PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline Tablets</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP2944100</td>
			<td>For PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Glass Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36980</td>
			<td>Mounting Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Cover Glass</td>
			<td>Corning</td>
			<td>285022</td>
			<td>Cover glass for microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton x-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9036-19-5</td>
			<td>For PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 900 with Airyscan 2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Confocal and super-resolution Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Stemi 305 Stereo Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Dissecting microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Zen Software version 3.3 (Blue Edition)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Image acquisition and processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

confocal and super-resolution imaging of polarized intracellular trafficking and secretion of basement membrane proteins during drosophila oogenesis

基底膜（BM） - 存在于上皮细胞基底侧的细胞外基质的特化片 - 对于上皮组织形态和器官形态的建立和维持至关重要。此外，BM对于组织建模至关重要，可作为信号平台，并提供外力来塑造组织和器官。尽管BM在正常发育和病理条件下发挥了许多重要作用，但控制含BM囊泡细胞内运输的生物学途径以及基础分泌如何导致BM蛋白极化沉积的生物学途径知之甚少。 果蝇 卵巢的滤泡上皮是研究BM膜蛋白基础沉积的优秀模型系统，因为它产生并分泌BM的所有主要成分。本文介绍了一种详细的方案，用于在 果蝇 卵巢的滤泡上皮中使用内源性标记的蛋白质对含BM的囊泡和沉积的BM进行染色和成像。该协议可用于解决定性和定量问题，其开发是为了适应高通量筛选，从而可以快速有效地鉴定上皮组织发育过程中极化细胞内运输和囊泡分泌所涉及的因素。

本文描述的方法可用于有效和准确地成像和表征极化上皮细胞中BM蛋白的细胞内运输和分泌，例如 果蝇 卵巢的FE。接下来，我们提供使用所述方法获得的预期结果，以及有用的建议和潜在的陷阱。为此，使用内源性标记的Vkg（果蝇 Col IV）的Vkg-GFP。然而，其他内源性标记的BM蛋白（如Pcan-GFP）可以达到相同的结果。
设置最佳采集参数（...

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Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

基底膜对于发育过程中的组织和器官形态发生至关重要。为了更好地理解导致该结构正确放置的机制，所提出的方案描述了使用共聚焦和超分辨率显微镜可视化和表征上皮细胞中基底膜蛋白的细胞内运输和分泌的方法。

果蝇卵生过程中极化细胞内运输和基底膜蛋白分泌的共聚焦和超分辨率成像

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment ...

该协议允许使用果蝇阵列作为模型系统来表征基底膜蛋白的细胞内运输和分泌。我们技术的主要优点是，它允许使用内源性标记蛋白和Airyscan超分辨率显微镜对基底膜蛋白的细胞内运输进行高分辨率成像。虽然该方案是为基底膜蛋白的细胞内运输成像而开发的，但它可以扩展到研究其他感兴趣的蛋白质和其他生物系统（包括细胞培养物和类器官）的运输。首先，在解剖镜下解剖PBS中的果蝇卵巢后，加入一毫升固定液并将卵巢固定在坚果平台上15分钟。取出固定溶液并进行两次快速洗涤，每次用一毫升PBST。通过轻轻地反转微量离心管五到六次，然后在螺母平台摇臂上进行四次10分钟的长洗涤，每次使用一毫升PBST。进行固定和洗涤后，除去PBST，然后加入一毫升封闭溶液，并将卵巢阻挡在螺母平台摇杆上至少一小时。接下来，取出封闭溶液并加入300微升一抗溶液，含有在封闭溶液中以适当浓度稀释的一抗。在4摄氏度的螺母平台摇杆上孵育过夜。除去一抗溶液后，如前所述，进行两次快速洗涤和四次长洗涤，然后除去PBST并加入500微升含有荧光二抗的二抗溶液，这些二抗将检测所使用的一抗。在室温下将卵巢在螺母平台摇臂上的二抗溶液中孵育两小时，然后在PBST中进行两次快速洗涤和四次长洗涤，如先前在螺母平台摇杆上所示。最后一次洗涤后，使用P-1000移液管轻轻地在管中上下移液卵巢以分离卵室。通过将卵管保持在直立位置5至10分钟，让卵室沉入底部。接下来，使用巴斯德移液器除去PBST，留下约50微升。之后，使用P-200移液器尽可能多地去除剩余的PBST，并加入两滴安装培养基，足以均匀地铺在盖玻片上。为了便于将粘性安装介质从微量离心管转移到载玻片上，请切断 P-200 移液器吸头的末端。接下来，将安装介质中的所有卵室慢慢转移到载玻片上，确保不会产生气泡。在解剖显微镜下，使用新的P-200移液器尖端或镊子轻轻展开镶样介质和分离的卵室，以覆盖大约盖玻片大小的区域。使用镊子，小心地将盖玻片以一定角度放在卵室上以避免产生气泡，并将载玻片在室温下存放在黑暗中的平坦表面上两天以进行聚合。一旦安装介质固化，载玻片就可以在4摄氏度的黑暗中储存几周以进行成像。为了可视化基底膜蛋白的细胞内定位，将物镜设置为63x并轻轻地在其晶状体上放置一滴浸润油，然后将载玻片放在物镜上，盖玻片朝向物镜以定位标本。使用落射荧光显微镜的目镜定位感兴趣的区域，然后选择具有适当设置的配置，以便对荧光团进行成像，如手稿中所述。设置配置后，通过在采集模式下选择实时来对样品进行成像，并将变焦调整为2到4倍，以优化样品的扫描区域。对于每个单独的频道，请在频道下选择一个轨道，然后单击直播。使用量程指示器工具调整主增益和激光功率，并遵循所有准则以避免稿件中所述的饱和像素，同时对每个通道重复相同的像素。在采集模式切换窗口中的图像尺寸下，单击 SR 以最大化探测器的功能并自动调整帧尺寸。在Airyscan模式下将平均值保持为“无”，因为通常没有必要，并且会减少扫描时间。但是，在某些情况下，平均2倍可能会提高信噪比，然后单击Snap以获取图像。要获取 Z 轴堆栈，请单击“获取”选项卡下的“Z 堆栈”复选框。接下来，选择所需的通道来观察试样。例如，DAPI通道并单击“实时”开始实时扫描，然后使用显微镜上的微调旋钮设置Z-stack的范围。然后，通过单击先设置和最后设置来设置 Z 堆栈的端点。为了获得最佳的3D重建，将Z堆栈的间隔设置为小于0.5微米以分配步长，然后单击“开始实验”以开始Z堆栈采集。获得图像或 Z 堆栈后，单击“处理”，然后单击“方法”选项，然后选择“Airyscan 处理”。执行自动过滤器以启动，如果需要，通过更改超分辨率值来执行进一步的手动处理，以获得样品的最佳结果。确定最佳 SR 值后，单击“应用”以生成已处理的图像。对于 Z 轴堆栈图像，通过单击“3D 处理”框，将处理为一个 Z 切片或整个 Z-堆栈。要在采集Z-stack后以3D形式可视化蛋白质运输，请通过单击预览窗口中的3D图标生成3D图像，该图标将显示在Airyscan处理图像的显示控制部分中。从不同的 3D 视图选项中，在查看囊泡结构时使用“表面”或“混合”视图。要获得最高质量的图像，请选择“精确”设置，因为“最快”设置的精度会降低，并导致 3D 渲染效果不佳。生成图像后，通过缩放和旋转来操作 3D 图像，以聚焦在首选位置。获得视图后，在3D选项卡下，选择“显示的分辨率”，然后单击“创建图像”，这将以与查看图像相同的方向创建图像的快照，并且可以以各种文件格式保存和导出。当采集参数优化时，共聚焦显微镜可用于可视化基底膜蛋白（如Viking-GFP）的细胞内定位和沉积。当正确执行采集和图像处理时，与共聚焦显微镜相比，超分辨率显微镜可提高图像分辨率。正如基底膜蛋白（如Viking）的细胞内运输中更清晰的图像所示。正交投影允许使用共聚焦或超分辨率成像在单个图像中可视化包含基底膜蛋白的囊泡和隔室的整体分布。通过组装通过共聚焦或超分辨率成像拍摄的一堆光学Z切片进行3D重建，以评估细胞内基底膜蛋白的定位和分布。超分辨率成像可用于确定突变条件下基底膜蛋白的精确定位。例如，在Crag敲低上皮细胞中，基底膜蛋白在顶端和基底积聚，表明它控制基底膜蛋白的极化分泌。共聚焦和超分辨率显微镜也可以用于共定位实验。例如，该图显示了维京-GFP和高尔基体标记GM-130的部分共定位，证实了维京人在分泌之前被分类到高尔基体。为了使用超分辨率显微镜有效地对基底膜蛋白的运输进行成像，我们建议仔细安装卵巢，并在设置采集和卷积参数时特别注意。该方案经过优化，可可视化基底膜蛋白的细胞内运输和分泌。然而，可以很容易地对其进行修饰，以有效地对其他感兴趣的蛋白质的运输进行成像。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

住发展拟南芥花的共焦成像

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

科研

发育生物学

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

C. 线虫排泄管作为细胞内腔形态发生和体内极化膜生物在单个细胞中的模型: GFP-融合、rna 干扰界面和成像的标记

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

斑马鱼视网膜蛋白定位的相关超分辨和电镜观察

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

活体果蝇卵巢组织中卵泡干细胞谱系的细胞内 pH 值的成像方法

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

有丝分裂过程中染色体分离的活体细胞成像

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Analysis of Epididymal Protein Synthesis and Secretion

附睾蛋白的合成与分泌分析

The mammalian epididymis generates one of the most complex intraluminal fluids of any endocrine gland in order to support the post-testicular maturation ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

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解冻、培养和冷冻保存的嗜酸性粒细胞系

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

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普帕尔阶段发育性皮瘤中组织定向和生长动力学的成像与分析

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

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可视化 果蝇 胚胎中含脂质细胞器的细胞骨架依赖性运输

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of ...

Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging

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使用扩增显微镜物理放大 整个果蝇 胚胎以进行超分辨率成像

The workhorse of developmental biology is the confocal microscope, which allows researchers to determine the three-dimensional localization of tagged ...