Name: confocal and super-resolution imaging of polarized intracellular trafficking and secretion of basement membrane proteins during drosophila oogenesis
Uploaded: 2022-05-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis at JoVE.c

המחברים מודים לג'ולי מרקל על הערותיה המועילות על כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH R15GM137236 ל- O.D. התמונות הקונפוקליות והסופר-רזולוציה נרכשו באמצעות Zeiss LSM 900 עם Airyscan 2, שנרכשה במענק NSF MRI 2018748.

1. הכנת זבובים לניתוחי שחלה
<ol><li>שים 10-15 נקבות נקבות דרוזופילה מלנוגסטר (בנות 1-2 ימים) של הגנוטיפ הרצוי בבקבוקון צר המכיל כ-8 מ"ל של מדיום זבוב דרוזופילה מפוזר עם כמות קטנה של שמרי אופה מגורענים 2-3 ימים לפני הנתיחה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס. הוספת כמה זכרים לבקבוקון יכולה...

ה-BM חיוני למורפוגנזה עוברית ואיברית, ולתפקודים פיזיולוגיים של מבוגרים. יתר על כן, BM פועל כפלטפורמה איתות לביסוס ותחזוקה של קוטביות אפיתל ומספק לרקמות תמיכה2. עם זאת, המנגנונים המווסתים את המיקום הנכון של חלבוני BM אינם מובנים היטב. הבנה טובה יותר של המסלולים הביולוגיים המוקדשי?...

קרום המרתף (BM) הוא יריעה דקה של מטריצה חוץ-תאית דביקה של תאים מרובדים (ECM) הקריטית למבנה אפיתל ולמורפוגנזה1. הוא מכיל כ-50 חלבונים ונמצא בכל מקום ביסוד תאי האפיתל והאנדותל, ומעורר תא שלד, חלק ושריר לב ואדיפוציטים 1,2,3. שלושת המרכיבים העיקריים של ה-BM בצד הבסיסי של תאי האפיתל הם קולגן IV, פרלקן ולמינינים. ה-BM עומד בבסיס תאי האפיתל ואחראי על תפקודים רבים, כולל הפרדת רקמות ומחסום, גדילה ותמיכה, וקיטוב תאים 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . תפקידה כפלטפורמת איתות מווסת את המורפולוגיה וההתמיינות של תאי אפיתל ורקמות במהלך ההתפתחות 3,13,14. יתר על כן, ויסות שגוי של ה- BM ו / או הפרה בשלמותו הם הגורמים העיקריים למצבים פתולוגיים רבים, כולל גרורות גידול 2,15,16. למרות הפונקציות החיוניות המבוצעות על ידי BM במהלך מורפוגנזה של רקמות ואיברים, מרכיבי המסלולים הביולוגיים המוקדשים לסחר תוך-תאי מקוטב ולהפרשה של חלבוני BM ידועים במעורפל.
כדי לחקור את הסחר התוך-תאי של בועיות המכילות BM ואת הפרשת חלבוני BM על ידי תאי אפיתל, האפיתל הזקיקי (FE) של שחלת דרוזופילה הוא מערכת מודל רבת עוצמה (איור 1). שחלת דרוזופילה מורכבת מ-16-20 מבנים ארוכים דמויי צינור, הנקראים אובריולים (איור 1A,B)17,18,19. ניתן לחשוב על כל שחלות כפס ייצור של ביצים, עם התקדמות הגיל של תאי הביצה (שכל אחד מהם מוליד ביצה) שמתחיל בקצה הקדמי ונע לאחור, עד שהביצה הבוגרת יוצאת דרך האובידוקט. כל תא ביצית עטוף על ידי ה-FE, חד-שכבתי של תאי זקיק סומטיים (FCs), המקיף את תאי הנבט המרכזיים (GCs). ה-FE מקוטב מאוד עם קוטביות אפית-בסיסית מובהקת שבה התחום האפיקלי פונה אל הנבט, וחלבוני ה-BM מופרשים באופן בסיסי18,19. ה-FCs מפרישים באופן פעיל את כל המרכיבים העיקריים של ה-BM, כולל קולגן IV, פרלקן ולמינינים 20,21. בתאי אפיתל כגון FCs, רכיבי ה-BM מיוצרים ודורשים מסלול הפרשה מקוטב מיוחד עבור התצהיר שלהם חוץ-תאי. לדוגמה, במקרה של המרכיב הנפוץ ביותר של BM, קולגן IV (Coll IV), הפרטים סביב הסחר וההפרשה התוך-תאיים המקוטבים שלו מעורפלים למרות שהייצור והתצהיר שלו הם המוקד של מחקרים רבים. קול IV מתורגם ברשתית האנדופלסמית (ER), שבה כל פיבריל - המורכב משלושה פוליפפטידים (שתי שרשראות α1 ושרשרת α2 אחת) - מורכב לסליל משולש22. קיפול תקין של Coll IV ותפקוד דורשים מלווים ואנזימים של ER, כולל ליזיל ופרוליל-הידרוקסילאזות כגון Plod ו-PH4αEFB 20,22,23,24,25,26. אנזימים פוסט-טרנסלציוניים אלה מווסתים את מיון ה-ER של קול IV, שכן האובדן של כל אחד מהם גורם ל-Coll IV להילכד ב-ER הבסיסי 20,23,24,25,26. לאחר מכן, הקולג' הרביעי המסונתז החדש יוצא מהמיון עבור הגולגי בשלפוחיות מצופות COPII. קולטן המטען Tango1 מסייע באריזת קולגן לתוך שלפוחיות גדולות הקשורות לגולגי שיכולות להכיל חלבונים רב-חומריים גדולים20,27. ברגע ש-Coll IV נארז לתוך שלפוחיות אקסוציטיות תוך-תאיות, הוא מופרש באופן ספציפי באופן בסיסי מתאי אפיתל. כדי לכוון את תצהיר BM לצד הבסיסי, תאי אפיתל דורשים קבוצה נוספת של גורמים המוקדשים במיוחד להפרשת BM מקוטבת. באמצעות ה-FE של שחלת דרוזופילה, אופיינו כמה מרכיבים של התהליך התאי החדש הזה, כולל גורמי חילופי הנוקלאוטידים (GEFs) Crag ו-Stratum, ה-GTPases Rab8 ו-Rab10, כמו גם הרמות של הפוספונינוסיטיד PI(4,5)P2, ו-Kinesin 1 ו-3 חלבונים מוטוריים 20,28,29,30,31 . רכיבים אלה חיוניים להבטחת ההתפלגות המקוטבת של חלבוני BM.
כדי לנטר את הלוקליזציה התוך-תאית של חלבוני BM ב-FE, חלבוני קרום מרתף המתויגים באופן אנדוגני (מלכודות חלבון), כגון Viking-GFP (Vkg-GFP או α2 Coll IV-GFP) ו-Perlecan-GFP (Pcan-GFP) יכולים לשמש32,33. הודגם כי קווי מלכודת חלבונים אלה משקפים במדויק את ההתפלגות האנדוגנית של חלבוני BM ומאפשרים זיהוי רגיש יותר של סחרבשלפוחית 28,30. הרכיבים המעורבים בתצהיר המקוטב של BM ב-FE אופיינו לראשונה באמצעות קווי מלכודת חלבונים עבור Vkg-GFP ו-Pcan-GFP 20,28,29,30. ניתן להשתמש במלכודות חלבונים ברקעים גנטיים שונים, כולל מוטנטים וקווי Gal4 34. יתר על כן, ניתן להשתמש במלכודות חלבונים בשילוב עם צבעים פלואורסצנטיים ו/או חיסון פלואורסצנטי, מה שמאפשר אפיון מדויק של לוקליזציה של חלבוני BM כאשר משווים בין תנאים מסוג בר ומוטנטים35.
כדי להעריך באופן מדויק ויעיל את ההתפלגות והלוקליזציה של שלפוחיות המכילות חלבון BM, מיקרוסקופיה לסריקת לייזר קונפוקלית (CLSM) וטכניקות הדמיה ברזולוציה גבוהה במיוחד מהוות יתרון משמעותי לגישות הדמיה אחרות. גישות אלה משלבות הדמיה ברזולוציה גבוהה עם קלות שימוש יחסית. CLSM היא טכניקת מיקרוסקופיה המאפשרת רזולוציה אופטית משופרת על ידי סריקת הדגימה באמצעות לייזר באופן סריקת רסטר באמצעות גלוונומטרים. מפתח הצמצם של חור הפין הוא מרכיב מרכזי במיקרוסקופ קונפוקלי. על-ידי חסימת האותות מחוץ למיקוד המגיעים מעל או מתחת למישור המוקד, מפתח הצמצם של חור הפין מוביל לרזולוציה מעולה ביותר בציר z36. זה גם מאפשר לקבל סדרה של תמונות במישור z, הנקרא z-stack, המתאים לסדרה של קטעים אופטיים. z-stacks יוצרים לאחר מכן תמונה תלת-ממדית של הדגימה, באמצעות שחזור תלת-ממדי, בעזרת תוכנת הדמיה. מיקרוסקופים אפיפלואורסצנטיים קונבנציונליים (שדה רחב), בניגוד למיקרוסקופים קונפוקליים, מאפשרים לאור מחוץ למיקוד לתרום לאיכות התמונה, ובכך להקטין את רזולוציית התמונה ואת הניגודיות36,37. זה הופך את מיקרוסקופיית האפיפלואורסצנציה למועמדת פחות אטרקטיבית כאשר חוקרים לוקליזציה של חלבונים או קולוקליזציה.
למרות ש-CLSM היא גישה מתאימה ליישומים שונים, כולל הדמיה ואפיון של הסחר התוך-תאי בחלבוני BM, היא עדיין מהווה בעיה בעת הדמיה של דגימות מתחת לגבול עקיפת האור של Abbe (200-250 ננומטר). בעת הדמיה של דגימות כאלה, מיקרוסקופיה קונפוקלית, במיוחד בעת שימוש במטרת שמן, יכולה לגרום לרזולוציה גבוהה. עם זאת, טכניקות סופר-רזולוציה עוברות את הגבול של מיקרוסקופיה קונפוקלית. ישנן גישות שונות להשגת מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה במיוחד, שלכל אחת מהן מגבלות רזולוציה ספציפיות, וכל אחת מהן מתאימה לניתוחים שונים. גישות אלה כוללות מיקרוסקופיית לוקליזציה פוטואקטיבית (PALM) או מיקרוסקופ שחזור אופטי סטוכסטי (STORM), מיקרוסקופיית דלדול פליטה מגורה (STED), מיקרוסקופיית תאורה מובנית (SIM) ומיקרוסקופיה אווירית (סופר-רזולוציה) 38,39,40,41,42,43,44,45,46 . למרות של-Airyscan יש רזולוציה גסה יותר מאשר PALM/STORM, STED ו-SIM, הוא עדיין יכול להשיג רזולוציה של עד ~120 ננומטר (בערך פי שניים מהרזולוציה של CLSM). יתר על כן, הודגם כי לגישת מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה זו יש יתרון על פני SIM וטכניקות אחרות ברזולוציית-על בעת הדמיית דגימות ודגימות עבות עם יחס אות לרעש נמוך47,48.
Airyscan היא טכנולוגיית מיקרוסקופיה קונפוקלית חדשה יחסית ברזולוציה גבוההיחסית 46. בניגוד ל-CLSMs מסורתיים, המשתמשים ב-pinhole ובגלאי נקודה בודדת כדי לדחות אור מחוץ למיקוד, גישה זו של רזולוציית-על משתמשת בגלאי שטח שפופרת פוטומולטיפלייר (GaAsP) בעל 32 ערוצים של גליום ארסניד פוספיד (GaAsP) שאוסף את כל האור בכל מיקום סריקה45. כל אחד מ-32 הגלאים פועל כחור סיכה קטן, ומקטין את גודל חור הפין מיחידת ה-1.0 Airy Unit המסורתית (A.U.) ל-0.2 A.U. משופרת, מה שמאפשר רזולוציה גבוהה עוד יותר ויחס אות לרעש, תוך שמירה על היעילות של קוטר45 של 1.25 A.U. יתר על כן, הדה-קונבולוציה הליניארית המשמשת את Airyscan גורמת לעלייה של עד פי 2 ברזולוציה45. בהתחשב בכך, CLSM, ובמיוחד מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה במיוחד, מתאימים היטב לחקר חלבוני BM וחלבונים המווסתים את התצהיר הבסיסי של חלבוני BM, מכיוון שהם יכולים לייצר תמונות ברזולוציה גבוהה מאוד למחקרי לוקליזציה וקולוקליזציה, ובכך לספק תובנות חדשות באירועים המרחביים, הזמניים והמולקולריים השולטים בתהליכים אלה.
גישה חלופית למיקרוסקופיה קונפוקלית שניתן להשתמש בה כדי לבצע ניסויי לוקליזציה היא דה-קונבולוציה של תמונות. מאחר שמיקרוסקופיית שדה רחב מאפשרת לאור מחוץ למיקוד להגיע לגלאים, ניתן ליישם אלגוריתמים מתמטיים וחישוביים של דקונבולוציה כדי להסיר או להקצות מחדש אור מחוץ למיקוד מתמונות המתקבלות על ידי מיקרוסקופיה בשדה רחב, ובכך לשפר את הרזולוציה והניגודיות של התמונה49. ניתן ליישם אלגוריתמים של Deconvolution גם על תמונות קונפוקליות כדי להגדיל עוד יותר את הרזולוציה והניגודיות, ולהפיק תמונות סופיות כמעט דומות לאלה של מיקרוסקופיה סופר-רזולוציה50. Airyscan עושה שימוש בפירוק מבוסס מסנן ויינר יחד עם הקצאת הפיקסלים מחדש של שפרד, וכתוצאה מכך רזולוציה מרחבית ויחס אות לרעש משופרים ביותר. בהשוואה למיקרוסקופיה קונפוקלית, נצפתה עלייה של פי 2 ברזולוציה בכל שלושת הממדים המרחביים (120 ננומטר ב-x וב-y, ו-350 ננומטר ב-z) בעת שימוש בטכניקת מיקרוסקופיה סופר-רזולוציה זו45,51.
כתב יד זה מספק פרוטוקולים מפורטים וממוטבים לצביעה, רכישה והדגמה של סחר ותצהיר תוך-תאיים של חלבוני BM תוך שימוש ב-FE של שחלת דרוזופילה כמערכת מודל בשילוב עם מיקרוסקופיה קונפוקלית וסופר-רזולוציה. קווי דרוזופילה המבטאים חלבוני ממברנת מרתף המתויגים באופן אנדוגני, למשל Vkg-GFP ו-Pcan-GFP, הם כלים יעילים ומדויקים להמחשת סחר והפרשת חלבוני BM. בנוסף, ניתן להשתמש בהם בקלות ברקעים גנטיים שונים, כולל מוטציה וקווי Gal4/UAS 34. למרות שמומלץ להשתמש בחלבוני ממברנת מרתף המתויגים באופן אנדוגני, השימוש בנוגדנים נגד חלבוני BM ספציפיים תואם גם את הפרוטוקולים המתוארים. פרוטוקולים אלה שימושיים במיוחד עבור מדענים המעוניינים לחקור סחר תוך-תאי ואת הפרשת חלבוני BM ברקמת אפיתל שלמה באמצעות הדמיה קונפוקלית וסופר-רזולוציה. יתר על כן, היכולת לשלב ניתוח רקמת אפיתל עם הכלים הנרחבים של הגנטיקה של Drosophila הופכת את הגישה הזו לחזקה במיוחד. לבסוף, פרוטוקולים אלה יכולים להיות מותאמים בקלות לחקר סחר בווסקולרי ומיון של חלבונים אחרים בעלי עניין.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A22283</td>
			<td>F-Actin Stain (1/500 of 66&#181;M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A22287</td>
			<td>F-Actin Stain (1/100 of 66&#181;M))</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GM130 Antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab30637</td>
			<td>For Golgi Stain (colocalization); use as concentration of 7&#181;g/uL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua-Polymount</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>1860620</td>
			<td>Mounting Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bakers Yeast (Active Dry Yeast)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>62-103</td>
			<td>To fatten the overies for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (30% solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7284</td>
			<td>For blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depression wells</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>7156101</td>
			<td>For dissection (glass concavity slide can be used instead)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting needle</td>
			<td>Fisher scientifc</td>
			<td>13-820-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Incubator</td>
			<td>Genesee Scientific/Invictus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stock: Perlecan-GFP Drosophila line (ZCL1700)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Morin et al., 2001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stock: UAS-Crag RNAi line (TRIP line HMS00241)</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>33594</td>
			<td>RNAi against Crag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stock: Viking-GFP Drosophila line (CC00791)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Buszczak et al., 2007</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stock: Vkg-GFP, tj-Gal4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Devergne et al., 2017. Drive the expression of Crag RNAi in the FE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (Dumont 5)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td>For dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Concavity Slide</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>7187804</td>
			<td>For dissection (depression wells can be used instead)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11036</td>
			<td>Secondary antibody (GM130 antibody) (5 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst (Hoechst 33342)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>DNA Stain (1 ug/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>Fisher Scientific: 06-666</td>
			<td>Delicate task wipers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Fluorescent Stereo Microscope&#160; M165 FC</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>For ovary imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Corning</td>
			<td>294875X25</td>
			<td>Microscope Slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutating platform rocker</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>6720</td>
			<td>For ovary fixation and staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutri-Fly BF</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>66-121</td>
			<td>Fly Food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 20% Solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Fisher Scientific: 15713</td>
			<td>For PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline Tablets</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP2944100</td>
			<td>For PBS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Glass Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36980</td>
			<td>Mounting Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Cover Glass</td>
			<td>Corning</td>
			<td>285022</td>
			<td>Cover glass for microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton x-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9036-19-5</td>
			<td>For PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 900 with Airyscan 2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Confocal and super-resolution Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Stemi 305 Stereo Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Dissecting microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Zen Software version 3.3 (Blue Edition)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Image acquisition and processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

confocal and super-resolution imaging of polarized intracellular trafficking and secretion of basement membrane proteins during drosophila oogenesis

קרום המרתף (BM) - יריעה מיוחדת של מטריצה חוץ-תאית הקיימת בצד הבסיסי של תאי אפיתל - חיונית לביסוס ותחזוקה של מורפולוגיה של רקמת אפיתל ומורפוגנזה של איברים. יתר על כן, ה- BM חיוני למידול רקמות, משמש כפלטפורמת איתות, ומספק כוחות חיצוניים לעיצוב רקמות ואיברים. למרות התפקידים החשובים הרבים שה-BM ממלא במהלך ההתפתחות התקינה והתנאים הפתולוגיים, המסלולים הביולוגיים השולטים בסחר התוך-תאי של שלפוחיות המכילות BM וכיצד הפרשה בסיסית מובילה לתצהיר מקוטב של חלבוני BM אינם מובנים היטב. האפיתל הזקיק של השחלה דרוזופילה הוא מערכת מודל מצוינת לחקר התצהיר הבסיסי של חלבוני ממברנת BM, שכן הוא מייצר ומפריש את כל המרכיבים העיקריים של BM. הדמיה קונפוקלית וסופר-רזולוציה בשילוב עם עיבוד תמונה ברקמות קבועות מאפשרת זיהוי ואפיון של גורמים תאיים המעורבים במיוחד בסחר תוך תאי ובתצהיר של חלבוני BM. מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט לצביעה והדמיה של בועיות המכילות BM ו- BM מופקד באמצעות חלבונים המתויגים באופן אנדוגני באפיתל הזקיקי של שחלת דרוזופילה . פרוטוקול זה יכול להיות מיושם כדי לענות על שאלות איכותיות וכמותיות כאחד והוא פותח כדי להתאים לסינון בתפוקה גבוהה, המאפשר זיהוי מהיר ויעיל של גורמים המעורבים בסחר תוך תאי מקוטב ובהפרשה של שלפוחיות במהלך התפתחות רקמת אפיתל.

ניתן להשתמש בשיטות המתוארות כאן כדי לצלם ולאפיין ביעילות ובדייקנות את הסחר וההפרשה התוך-תאיים של חלבוני BM בתאי אפיתל מקוטבים, כגון FE של שחלת דרוזופילה . לאחר מכן, אנו מספקים תוצאות צפויות שהושגו באמצעות השיטות המתוארות, כמו גם עצות מועילות ומלכודות פוטנציאליות. כדי לעשות זאת, Vkg-GFP, Vkg מ...

Watch this Scientific Journal Video about Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis at JoVE.c

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

קרום המרתף חיוני למורפוגנזה של רקמות ואיברים במהלך ההתפתחות. כדי להבין טוב יותר את המנגנונים המובילים למיקום נכון של מבנה זה, הפרוטוקול שהוצג מתאר שיטות להמחשה ואפיון של הסחר התוך-תאי וההפרשה של חלבוני קרום המרתף בתאי אפיתל באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית וסופר-רזולוציה.

הדמיה קונפוקלית וסופר-רזולוציה של סחר תוך-תאי מקוטב והפרשת חלבוני ממברנת מרתף במהלך Drosophila Oogenesis

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment ...

פרוטוקול זה מאפשר אפיון של סחר תוך תאי והפרשת חלבוני ממברנת מרתף באמצעות מערך Drosophila כמערכת מודל. היתרון העיקרי של הטכניקה שלנו הוא שהיא מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של סחר תוך תאי של חלבוני ממברנת מרתף באמצעות חלבונים המתויגים באופן אנדוגני ומיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה של Airyscan. למרות שפרוטוקול זה פותח כדי לדמות את הסחר התוך-תאי בחלבוני ממברנת המרתף, ניתן להרחיב אותו כדי לחקור את הסחר בחלבונים אחרים בעלי עניין ומערכות ביולוגיות אחרות, כולל תרבית תאים ואורגנואידים.כדי להתחיל, לאחר ניתוח השחלות Drosophila ב- PBS תחת היקף ניתוח, להוסיף מיליליטר אחד של תמיסת קיבוע ולתקן את השחלות על פלטפורמה מתפרצת במשך 15 דקות. הסר את פתרון הקיבוע ובצע שתי שטיפות מהירות, כל אחת עם מיליליטר אחד של PBST. על ידי היפוך עדין של צינורות המיקרו-סנטריפוג חמש עד שש פעמים, ואז לבצע ארבע שטיפות ארוכות של 10 דקות כל אחת עם מיליליטר אחד של PBST על נדנדת פלטפורמה מתפרצת.לאחר ביצוע קיבוע ושטיפה, להסיר PBST, ולאחר מכן להוסיף מיליליטר אחד של תמיסת חסימה ולחסום את השחלות על נדנדת פלטפורמה אגוזים למשך שעה לפחות. לאחר מכן, הסר את תמיסת החסימה והוסף 300 מיקרוליטרים של תמיסת נוגדנים ראשונית, המכילים נוגדנים ראשוניים המדוללים בריכוזים המתאימים להם בתמיסת החסימה. דגירה למשך הלילה על נדנדת פלטפורמה מתנדנדת ב-4 מעלות צלזיוס.לאחר הסרת תמיסת הנוגדנים הראשונית, בצע שתי שטיפות מהירות וארבע שטיפות ארוכות, כפי שהוכח בעבר, ואז הסר PBST והוסף 500 מיקרוליטרים של תמיסת נוגדנים משנית המכילה נוגדנים משניים פלואורסצנטיים שיזהו את הנוגדנים העיקריים שבהם נעשה שימוש. דגירו את השחלות בתמיסת הנוגדנים המשנית על נדנדת פלטפורמה מתפרצת למשך שעתיים בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן בצעו שתי שטיפות מהירות וארבע שטיפות ארוכות ב-PBST כפי שהוכח קודם לכן על נדנדת פלטפורמה מתפרצת. לאחר הכביסה האחרונה, השתמש בפיפטה P-1000 כדי לטפטף בעדינות את השחלות למעלה ולמטה בצינור כדי להפריד את תאי הביצה.אפשרו לתאי הביצים לשקוע לקרקעית על ידי שמירה על הצינור במצב זקוף למשך חמש עד 10 דקות. לאחר מכן, הסר PBST באמצעות פיפטת פסטר, והשאר כ -50 מיקרוליטרים. לאחר מכן, הסר כמה שיותר מה- PBST הנותר באמצעות פיפטה P-200 והוסף שתי טיפות של מדיום הרכבה, מספיק כדי להתפשט באופן שווה על החלקת כיסוי.כדי לאפשר העברה קלה של מדיום ההרכבה הצמיג אל המגלשה מצינור המיקרוצנטריפוגה, חתכו את הקצה של קצה פיפטה P-200. לאחר מכן, מעבירים באיטיות את כל תאי הביצים במדיום ההרכבה לשקופית הזכוכית, ומבטיחים לא ליצור בועות. תחת מיקרוסקופ ניתוח, פרשו בעדינות את אמצעי ההרכבה והפרידו את תאי הביצים באמצעות קצה פיפטה P-200 חדש או מלקחיים כדי לכסות שטח בגודל של החלקת כיסוי בערך.בעזרת מלקחיים, הניחו בזהירות את החלקת הכיסוי על תאי הביצים בזווית כדי להימנע מבועות ואחסנו את המגלשה בטמפרטורת החדר על משטח שטוח בחושך למשך יומיים לצורך פולימריזציה. לאחר שמדיה ההרכבה נרפאה, ניתן לאחסן את המגלשה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך למשך מספר שבועות לצורך הדמיה. כדי לדמיין את הלוקליזציה התוך-תאית של חלבוני קרום המרתף, הגדר את המטרה פי 63 והנח בעדינות טיפה של שמן טבילה על העדשה שלה, ולאחר מכן מקם את המגלשה על המטרה כאשר החלקת הכיסוי פונה למטרה לאתר את הדגימה.אתר את אזור העניין באמצעות עינית של המיקרוסקופ האפיפלואורסצנטי, ולאחר מכן בחר תצורה עם הגדרות מתאימות עבור הפלואורופורים כדי לצלם כפי שמתואר בכתב היד. לאחר הגדרת התצורה, צלם את הדגימה על-ידי בחירה בשידור חי תחת מצב רכישה והתאם את הזום בין 2x ל- 4x כדי למטב את אזור הסריקה של המדגם. עבור כל ערוץ בנפרד, בחר רצועה תחת ערוץ ולחץ על שידור חי.התאם את רווח המאסטר ואת עוצמת הלייזר תוך שימוש בכלי מחוון הטווח ופעל לפי כל ההנחיות כדי להימנע מפיקסלים רוויים כמתואר בכתב היד, תוך חזרה על אותו הדבר עבור כל ערוץ. בחלון החלפת מצבי רכישה, תחת גודל תמונה, לחץ על SR כדי למקסם את יכולות הגלאי ולהתאים את גודל המסגרת באופן אוטומטי. שמור את הממוצע ל- None במצב Airyscan מכיוון שהוא בדרך כלל אינו נחוץ ויפחית את זמן הסריקה.עם זאת, במקרים מסוימים, ממוצע של פי 2 עשוי לשפר את יחס האות לרעש, ולאחר מכן לחץ על Snap כדי להשיג תמונה. כדי לרכוש מחסנית Z, לחץ על תיבת הסימון Z-Stack תחת הכרטיסייה רכישה. לאחר מכן, בחר את הערוץ הרצוי כדי לצפות בדגימה.לדוגמה, ערוץ DAPI ולחץ על Live כדי להתחיל סריקה חיה, ולאחר מכן הגדר טווח עבור מחסנית Z באמצעות ידית הכוונון העדינה במיקרוסקופ. לאחר מכן, הגדר את נקודות הקצה של מחסנית Z על-ידי לחיצה על הגדר תחילה והגדר אחרון. לשחזור תלת-ממדי אופטימלי, הגדר את המרווח עבור מחסנית Z הנמוכה מ- 0.5 מיקרומטר כדי להקצות את גודל הצעד ולחץ על התחל ניסוי כדי להתחיל ברכישת מחסנית Z.לאחר קבלת התמונות או מחסנית Z, לחץ על האפשרות עיבוד ולאחר מכן שיטה ובחר עיבוד Airyscan. בצע מסנן אוטומטי כדי להתחיל ובמידת הצורך, בצע עיבוד ידני נוסף על-ידי שינוי ערך רזולוציית העל כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר עבור המדגם. לאחר קביעת ערך ה- SR האופטימלי, לחץ על החל כדי ליצור תמונה מעובדת.במקרה של תמונות Z-stack, תעבדו כ-Z-slice אחד או כ-Z-stack כולו על-ידי לחיצה על תיבת העיבוד התלת-ממדי. כדי לדמיין את הסחר בחלבון בתלת-ממד לאחר רכישת מחסנית Z, צור תמונה תלת-ממדית על-ידי לחיצה על הסמל התלת-ממדי בחלון התצוגה המקדימה, שיופיע במקטע בקרת התצוגה של התמונה המעובדת של Airyscan. מתוך אפשרויות התצוגה התלת-ממדית השונות, השתמש בתצוגות Surface או Mixed בעת הצגת מבנה הבועיות.עבור התמונה באיכות הגבוהה ביותר, בחר את ההגדרה המדויקת כהגדרה המהירה ביותר תהיה פחות מדויקת ותוביל לעיבוד תלת-ממדי גרוע. לאחר יצירת התמונה, תפעל את התמונה התלת-ממדית על-ידי התקרבות וסיבוב כדי להתמקד במיקום מועדף. לאחר שהתצוגה הושגה, תחת הכרטיסייה 3D, בחר רזולוציה מוצגת ולאחר מכן לחץ על צור תמונה, אשר תיצור תמונת מצב של התמונה באותו כיוון שבו היא הוצגה וניתן לשמור ולייצא אותה בתבניות קובץ שונות.ניתן להשתמש במיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לדמיין את הלוקליזציה והתצהיר התוך-תאיים של חלבוני קרום מרתף כגון Viking-GFP כאשר פרמטרי הרכישה מותאמים. כאשר הרכש ועיבוד התמונה מבוצעים כראוי, מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה מגדילה את רזולוציית התמונה בהשוואה למיקרוסקופיה קונפוקלית. כפי שממחישות התמונות המוגדרות טוב יותר בסחר תוך-תאי של חלבוני קרום מרתף, כגון ויקינג.הקרנה אורתוגונלית מאפשרת הדמיה של ההתפלגות הכוללת של בועיות ותאים המכילים חלבוני קרום מרתף בתמונה אחת באמצעות הדמיה קונפוקלית או סופר-רזולוציה. שחזור תלת-ממדי על ידי הרכבת ערימה של מקטעי Z אופטיים שנלקחו על ידי הדמיה קונפוקלית או סופר-רזולוציה שימש כדי להעריך את הלוקליזציה וההפצה של חלבוני ממברנת המרתף התוך-תאית. הדמיה ברזולוציה גבוהה במיוחד יכולה לשמש לקביעת לוקליזציה מדויקת של חלבוני ממברנת מרתף בתנאים מוטנטיים.לדוגמה, בתאי אפיתל מסוג Crag knockdown, חלבוני קרום המרתף מצטברים הן באופן אפיפי והן באופן בסיסי, מה שמעיד על כך שהם שולטים בהפרשתם המקוטבת של חלבוני קרום המרתף. מיקרוסקופיה קונפוקלית וסופר-רזולוציה יכולה לשמש גם בניסויי לוקליזציה משותפת. לדוגמה, איור זה מראה את הלוקליזציה המשותפת החלקית של ויקינג-GFP וסמן גולג'י, GM-130, המאשר כי ויקינג ממוין לגולגי לפני ההפרשה.כדי לדמות ביעילות את הסחר בחלבוני ממברנת המרתף באמצעות מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה במיוחד, אנו ממליצים להרכיב בזהירות את השחלות ולקחת תשומת לב מיוחדת בעת הגדרת הרכישה ופרמטרים קונבולוציים. פרוטוקול זה מותאם כדי לדמיין את הסחר התוך-תאי ואת ההפרשה של חלבוני קרום המרתף. עם זאת, ניתן לשנות אותו בקלות כדי לדמות ביעילות את הסחר בחלבונים אחרים בעלי עניין.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

חי Confocal הדמיה של פיתוח פרחים ארבידופסיס

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

התעלה Excretory C. elegans כמודל עבור מורפוגנזה לומן תאיים ו Vivo ב מקוטב ממברנה להן בתא יחיד: תיוג על ידי התכה GFP, RNAi אינטראקציה עם המסך הדמיה

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

רזולוציה סופר correlative ואלקטרון לפתרון חלבון לוקליזציה ברשתית דג זברה

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

שיטות הדמיה תאיים pH של השושלת תאי זקיק ברקמת השחלה דרוזופילה בשידור חי

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

תא חי הדמיה של הפרדה בין כרומוזום במהלך מיטוזה

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Analysis of Epididymal Protein Synthesis and Secretion

ניתוח של סינתזת חלבונים Epididymal והפרשת

The mammalian epididymis generates one of the most complex intraluminal fluids of any endocrine gland in order to support the post-testicular maturation ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

מפשיר Culturing, Cryopreserving שורות תאים דרוזופילה

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

הדמיה וניתוח של כיוון רקמות ודינמיקה בפיתוח הדרוזולה אפיתליה במהלך שלבי pupal

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

הדמיה של סחר תלוי-שלד ציטוסקלטון של אברונים המכילים שומנים בעוברי דרוזופילה

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of ...

Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging

Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging

שימוש במיקרוסקופ הרחבה להגדלה פיזית של עוברי דרוזופילה שלמים לצורך הדמיה ברזולוציית על

The workhorse of developmental biology is the confocal microscope, which allows researchers to determine the three-dimensional localization of tagged ...